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(共17张PPT)
探 究 · 实 践 D N A 片 段 的
扩增及电泳鉴定
-一、实验原理
二、材料用具
三、实验步骤
四、注意事项
五、结果分析
一、实验原理
( 一 )PCR扩增DNA片段的原理：
1.PCR利用了热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解 旋和结合，PCR 仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。 一 次PCR一般要经历30次循环。
2.PCR 扩增DNA片段还利用了半保留复制的原理。
5’ -3’ 高温 5’ -3’
3’ -5’ 变性
3’ -5’
低
温
-3’ -5’
-5’
复
性
Ⅲ
-3’
-5’
-3’ -5’
5’
5’ 3’
延伸
中温
5’
3’
5’ 3’
1 .分离：DNA 分子具有可解离基团，在一定的pH 下，这些
基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分 子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
2.鉴定：PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。DNA 分子在凝胶中的迁移速率与凝胶浓度、DNA 分子大小和构象等 有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外 光下被检测出来。
3.纯化：电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带，用于以后
的克隆操作。 a b
一、实验原理
( 二 )DNA 片段电泳鉴定的原理：
1.凝胶浓度：琼脂糖凝胶是一种带孔的筛网状多聚物。
凝胶浓度越小，筛孔越大， DNA 分子迁移速率就越高；凝胶 浓度越大，筛孔越小， DNA 分子迁移速率就越低。
2.DNA分子的大小：当凝胶浓度相同时，较大的DNA分子 因体积大，所占据的空间大，在穿过凝胶孔隙时会遇到较大 的阻力，穿过孔隙相对困难，迁移速率低。
电泳一段时间后，较大的DNA分子迁移距离小，离加样 孔近；而较小的DNA分子迁移距离大，离加样孔远。相同大 小的DNA分子则会聚集在凝胶同一特定的位置上。
3.DNA的构象：迁移速率：双螺旋环状DNA>双螺旋链状
DNA> 单 链DNA。
一、实验原理
(三)影响DNA迁移速率的因素：
大分子迁移 速率低
小分子迁移 速率高
一大小不同的 DNA 分子
凝胶孔隙
不同大小的DNA 分子在凝胶中电泳示意图
加样孔
电泳
二、材料与用具
( 一 ) 用 具 ：
1.PCR仪(自动控温，实现DNA的扩增)
2.微量离心管(实际上是进行PCR反应的场所)
3.微量移液器(用于向微量离心管转移PCR配方中的液体)
4.一次性吸液枪头(微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头) 5.电泳装置(包括电泳仪、电泳槽等)
TagDNA 聚合酶一 引物一 4种脱氧核苷酸 — DNA 模板一
PCR扩增仪
1.PCR仪(自动控温，实现DNA的扩增)
2.微量离心管(实际上是进行PCR反应的场所)
3.微量移液器(用于向微量离心管转移PCR配方中的液体)
4.一次性吸液枪头(微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头) 5.电泳装置(包括电泳仪、电泳槽等)
二、材料与用具
( 一 ) 用 具 ：
1.PCR仪(自动控温，实现DNA的扩增)
2.微量离心管(实际上是进行PCR反应的场所)
3.微量移液器(用于向微量离心管转移PCR配方中的液体)
4.一次性吸液枪头(微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头) 5.电泳装置(包括电泳仪、电泳槽等)
二、材料与用具
( 一 ) 用 具 ：
10倍浓缩的扩增缓冲液(含Mg +)
5μL
20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液(实为dNTP)
1μL
20μ mol/L的引物I
2.5μL
20μ mol/L的引物Ⅱ
2.5μL
H O
2833μ L
1-5U/μ L的Taq DNA聚合酶(即耐高温的DNA聚合酶)
1—2U
模板DNA(用量为1pg-1μg)
5—10μL
总体积
50μL
二、材料用具
(二)试剂：
1.4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA 聚合酶、模板DNA、扩 增 缓冲液、无菌水。
PCR反应体系的配方
(二)试剂：
2.电泳缓冲液(TAE或TBE)、凝胶载样缓冲液(内含指示 剂一 —溴酚蓝)、琼脂糖和核酸染料(常用核酸染料为 EB即溴化乙锭)等。
EB可插入DNA双链碱基之间，形成EB-DNA 复合物。该复合物在紫外线激发下，发射 出红橙色荧光。EB-DNA 复合物荧光强度与 DNA含量成正相关，根据荧光强度可粗略 地估计样品中DNA含 量 。(EB 有剧毒)
样品孔
电泳槽
缓冲液
琼脂糖凝
胶
二、材料用具
电
源
步骤
操作
加样
按 配 方 加 样
离心
将 微 量 离 心 管 放 入 离 心 机 里 ， 离 心 约 1 0 s , 使 反 应 液 集 中 在 离 心 管 的 底 部 ，以 提 高 反 应 速
率。
反应
设 置 好PCR仪循环程序， 将 含 有 反 应 液 的 微 量 离 心 管 放 入 P C R 仪 中 反 应
循环程序 变 性 复 性
延 伸
预变性 94℃,5min
30次 94℃,30s 55℃,30s
72℃,1min
最后一次 94℃,1min 55℃,30s
72℃,1min
三、实验步骤
( 一 )DNA片段的扩增过程
· 根 据 分 离DNA 片段大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液， 一般质量体积为
0 .8% — — 1 .2%,用沸水浴或微波炉加热至琼脂融化，冷却后加适 量 核 酸 染 料 ，混 匀 。
·将温热的琼脂糖溶液倒入模具，并插入合适的梳子，以形成加样孔，待凝胶完全凝固，拔出梳 子放入电泳槽内。
·将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液混合，再用微量移液枪将混合液慢慢注入加样孔内， 留一个样孔加入参照(Maker) 。
·通电，根据电泳槽阴阳极之间的距离，设定电压，一般1~5V/cm。
·待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。
·取出凝胶，置于紫外灯下观察和照相。
三、实验步骤
( 二 )PC R扩增产物电泳鉴定的过程
制胶
倒 胶
加 样
跑胶
观 察
(一)为避免外源DNA等因素的污染，PCR 实验中使
用的微量离心管、枪头等在使用前必须进行高压灭菌处 理 。
(二)该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲 液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所 需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
(三)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取 一种试剂后，移液枪上的枪头都必须更换。
(四)在进行操作时， 一定要戴好一次性手套。 ( 五 )PCR 扩增不能随意加大试剂用量。
四、注意事项
五、结果分析
(一)你是否成功扩增出DNA片段 判断的依据是什么
以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。 进行电泳鉴定的结果应该是一条条带。
该片段大小约为750bp。
2000
1000
500
250
100
7so
五、结果分析与评价
(二)你进行电泳鉴定的结果是几条条带
如果不是一条条带，请分析产生这个结果的可 能 原 因 。
1.未出现扩增条带可能的原因有：
(1)TaqDNA 聚合酶失活；
(2)引物出现质量问题；
(3)变性时温度低，变性时间短
(4)Mg + 浓度过低
五、结果分析与评价
(二)你进行电泳鉴定的结果是几条条带
如果不是一条条带，请分析产生这个结果的可 能 原 因 。
2.出现非特异性扩增带可能的原因有：
(1)引物特异性不强或容易聚合成二聚体
(2)复性时的温度过低
(3)DNA 聚合酶的浓度过高
(4)模板DNA出现污染
(5)Mg + 浓度过高
谢 谢 观 看 ：
请完成相应课后练习

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