资源简介

(共87张PPT)
第1节
重组DNA技术的
基本工具
第3章 基因工程
选修三
基因工程发展历程
1944年艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物个体间转移。
1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至1966年，64个密码子均被破译成功。
1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性内切核酸酶（简称限制酶）
1972年，伯格首先在体外进行了DNA的改造，成功构建了第一个体外重组DNA分子。
1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。
1953年沃森和克里克建立DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。
1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。
20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
1973年，科学家证明了质粒可以作为基因工程的载体，并实现了物种间的基因交流。至此，基因工程正式问世。
1985年，穆里斯等人发明PCR,为获取目的基因提供了有效手段。
2019-2020年普通高等学校招生全国统一考试大纲(生物)
现代生物科技专题
知识内容 要求
6-1 基因工程
(1) 基因工程的诞生 (2) 基因工程的原理及技术(含 PCR 技术) (3) 基因工程的应用 (4) 蛋白质工程 Ⅰ
Ⅱ
Ⅱ
Ⅰ
6-2 克隆技术
(1) 植物的组织培养 (2) 动物细胞培养与体细胞克隆 (3) 细胞融合与单克隆抗体 Ⅱ
Ⅱ
Ⅱ
6-3 胚胎工程
(1) 动物胚胎发育的基本过程与胚胎工程的理论基础 (2) 胚胎干细胞的移植 (3) 胚胎工程的应用 Ⅰ
Ⅰ
Ⅱ
2019-2020年普通高等学校招生全国统一考试大纲(生物)
现代生物科技专题
知识内容 要求
6-4 生物技术的安全性和伦理问题
(1) 转基因生物的安全性 (2) 生物武器对人类的威胁 (3) 生物技术中的伦理问题 Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
6-5 生态工程
(1) 简述生态工程的原理 (2) 生态工程的实例 Ⅱ
Ⅰ
实验 要求
7-1 基因工程
(1) DNA 的粗提取与鉴定 实验与探究能力
Ⅰ.对所列知识点要知道其含义，能够在试题所给予的相对简单的情境中识别和使用它们。
Ⅱ .理解所列知识和其他相关知识之间的联系和区别，并能在较复杂的情境中综合运用其进行分析、判断、推理和评价。
考纲要求 历年年考情
(1)基因工程的诞生(l) [2017全国Ⅰ，T38(5)]
(2)基因工程的原理及技术(含PCR技术)(ll) [2017全国Ⅰ，T38(1)(2)(3)(4)]
[2017全国Ⅲ，T38(1)(2)]
(2016全国Ⅰ，T40)
(2014全国Ⅱ，T40)
[2013全国Ⅰ，T40(1)]
(3)基因工程的应用(ll) (2017全国Ⅱ，T38)
(2015全国Ⅰ，T40)
(4)蛋白质工程(l) (2015全国Ⅱ，T40)
[2013全国Ⅰ，T40(2)]
选修三 2014-2020年全国卷考察内容一览
2019全国Ⅰ卷 细胞工程
2019全国Ⅱ卷 生态工程
2019全国Ⅲ卷 基因工程、胚胎工程
2019全国Ⅰ卷 基因工程、PCR技术
2019全国Ⅱ卷 植物组织培养技术
2019全国Ⅲ卷 植物组织培养技术
2018全国Ⅰ卷 基因工程
2018全国Ⅱ卷 基因工程、PCR技术
2018全国Ⅲ卷 胚胎工程、细胞工程-核移植
2017新课标Ⅰ卷 基因工程、基因组文库
2017新课标Ⅱ卷 基因工程、cDNA文库
2017新课标Ⅲ卷 基因工程、PCR技术、细胞工程-细胞培养
2016新课标Ⅰ卷 基因工程
2016新课标Ⅱ卷 细胞工程-核移植
2016新课标Ⅲ卷 基因工程
2015新课标Ⅰ卷 基因工程-逆转录cDNA文库
2015新课标Ⅱ卷 蛋白质工程
2014新课标Ⅰ卷 细胞工程-动物细胞融合-单克隆抗体制备
2014新课标Ⅱ卷 基因工程-基因文库
基因工程
指按照人们的愿望，通过 等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的 和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA 上进行设计和施工的，因此又叫作 。
转基因
新的生物类型
分子水平
重组DNA技术
基因重组
2.操作水平：
5.操作结果：
1.操作原理：
DNA分子水平
获得新的生物类型和生物产品。
3.操作环境：
生物体外
4.操作对象：
基因
6.优点：
克服远缘杂交不亲和障碍、定向改造生物性状。
基因工程
7.操作过程
目的（外源）基因在受体细胞中为什么能表达？
剪切→拼接→导入→表达
②不同生物的基因在表达时都遵循
“中心法则”，在受体细胞内定向表达；
①不同生物的DNA分子的结构基本相同；
③所有生物共用一套遗传密码。
DNA
RNA
蛋白质
转录
翻译
复制
T
C
G
A
A
G
C
T
我国是棉花的生产和消费大国，棉花在种植过程中常常会受到棉铃虫的侵袭，使棉花大量减产，严重时甚至绝收。大量施用农药杀虫不仅提高了生产成本，还可能造成农产品和环境的污染，如果能培育出自身就能抵抗虫害的棉花新品种，就能解决这一问题。
棉花本身不具有“杀虫基因”，而苏云金杆菌有一种“杀虫基因”，它能通过编码产生抗虫蛋白来杀死棉铃虫。
棉花细胞
普通棉花
(无抗虫特征)
(含抗虫基因)
棉花植株
(有抗虫特征)
基因工程
抗虫基因
提取
苏云金芽孢杆菌
(有抗虫特征)
问题探讨
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵害。当番木瓜受到这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。
讨论：DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？
基因工程
分子手术刀
分子缝合针
分子运输车
准确切割DNA分子——限制性内切核酸酶
将DNA片段连接起来——DNA连接酶
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞——载体
8.工具
DNA的分子结构
5’
A
T
G
C
T
A
C
G
3’
5’
3’
3',5'-磷酸二酯键
反向平行
双螺旋
2
5’
3’
5’
3’
CH2
H
OH
H
H
H
H
碱基
磷酸
5’
4’
3’
2’
1’
限制性内切核酸酶
1
能识别 的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
1
切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，又称 。
限制酶
1.来源：
2.种类：
主要来自原核生物
数千种
限制酶不是一种酶，而是一类酶。
3.作用：
作用部位
双链DNA分子
4.识别序列
EcoR Ⅰ
5’…G-A-A-T-T-C…3’
3’…C-T-T-A-A-G…5’
Sma Ⅰ
5’…C-C-C-G-G-G…3’
3’…G-G-G-C-C-C…5’
BamH Ⅰ
5’…G-G-A-T-C-C…3’
3’…C-C-T-A-G-G…5’
Taq Ⅰ
5’……T-C-G-A……3’
3’……A-G-C-T……5’
限制酶所识别的序列的特点是：
呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列。
限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
1
习题巩固
1.下面哪项不具有限制酶识别序列的特征（ ）
A．GAATTC B．GGGGCCCC
CTTAAG CCCCGGGG
C．CTGCAG D．CTAAATC
GACGTC GATTTAG
D
6.切割结果
①实例1：EcoR Ⅰ 限制酶的切割
只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。
A
A
G
T
T
C
C
T
T
A
A
G
限制酶在识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端。
C
T
T
A
A
G
G
A
A
T
T
C
（1）产生黏性末端
②实例2：Sma Ⅰ 限制酶的切割
只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。
C
C
C
G
G
G
G
G
G
C
C
C
C
C
C
G
G
G
G
G
G
C
C
C
当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。
6.切割结果
（2）产生平末端
习题巩固
2.练习使用EcoR I剪切目的基因
……CTACGATGAATTCCGTAGAATTCCCTAA……
……GATGCTACTTAAGGCATCTTAAGGGATT……
……CTACGATG
……GATGCTACTTAA
AATTCCCTAA……
GGGATT……
黏性
末端
AATTCCGTAG
GGCATCTTAA
目的基因
目的基因两侧各具备一个或多个限制酶的切割位点
习题巩固
（1）要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？
可产生几个黏性末端？产生几个游离的磷酸基团？
要切两个切口，产生四个黏性末端，产生四个游离的磷酸基团。
（2）如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？
会产生 黏性末端。
（3）限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？
不能。限制酶只能识别并切开双链DNA分子。
相同的
习题巩固
（4）推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？
原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。
限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA，使之失效，从而达到保护自身的目的。
习题巩固
3.请结合右图，推断限制酶切一次可断开 个磷酸二酯键，产生 个游离的磷酸基团，消耗 分子水产生 个黏性末端。
两
2
2
两
A
A
A
T
T
T
C
T
A
G
A
T
A
T
C
G
习题巩固
4.下图甲是一个DNA片段，箭头处代表不同限制酶的切点，
据图回答：
（1）用EcoR Ⅰ 酶切，能得到 种DNA片段；
（2）用Pst Ⅰ 完全酶切，能得到 种DNA片段；
（3）同时用Sma Ⅰ 和Pst Ⅰ 完全酶切，能得到 种DNA片段；
2
3
5
习题巩固
6. 下列黏性末端最可能由同种限制酶切割而成的是( )
① -TCG ②-GA
-AGCTTAA -CTTCCA
③AATTC- 　　　 ④AGCTTC-
G-　　　　　 AG-　　
A.①② B.①③ C.①④ D.②③
B
习题巩固
7.请判断：以下黏性末端是由 种限制酶作用产生的。
①
②
③
3
5.限制酶名字的由来
限制酶的命名是根据细菌种类而定：用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。
EcoR Ⅰ：大肠杆菌（Escherichia coli）R型菌
株中分离出的第一个限制酶；
Sma Ⅰ：粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）
中分离出的第一个限制酶。
限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
1
以EcoRI为例:
E：Escherichia (属)
co：coli (种)
R：RY13 (品系)
I：首先发现 在此类细菌中发现的顺序
习题巩固
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
A
T
A
T
G
C
G
C
G
C
T
A
A
T
C
G
T
A
T
A
A
T
A
T
G
C
T
A
T
A
EcoR I
EcoR I
C
G
G
C
C
G
T
T
A
A
A
A
T
T
G
C
G
C
G
C
T
A
A
T
C
G
T
T
A
A
A
A
T
T
G
C
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
T
A
A
A
A
T
T
G
C
T
A
T
A
DNA连接酶
2
DNA连接酶——“分子缝合针”
2
1.作用
将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的 。
注意：不是连接氢键（氢键的形成不需要酶的催化）
2.种类
类型 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源
功能 只缝合__________ 缝合__________和__________
结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的____________
大肠杆菌
T4噬菌体
黏性末端
黏性末端
平末端
磷酸二酯键
磷酸二酯键
（2）T4 DNA连接酶连接平末端的效率和连接黏性末端的效率
相同。
习题巩固
1.判断以下说法是否正确：
因为黏性末端的碱基是互补的，在连接时，黏性末端可以通过碱基互补配对，加快DNA连接酶的连接速度，而平末端则不能。
（1）两个DNA片段的黏性末端必须互补才能通过DNA连接酶
连接起来。
（3）DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事。
DNA连接酶和DNA聚合酶的比较
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同点 作用实质
化学本质
不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子或DNA的一条链
形成DNA的一条链
基因工程、DNA复制
DNA复制
只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
DNA连接酶、限制酶、 DNA聚合酶、解旋酶、DNA酶的比较
项目 DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶 DNA酶
作用部位
作用对象
作用结果
磷酸二酯键
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
磷酸二酯键
磷酸二酯键
磷酸二酯键
氢键
DNA片段
DNA
单个的脱氧
核苷酸
DNA
DNA
将两个DNA片段连接成完整的DNA分子
切割双链DNA分子
将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端
将双链DNA分子局部解旋为单链
习题巩固
2.根据所学知识，完成以下填空。
①限制酶 ②解旋酶 ③DNA连接酶
④DNA聚合酶 ⑤RNA聚合酶
A. 切断a处的酶为_______
B. 连接a处的酶为_______
C. 切断b处的酶为_______
①
③④
②
a： ；b： 。
T
G
A
A
T
C
T
G
A
A
T
C
b
a
磷酸二酯键
氢键
习题巩固
3.请判断：DNA片段经限制酶处理后产生的相同黏性末端，
再经过DNA连接酶处理后，形成的新的识别序列，
能否再被所用的限制酶识别？
（1）若两个相同黏性末端都是由同种限制酶
（EcoR Ⅰ）切割后所得， （填“能”或“不能”）
再被所用的限制酶识别。
能
（2）若两个相同黏性末端是由不同限制酶切割所得，形成的新的
识别序列 （填“能”
或“不能”）再被所用的
限制酶识别。
不能
习题巩固
（1）通过基因工程产生的变异是不定向的 （　 　）
（2）限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列 （　 　）
（3）DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来 （　 　）
（4）E.coli DNA连接酶既可连接平末端，
又可连接黏性末端 （　 ）
（5）限制酶和解旋酶的作用部位相同 （ 　）
4.判断常考语句，澄清易混易错。
习题巩固
5.限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，以下说法正确的是
( 　)
A.DNA连接酶连接的是两条链碱基对之间的氢键
B.限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸
C.E.coli DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端
D.限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，
所以也能剪切自身的DNA
B
基因进入受体细胞的载体
3
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
3
1.作用
2.种类
质粒、噬菌体和动植物病毒等。
种类 用途 不同点
质粒、噬菌体
植物病毒
动物病毒
将外源基因导入大肠杆菌
等受体细胞
将外源基因导入植物细胞
将外源基因导入动物细胞
来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别
将目的基因转入受体细胞，
在受体细胞内对目的基因进行大量复制。
3.最常用的载体——质粒
一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
其基因属于细胞质基因。
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
3
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
4.载体需具备的条件
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
3
目的基因
插入位点
①有一个至多个限制酶切割位点，
便于插入目的基因；
复制原点
②在受体细胞中稳定存在并能自我复
制或整合到受体DNA上，随受体
DNA同步复制；
标记基因
③具有标记基因，便于筛选含有重组DNA
分子的细胞；
抗性基因或
荧光蛋白基因
④对受体细胞无害，不影响受体细胞正常的生命活动。
标记基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。
标记基因的筛选原理
如何提高筛选的准确性
当质粒上有两个标记基因时，可将目的基因插入其中一个标记基因中，也就是重组质粒上只含一个标记基因，普通质粒上含有两个标记基因。则没有导入质粒的受体细胞不具有标记基因控制的性状，导入普通质粒的受体细胞具有两个标记基因控制的性状，导入重组质粒的受体细胞只具有一个标记基因控制的性状。这样可根据标记基因控制的性状准确筛选出含有重组质粒的受体细胞。
氨苄青霉素抗性基因ampR
四环素抗性基因tetR
导入
受体细胞
培养
质粒
目的基因
重组质粒
氨苄青霉素抗性基因ampR
目的基因
加入氨苄青霉素
含有氨苄青霉素抗性基因并且表达的大肠杆菌才能存活并增殖
加入四环素
(1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素的载体时，如果插入某种抗生素基因内部，则会导致该抗生素基因失活。如图，目的基因插入了四环素基因内部，则四环素基因失活。
(2)被转化的细菌有三种：含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含质粒—质粒的细菌。
(3)筛选方法：将含有重组质粒的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含质粒—质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。
含有四环素抗性基因并且表达的大肠杆菌才能存活并增殖
习题巩固
1.选用下图载体将目的基因导入细菌中并将含有目的基因的细菌
筛选出来。
（1）在培养细菌的培养基中
添加抗生素B，则应该选择的限制酶为_______。
（2）在培养细菌的培养基中添加抗生素A，则应该选择的限制酶为_____。
①或②
①
习题巩固
2.现有一段DNA，含有g1、g2、g3，若要将g2提取出来，
如何操作？
g1
g2
g3
目的基因两端均含有特定序列，但目的基因内部不应含有相应序列。
思考·讨论——重组DNA分子 P73
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC…
GCCGTATG…
…TCCTAG
…AGGATCTTAA
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
AATTCCATAC…
GGTATG…
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
5′
3′
5′
3′
5′
3′
5′
3′
思考·讨论——重组DNA分子
1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？
剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。
2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对
如果不能，可能是什么原因造成的？
如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。
3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
不能。
因为基因的长度一般在100个碱基对以上。
习题巩固
用相同的限制酶切割目的基因和运载体。
产生相同末端，便于连接。
4.目的基因是要与运载体结合的，
那如何处理质粒？
★重组质粒的形成
用相同的限制酶处理目的基因和运载体，获得相同的末端，然后用DNA连接酶对其进行连接。
单酶切的缺点
用同一种限制酶或产生相同黏性末端的限制酶（同尾酶）分别切割质粒和含有目的基因的DNA片段。
a
b
c
d
a、b、c、d
四个黏性末端相同。
限制酶切割
DNA连接酶连接
启动子方向
目的基因转录方向
单酶切的缺点
a
b
c
d
限制酶切割
DNA连接酶连接
缺点1
缺点2
缺点3
反向连接重组DNA
质粒自身环化
目的基因自身环化
双酶切
用两种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段
限制酶a切割
限制酶b切割
限制酶a切割
限制酶b切割
DNA连接酶连接
a
b
c
d
黏性末端a与c相同；黏性末端b与d相同。
双酶切
限制酶a切割
限制酶b切割
限制酶a切割
限制酶b切割
DNA连接酶连接
a
b
c
d
质粒不会重新环化
目的基因不会被环化
优点1
优点2
优点3
目的基因与质粒
不会发生反向连接
确保目的基因与运载体定向连接，减少重组杂物。
CCC GGG
G A A T T C
GGG CCC
C T T A A G
GGG
G
CCC
C T T A A
目的基因
Sma Ⅰ 限制酶
双酶切
EcoR Ⅰ 限制酶
C
T
T
A
A
G
A
A
G
T
T
C
质粒
G
G
G
c
c
c
c
c
c
G
G
G
C
C
C
G
G
A
A
G
T
T
C
G
双酶切
Sma Ⅰ 限制酶
EcoR Ⅰ 限制酶
GGG
G
CCC
C T T A A
目的基因
C
C
C
G
G
A
A
G
T
T
C
G
质粒
双酶切
C
C
C
G
G
G
A
A
G
T
T
C
G
C
G
A
A
C
C
T
T
重组质粒
G
G
C
双酶切
习题巩固
4.获取目的基因和切割载体时, 通常使用同种限制酶,目的是为了
。但是使用该法缺点是容易发生
以及 ，为了避免上述情况发生，可采取的措施是
。
产生相同的黏性末端，便于连接
目的基因与质粒反向连接
目的基因、质粒的自身环化
分别使用两种限制酶去切割目的基因和运载体
习题巩固
5.下列操作中选用哪种限制酶切割构建重组DNA分子？
（注：AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因）
Hind Ⅲ和Pst Ⅰ
习题巩固
6.图甲是含有目的基因
的外源DNA片段，图乙
是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。
（1）上述操作中不宜选用Sma I，
原因是Sma I会破坏 和 。
（2）在基因工程的操作中，不宜选用EcoR I，原因是用EcoR I切割外源DNA
片段后， 。
目的基因
抗性基因
目的基因只有一侧含有黏性末端，不能插入到质粒中
选择限制酶切割位点的基本原则
①切割目的基因时： 。
②切割质粒时： 。
能切下目的基因且不破坏目的基因
至少保留一个完整的标记基因，便于筛选
习题巩固
7.某线性DNA分子含有3000个碱基对(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表所示。限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示。下列有关说法正确的是( 　)
a酶切割产物(bp) b酶再次切割产物(bp)
1600；1100；300 800；300
A.a酶与b酶切断的化学键不相同
B.a酶与b酶切出的黏性末端不能相互连接
C.在该DNA分子中，a酶与b酶的识别序列分别有3个和2个
D.用这两种酶和DNA连接酶对该DNA分子进行反复切割、连接操作，
若干循环后，
－TCTAGG－
－AGATCC－
序列会明显增多
D
习题巩固
8.下图为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图。据图回答下列问题。
(1)a代表的物质和质粒的化学本质相同,
都是　　　，二者还具有其他共同点,
如①　 　 　　　,
②　　 　　 。
(2)若质粒DNA分子的切割末端为 ,
则与之连接的目的基因切割末端应为　　 　
;可使用 把
质粒和目的基因连接在一起。
DNA
能够自我复制
具有遗传效应
CGCGT—
A—
DNA连接酶
习题巩固
8.下图为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图。据图回答下列问题。
(3)氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上
称为　 　　　，其作用是：
(4)下列常在基因工程中用作载体的是　　　
A.苏云金杆菌的抗虫基因　
B.土壤农杆菌的环状RNA分子
C.大肠杆菌的质粒　
D.动物细胞的染色体
标记基因
便于重组DNA分子的筛选。
C
习题巩固
9.下列关于质粒的叙述，正确的是（ ）
A.质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器
B.质粒是细菌细胞质中能自主复制的小型环状DNA分子
C.质粒只有在侵入宿主细胞后在宿主细胞内复制
D.细菌质粒的复制过程一定是在宿主细胞外独立进行
B
10.某细菌质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因
（目的基因）是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示是外源基因插入位置（插入点有a、b、c）示意图，请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是 （ 　 　）
习题巩固
插入点 细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况 细菌在含四环素的培养基上的生长状况
① 能生长 能生长
② 能生长 不能生长
③ 不能生长 能生长
A.①是c；②是b；③是a
B.①是a和b；②是a；③是b
C.①是a和b；②是b；③是a
D.①是c；②是a；③是b
课堂总结
限制酶
DNA连接酶
载体
①对受体细胞无害；
②有一个至多个限制酶切割位点；
③有特殊的标记基因；
④能自我复制或能整合到宿主DNA上。
质粒、 λ噬菌体衍生物 、动植物病毒
基因工程的基本工具
作为载体的条件
种类:
磷酸二酯键
主要来源于原核生物
具有专一性
来源：
特点：
作用部位：
结果：
形成黏性末端或平末端
连接部位：
种类：
作用：
把两条双链DNA片段拼接起来
磷酸二酯键
E.Coli DNA连接酶、T4 DNA连接酶
DNA的粗提取与鉴定
4
DNA的粗提取与鉴定
4
一、实验原理
0
0.14
NaCI浓度（mol/L）
DNA溶解度
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
DNA不溶于酒精，
但某些蛋白质溶于酒精
DNA能溶于物质的量浓度为
2 mol/L的NaCl溶液
在一定温度下，
DNA被二苯胺试剂染成蓝色
初步分离
DNA和蛋白质
溶解DNA
鉴定DNA
DNA的粗提取与鉴定
4
二、材料用具
1.材料
富含DNA的材料，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜和猪肝等、研磨液、体积分数为95％的酒精、2 mol/L的NaCl溶液、
二苯胺试剂和蒸馏水等。
不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。
2.用具
烧杯、量筒、玻璃棒、研钵、纱布、漏斗、试管、试管架、试管夹、酒精灯、石棉网、三脚架、火柴、刀片和天平等。
DNA的粗提取与鉴定
4
三、方法步骤
（1）研磨的目的：
（2）研磨时间不宜太长：
（3）研磨不宜太用力
（4）有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶：
1.通过研磨释放 DNA
称取约30g 洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10 mL 研磨液，充分研磨（可加入少量石英砂助研）。
研磨液成分 作用
SDS 使蛋白质变性
EDTA 抑制DNA酶
Tris-HCl缓冲液 稳定DNA
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中。
防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量。
研磨效果好（有利于充分研磨）。
2.过滤获取含DNA的上清液
在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1500 r / min 的转速下离心5 min ，再取上清液放入烧杯中。
为减少 DNA 的损失，过滤过程一般使用纱布
可能含有核蛋白、多糖等杂质
低温放置几分钟的作用
①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；
②抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；
③低温有利于增加DNA的柔韧性，减少其断裂。
三、方法步骤
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95%），静置2~3 min ，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的 DNA 。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或者将溶液倒入塑料离心管中，在10000 r / min 的转速下离心5 min ，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA ）晾干。
3.冷却酒精析出DNA
减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子。
三、方法步骤
4.DNA的鉴定
取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
加入2mol/L氯化钠溶液
不加入丝状物
加入4mL二苯胺试剂
加入2mol/L氯化钠溶液
加入丝状物
加入4mL二苯胺试剂
实验组
对照组
水浴加热
溶液蓝色的深浅与溶液中DNA的含量的多少有关
三、方法步骤
DNA的粗提取与鉴定
4
四、结果分析与评价
二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。
1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？
观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。
四、结果分析与评价
①材料中的核物质没有充分释放出来，
如研磨不充分或蒸馏水的量不够。
②加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏。
③二苯胺最好现用现配，否则二苯胺变成浅蓝色，影响鉴定效果。
以血液为实验材料时：
每100 mL血液中需要加入3 g柠檬酸钠，防止血液凝固。
利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：
动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破。
2.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，
分析产生差异的原因。
进一步探究
为了提纯DNA，某同学提出以下实验方案，请分析原因：
操作2:上述得到的DNA提取液，缓缓加入蒸馏水，调节NaCl溶液
的浓度为0.14mol/L，玻璃棒搅拌，析出DNA。
操作1:得到的DNA粗提取物（丝状物或沉淀）加入2mol/L的NaCl
溶液溶解，过滤，取滤液（DNA提取液）。
加2mol/L的NaCl溶液的目的
加蒸馏水的目的
溶解DNA，除掉高盐溶液中不能溶解的杂质，提纯DNA液。
除低NaCl溶液浓度，从而降低DNA分子在NaCl溶液中的溶解度，使DNA析出，除掉溶解在低盐溶液中的杂质。
方法一：
用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐溶液中不能溶解的杂质；用低盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。
方法二：
可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开；随后，加入氯仿—异丙醇混合液(体积比为24：1)，通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液；可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。
进一步探究
刑侦破案
方法三：
由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将两者分开。
DNA提取的应用
插入人胰岛素基因的大肠杆菌
基因工程
进一步探究
习题检测
5
习题检测
1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。
下列相关叙述正确的是 ( )
A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，
重新形成磷酸二酯键
D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，
不能连接双链DNA片段的平末端
C
习题检测
2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是
（ ）
A.大肠杆菌的质粒
B.切割DNA分子的酶
C.DNA片段的黏性末端
D. 用来识别特定基因的DNA探针
A
习题巩固
1、为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。
习题检测
2.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶Spe I进行切割，B片段分别用限制酶Hind Ⅲ、Xba I、EcoR V和Xho I进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。
习题检测
（1）哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeI切割A片段
产生的DNA片段相连接 为什么
XbaⅠ。因为XbaI与SpeI切割产生了相同的黏性末端。
（2）不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，
这在基因工程操作中有什么意义
识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。
习题检测
例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶（目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列）来获取目的基因。

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