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练习6　基因工程的基本工具与操作程序
1.[2023新课标]某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（　）
A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接
B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接
2.[2021湖北]某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带（引物与模板完全配对）外，还有2条非特异条带（引物和模板不完全配对）。为了减少反应中非特异条带的产生，以下措施中有效的是（　）
A.增加模板DNA的量 B.延长热变性的时间
C.延长延伸的时间　　 D.提高复性的温度
3.[2022辽宁]抗虫和耐除草剂玉米双抗12－5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据，采用PCR方法进行目的基因监测，反应程序如图所示。下列叙述正确的是（　）
A.预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制
B.后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C.延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D.转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
4.[2023广东改编]“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是（　）
A.裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质
B.分离：可去除混合物中的部分多糖、蛋白质等
C.沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度
D.鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
5.[2023浙江6月]某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。
图甲
图乙
下列叙述正确的是（　）
A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因表达
B.翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白
C.2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子
D.若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
6.[2023辽宁]CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起（如下图），使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去（　）
A.CD163基因中编码起始密码子的序列
B.CD163基因中编码终止密码子的序列
C.RFP基因中编码起始密码子的序列
D.RFP基因中编码终止密码子的序列
7.[2023湖北]用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（　）
A.若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B.若用Pνu Ⅰ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C.若用Sph Ⅰ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D.若用Sph Ⅰ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落
8.[2021山东]粗提取DNA时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是（　）
A.加入适量的木瓜蛋白酶
B.37～40 ℃的水浴箱中保温10～15分钟
C.加入与滤液体积相等的、体积分数为95％的冷却的酒精
D.加入NaCl调节浓度至2 mol/L→过滤→调节滤液中NaCl浓度至0.14 mol/L
9.[2024哈尔滨九中模拟]限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，以下说法正确的是（　）
A.限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸
B.DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键
C.E.coli DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端
D.限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，所以也能剪切自身的DNA
10.[2024重庆南开中学模拟]常见的启动子可分为三类：组成型启动子，驱动基因在所有细胞、组织和器官中持续表达；组织特异性启动子，调控基因只在某些特定的部位中表达；诱导型启动子，通常在光、盐等信号作用下，使目的基因的转录水平有所提高。下列叙述错误的是（　）
A.启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游
B.细胞分化与组织特异性启动子的调控有关，与组成型启动子无关
C.乳腺生物反应器的构建需要将组织特异性启动子与目的基因连接
D.盐诱导型启动子在高盐环境中被激活，可增加农作物的抗逆性
11.[2023武汉武昌区质检]关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列叙述正确的是（　）
A.实验中用95％的酒精预冷后可以更好地溶解DNA
B.将粗提物溶于NaCl后，加入二苯胺试剂，混合均匀后，沸水浴鉴定
C.将研磨液加入切碎的洋葱，充分研磨后过滤，弃去上清液
D.还可选用新鲜菜花、香蕉或猪肝、猪血等作为本实验的材料
12.[2024福州一测]下列关于凝胶电泳实验操作，叙述错误的是（　）
A.加样孔应靠近负极端，以便带负电的DNA分子向正极移动
B.接通电源后电泳一段时间，离加样孔越近的DNA分子越小
C.紫外灯照射下，凝胶上条带的荧光强度与DNA含量呈正相关
D.通过观察指示剂在凝胶中迁移的位置来判断何时停止电泳
13.[2023北京东城区二模]下列关于PCR技术的叙述，正确的是（　）
A.PCR反应体系中需要添加耐高温的解旋酶和DNA聚合酶
B.PCR过程中在引物的3'端添加脱氧核苷酸实现子链延伸
C.利用PCR对目的基因进行扩增时需要基因序列全部已知
D.在设计两种引物时，需要让引物和引物之间的碱基序列互补
14.[2024浙江大联考]用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶切割后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并导入受体菌中。根据题目所提供的信息，下列叙述正确的是（　）
A.质粒用限制酶HindⅢ切割后含有2个游离的磷酸基团
B.若用限制酶HindⅢ和ScaⅠ切割，一定可防止目的基因与质粒的反向连接
C.若用限制酶PvuⅠ切割，在含四环素培养基中形成的菌落，一定含有目的基因
D.若用限制酶SphⅠ切割，筛选时应先将转化处理的菌液涂布到含四环素的培养基中，待长成菌落，再影印接种到含氨苄青霉素的培养基中
15.杨树被根瘤农杆菌感染后会长出瘤状物，称为冠瘿瘤。冠瘿瘤内的冠瘿碱是一种含氮有机物，这种有机物是根瘤农杆菌生存所需的碳源和氮源。冠瘿瘤的形成是由于根瘤农杆菌携带天然的Ti质粒，该质粒的结构如图所示。下列说法错误的是（　）
A.Ti质粒上的生长素基因可在杨树生长发育过程中发挥作用
B.Ti质粒上的T-DNA区域至少含有一个限制酶的切割位点
C.冠瘿碱合成基因在根瘤农杆菌细胞中表达并分泌到细胞外
D.根瘤农杆菌内Ti质粒的存在决定了其感染植物的范围
16.[2024武汉部分学校调研]如图是蛋白质工程中改造目的基因的一种技术路线。S1核酸酶可以去除双链DNA突出的单链区；外切核酸酶Ⅲ只能从DNA双链的3'末端逐个水解核苷酸，产生不同长度的5'突出末端。下列叙述错误的是（　）
A.步骤一需使用两种限制酶切割目的基因片段M
B.步骤二、三分别使用了S1核酸酶、外切核酸酶Ⅲ
C.步骤四宜选用T4 DNA连接酶处理DNA片段
D.质粒载体2中目的基因片段N的长度可有多种
17.[2024玉林联考]白细胞介素-2（IL-2）是一种免疫调节因子，化学本质是糖蛋白。科研人员将含IL-2基因的DNA片段和质粒pPIC9K（部分结构如图所示）构建成重组质粒，并导入酵母菌GS115（组氨酸缺陷菌株）中，筛选得到了能分泌IL-2的工程菌株。下列有关叙述错误的是（　）
A.组氨酸合成基因可作为标记基因筛选导入重组质粒的酵母菌细胞
B.构建重组质粒时可选用Avr Ⅱ和Not Ⅰ切割目的基因和质粒pPIC9K
C.RNA聚合酶识别并结合质粒上的启动子，驱动基因转录
D.酵母菌细胞内的内质网和高尔基体能对蛋白质进行加工修饰
18.[2023大同检测]为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C（图1），拟将其与质粒（图2）重组，再借助农杆菌导入菊花细胞中。
下列操作与实验目的不符的是（　）
A.用限制性内切核酸酶EcoRⅠ和DNA连接酶构建重组质粒
B.用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞
C.在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的农杆菌细胞
D.用PCR技术检测C基因是否整合到菊花染色体上
19.[2023长春模拟]用Xho Ⅰ和Sal Ⅰ 两种限制酶分别处理同一DNA片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图1和图2所示。以下叙述错误的是（　）
A.图1中两种酶识别的核苷酸序列不同
B.图2中泳道②的酶切产物说明该限制酶断开了4个磷酸二酯键
C.若用两种限制酶同时切割该DNA，电泳后泳道中将出现7条条带
D.图2泳道①中是用Sal Ⅰ 处理得到的酶切产物
20.[2023南京六校调研]大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR反应即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物用作第二轮PCR扩增的大引物，过程如图所示。下列有关叙述正确的是（　）
A.两轮PCR过程中复性时的温度一样
B.单核苷酸的定点诱变所属变异类型为基因重组
C.第二轮PCR所用的引物都是第一轮PCR的产物——DNA的两条链
D.利用该技术将某功能蛋白的结构改变属于蛋白质工程
21.[ 2023南通检测，多选]CAR-T细胞疗法是通过设计CAR基因，导入癌症患者的T细胞中，使其转化为CAR-T细胞，CAR-T细胞膜上的CAR蛋白与癌细胞表面抗原特异结合后，激活CAR-T细胞使其增殖、分化，从而实现对癌细胞的特异性杀伤和记忆，主要过程如图。肿瘤浸润淋巴细胞是对肿瘤起识别、抵抗和攻击作用的细胞群体。下列说法正确的是（　）
A.胞外结合区DNA序列可来自患者自身的肿瘤浸润淋巴细胞
B.CAR基因缺少启动子，无法在T细胞中复制，故过程②在导入T细胞前完成
C.重组分子导入T细胞后，应当用PCR技术检验指导CAR合成的基因是否表达成功
D.CAR-T细胞经过程④形成的效应细胞能准确识别癌细胞并引发细胞凋亡
22.[2024广东七校第一次联考]E蛋白是一种具有特定功能的人体蛋白质。某研究小组拟利用乳腺生物反应器合成E蛋白，主要过程如图所示。结合基因工程和胚胎工程的相关知识，回答问题。
（1）步骤①过程中需要将E基因和奶牛乳腺蛋白基因的启动子等调控元件重组在一起，目的是　 　。步骤②通常采用　 　法将基因表达载体导入奶牛的　 　。为了提高移植后胚胎的发育率，通常需要等胚胎发育到　囊胚　阶段才进行步骤④。
（2）在进行步骤④之前，应该选取　 　细胞进行性别鉴定，获取该细胞后，通过PCR反应扩增SRY基因（Y染色体上特有的性别决定基因）片段，然后对扩增产物进行检测，将检测反应呈　 　（填“阳性”或“阴性”）的胚胎进行胚胎移植。
（3）若要在分子水平上判断E基因是否翻译出E蛋白，可从转基因动物的乳汁中提取蛋白质，采用　 　技术进行鉴定。
解析版
1.[2023新课标]某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（ C　）
A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接
B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接
解析　只用一种限制酶切割质粒和目的基因，会使质粒和目的基因发生自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，而且酶3切割产生平末端，E.coli DNA连接酶不能连接具有平末端的DNA片段，A错误；用酶1切割目的基因，产生的是黏性末端，用酶3切割质粒，产生的是平末端，无法连接，B错误；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后，可使用T4 DNA连接酶连接，使目的基因定向插到质粒中，C正确；用酶4切割质粒会破坏标记基因，不能选择酶4切割，D错误。
2.[2021湖北]某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带（引物与模板完全配对）外，还有2条非特异条带（引物和模板不完全配对）。为了减少反应中非特异条带的产生，以下措施中有效的是（ D　）
A.增加模板DNA的量 B.延长热变性的时间
C.延长延伸的时间　　 D.提高复性的温度
解析　PCR过程中，引物和模板不完全配对会形成非特异条带，增加模板DNA的量可以提高反应速率，但不会减少反应中非特异条带的产生，A错误；延长热变性的时间和延伸的时间对延伸中的配对影响不大，故不能有效减少非特异性条带的产生，B、C错误；非特异性条带增加的原因可能是复性温度过低使引物与模板的结合位点增加，故可通过提高复性的温度来减少非特异性条带的产生，D正确。
3.[2022辽宁]抗虫和耐除草剂玉米双抗12－5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据，采用PCR方法进行目的基因监测，反应程序如图所示。下列叙述正确的是（ B　）
A.预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制
B.后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C.延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D.转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
解析　预变性的温度为94 ℃，在这个温度下，双链DNA解旋为单链，但模板链不易和引物结合，不能进行复制，A错误。延伸的目的是合成新的子链，后延伸延长了延伸时间，使目的基因的扩增更加充分，B正确。延伸过程需要引物与模板链结合，在引物的3'端加上相应的核苷酸，C错误。转基因品种经检测含有目的基因且已经表达使生物体表现出相应性状后，还需要经过系列的安全性评价，符合相应标准后才能上市，D错误。
4.[2023广东改编]“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是（ D　）
A.裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质
B.分离：可去除混合物中的部分多糖、蛋白质等
C.沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度
D.鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
解析　“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解、分离、沉淀、鉴定。裂解的目的是使细胞破裂，释放出DNA等物质，A正确。DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质等，分离过程中混合物中的部分多糖、蛋白质等可被去除，B正确。DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，通过控制NaCl溶液的浓度可去除杂质，反复多次以提高DNA的纯度，C正确。进行DNA鉴定时可以使用二苯胺试剂，但要进行沸水浴加热后才能观察到颜色变化，D错误。
5.[2023浙江6月]某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。
图甲
图乙
下列叙述正确的是（ B　）
A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因表达
B.翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白
C.2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子
D.若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
解析　由图甲可知，Gata3基因与GFP基因共用一个启动子，且由题干可知两基因能正常表达出相关蛋白质，A错误；由于启动子在左侧，基因在右侧，转录基因时，先转录Gata3基因，再转录GFP基因，且翻译的方向是沿mRNA从5'→3'，因此翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确；由图乙可知，大片段包含GFP基因编码区片段，小片段不包含GFP基因编码区片段，则2号小鼠是Gata3-GFP基因纯合子，4号小鼠是野生型，C错误；若用引物1和引物3进行PCR，杂合子和Gata3-GFP基因纯合子均能扩增出条带，仅有Gata3基因时无法扩增出条带，不利于区分杂合子和纯合子，D错误。
6.[2023辽宁]CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起（如下图），使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去（ B　）
A.CD163基因中编码起始密码子的序列
B.CD163基因中编码终止密码子的序列
C.RFP基因中编码起始密码子的序列
D.RFP基因中编码终止密码子的序列
解析　由题意可知，若想使红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起，使其表达成一条多肽，则CD163基因和红色荧光蛋白RFP基因都需进行转录和翻译，再结合图示可知，CD163基因转录形成的mRNA中不能出现终止密码子，否则在翻译时会提前终止，无法表达出既含CD163蛋白又含红色荧光蛋白RFP的一整条多肽，因此该拼接过程的关键步骤是除去CD163基因中编码终止密码子的序列，B符合题意，A、C、D不符合题意。
7.[2023湖北]用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（ D　）
A.若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B.若用Pνu Ⅰ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C.若用Sph Ⅰ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D.若用Sph Ⅰ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落
解析　若用Hind Ⅲ酶切质粒和含有目的基因的DNA片段，用DNA连接酶将两者连接成重组质粒，目的基因和质粒有正向连接和反向连接两种连接形式，因此，目的基因转录的产物可能不同，A正确；若用Pvu Ⅰ酶切，会破坏氨苄青霉素抗性基因，在含Tet（四环素）培养基中的菌落可能是由含有目的基因的重组质粒形成的，也可能是由质粒自身连接的产物形成的，因此，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；若用Sph Ⅰ酶切，由于重组质粒和普通质粒的碱基对数不同，因此可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；若用Sph Ⅰ酶切，会破坏四环素抗性基因，氨苄青霉素抗性基因不受影响，因此携带目的基因的受体菌能在含Amp（氨苄青霉素）的培养基中形成菌落，不能在含Tet（四环素）的培养基中形成菌落，D错误。
8.[2021山东]粗提取DNA时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是（ A　）
A.加入适量的木瓜蛋白酶
B.37～40 ℃的水浴箱中保温10～15分钟
C.加入与滤液体积相等的、体积分数为95％的冷却的酒精
D.加入NaCl调节浓度至2 mol/L→过滤→调节滤液中NaCl浓度至0.14 mol/L
解析　木瓜蛋白酶能够分解蛋白质，故在得到的滤液中加入适量的木瓜蛋白酶后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物，A符合题意。将制备的含有DNA的滤液放入60～75 ℃的水浴箱中保温10～15分钟，利用DNA和蛋白质对高温的耐受性不同，使蛋白质变性，从而更好地与DNA分离，B不符合题意。DNA不溶于体积分数为95％的冷却的酒精，因此向含有DNA的滤液中加入与滤液体积相等的、体积分数为95％的冷却的酒精后DNA会析出，C不符合题意。DNA在0.14 mol/L的NaCl溶液中的溶解度最低，因此将含DNA的NaCl溶液调至0.14 mol/L，滤液中几乎不含DNA，D不符合题意。
9.[2024哈尔滨九中模拟]限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，以下说法正确的是（ A　）
A.限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸
B.DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键
C.E.coli DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端
D.限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，所以也能剪切自身的DNA
解析　限制酶只能切割DNA分子，烟草花叶病毒的核酸是RNA，不能切割，A正确；DNA连接酶连接的是两个DNA片段，B错误；E.coli DNA连接酶只能连接黏性末端，不能连接平末端，C错误；限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，但是因为原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰，所以不能剪切自身的DNA，D错误。
10.[2024重庆南开中学模拟]常见的启动子可分为三类：组成型启动子，驱动基因在所有细胞、组织和器官中持续表达；组织特异性启动子，调控基因只在某些特定的部位中表达；诱导型启动子，通常在光、盐等信号作用下，使目的基因的转录水平有所提高。下列叙述错误的是（ B　）
A.启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游
B.细胞分化与组织特异性启动子的调控有关，与组成型启动子无关
C.乳腺生物反应器的构建需要将组织特异性启动子与目的基因连接
D.盐诱导型启动子在高盐环境中被激活，可增加农作物的抗逆性
解析　启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能够启动转录，A正确；根据题干信息“组成型启动子，驱动基因在所有细胞、组织和器官中持续表达”可知，细胞分化与组成型启动子有关，B错误；组织特异性启动子，调控基因只在某些特定的部位中表达，据此推知，乳腺生物反应器的构建需要将组织特异性启动子与目的基因连接，保证目的基因在乳腺细胞中表达，C正确；根据题干信息“诱导型启动子，通常在光、盐等信号作用下，使目的基因的转录水平有所提高”可知，盐诱导型启动子在高盐环境中被激活，可增加农作物的抗逆性，D正确。
11.[2023武汉武昌区质检]关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列叙述正确的是（ B　）
A.实验中用95％的酒精预冷后可以更好地溶解DNA
B.将粗提物溶于NaCl后，加入二苯胺试剂，混合均匀后，沸水浴鉴定
C.将研磨液加入切碎的洋葱，充分研磨后过滤，弃去上清液
D.还可选用新鲜菜花、香蕉或猪肝、猪血等作为本实验的材料
解析　DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可初步将DNA与蛋白质分离，A错误；鉴定DNA时，将粗提物溶于NaCl，并与二苯胺试剂混合后进行沸水浴，观察颜色变化，B正确；将研磨液加入切碎的洋葱，充分研磨后过滤，弃去沉淀物，收集上清液，C错误；哺乳动物成熟红细胞中没有细胞核和细胞器，因此猪血不可用于“DNA的粗提取与鉴定”实验，D错误。
12.[2024福州一测]下列关于凝胶电泳实验操作，叙述错误的是（ B　）
A.加样孔应靠近负极端，以便带负电的DNA分子向正极移动
B.接通电源后电泳一段时间，离加样孔越近的DNA分子越小
C.紫外灯照射下，凝胶上条带的荧光强度与DNA含量呈正相关
D.通过观察指示剂在凝胶中迁移的位置来判断何时停止电泳
解析　脱氧核苷酸是组成DNA分子的单体，其中的磷酸基团能解离出氢离子，使DNA分子带负电，加样孔靠近负极端，有利于DNA分子向正极移动，A正确。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，DNA分子越小，其在凝胶中的迁移速率越快，电泳一段时间后，离加样孔越远，B错误。DNA含量越高，在紫外灯照射下，凝胶上条带的荧光强度就越强，C正确。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳，D正确。
13.[2023北京东城区二模]下列关于PCR技术的叙述，正确的是（ B　）
A.PCR反应体系中需要添加耐高温的解旋酶和DNA聚合酶
B.PCR过程中在引物的3'端添加脱氧核苷酸实现子链延伸
C.利用PCR对目的基因进行扩增时需要基因序列全部已知
D.在设计两种引物时，需要让引物和引物之间的碱基序列互补
解析　PCR反应体系中需要添加耐高温的DNA聚合酶，不需要添加解旋酶，A错误；合成子链时，引物先与模板链配对结合，然后在引物的3'端进行子链延伸，B正确；利用PCR对目的基因进行扩增时，知道目的基因两端的一小段序列即可，C错误；在设计两种引物时，两种引物之间的碱基序列不能互补配对，D错误。
14.[2024浙江大联考]用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶切割后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并导入受体菌中。根据题目所提供的信息，下列叙述正确的是（ A　）
A.质粒用限制酶HindⅢ切割后含有2个游离的磷酸基团
B.若用限制酶HindⅢ和ScaⅠ切割，一定可防止目的基因与质粒的反向连接
C.若用限制酶PvuⅠ切割，在含四环素培养基中形成的菌落，一定含有目的基因
D.若用限制酶SphⅠ切割，筛选时应先将转化处理的菌液涂布到含四环素的培养基中，待长成菌落，再影印接种到含氨苄青霉素的培养基中
解析　题图质粒中限制酶Hind Ⅲ的切割位点有1个，用该限制酶切割质粒，获得1个DNA片段，其含有2个游离的磷酸基团，A正确。由于题图质粒中限制酶Sca Ⅰ的切割位点有两个，若用限制酶Hind Ⅲ和Sca Ⅰ进行切割，不一定能防止目的基因和质粒的反向连接，B错误。由题图可知，氨苄青霉素抗性基因中含有限制酶Pvu Ⅰ的切割位点，若用限制酶Pvu Ⅰ切割质粒，则氨苄青霉素抗性基因会被破坏，而四环素抗性基因正常，在含有四环素的培养基中，导入重组质粒（含目的基因）或空质粒的受体菌均能形成菌落，C错误。由题图可知，四环素抗性基因中含有限制酶Sph Ⅰ的切割位点，若用限制酶Sph Ⅰ切割质粒，则会破坏四环素抗性基因，而氨苄青霉素抗性基因正常，进行筛选时，可先将转化处理的菌液涂布到含氨苄青霉素的培养基中，待长成菌落（导入重组质粒的受体菌和导入空质粒的受体菌都能在含氨苄青霉素的培养基中形成菌落），再影印接种到含四环素的培养基中，在含四环素的培养基中不能生长的受体菌即为导入重组质粒的受体菌，D错误。
15.杨树被根瘤农杆菌感染后会长出瘤状物，称为冠瘿瘤。冠瘿瘤内的冠瘿碱是一种含氮有机物，这种有机物是根瘤农杆菌生存所需的碳源和氮源。冠瘿瘤的形成是由于根瘤农杆菌携带天然的Ti质粒，该质粒的结构如图所示。下列说法错误的是（ C　）
A.Ti质粒上的生长素基因可在杨树生长发育过程中发挥作用
B.Ti质粒上的T-DNA区域至少含有一个限制酶的切割位点
C.冠瘿碱合成基因在根瘤农杆菌细胞中表达并分泌到细胞外
D.根瘤农杆菌内Ti质粒的存在决定了其感染植物的范围
解析　Ti质粒上的生长素基因可随T-DNA整合到杨树细胞的染色体DNA上，并进行表达，故Ti质粒上的生长素基因可在杨树生长发育过程中发挥作用，A正确；Ti质粒上的T-DNA区域至少含有一个限制酶的切割位点，以便插入目的基因，B正确；冠瘿碱合成基因会随T-DNA整合到杨树细胞的染色体DNA上，并在杨树细胞中表达，C错误；根瘤农杆菌内Ti质粒的存在决定了其能感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力，D正确。
16.[2024武汉部分学校调研]如图是蛋白质工程中改造目的基因的一种技术路线。S1核酸酶可以去除双链DNA突出的单链区；外切核酸酶Ⅲ只能从DNA双链的3'末端逐个水解核苷酸，产生不同长度的5'突出末端。下列叙述错误的是（ B　）
A.步骤一需使用两种限制酶切割目的基因片段M
B.步骤二、三分别使用了S1核酸酶、外切核酸酶Ⅲ
C.步骤四宜选用T4 DNA连接酶处理DNA片段
D.质粒载体2中目的基因片段N的长度可有多种
解析　经步骤一处理后，得到的目的基因片段一端是平末端，一端是黏性末端，则步骤一需使用两种限制酶切割目的基因片段M，A正确。经步骤二处理（用酶a处理）后，又增加了一个新的黏性末端，经步骤三处理（用酶b处理）后，黏性末端全部消失，又知S1核酸酶可以去除双链DNA突出的单链区，外切核酸酶Ⅲ只能从DNA双链的3'末端逐个水解核苷酸，则酶a最可能为外切核酸酶Ⅲ，酶b最可能为S1核酸酶，B错误。T4 DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，C正确。由于外切核酸酶Ⅲ只能从DNA双链的3'末端逐个水解单核苷酸，且水解后可以产生不同长度的5'突出末端，所以经过酶a、酶b处理后，可以得到多种目的基因片段，D正确。
17.[2024玉林联考]白细胞介素-2（IL-2）是一种免疫调节因子，化学本质是糖蛋白。科研人员将含IL-2基因的DNA片段和质粒pPIC9K（部分结构如图所示）构建成重组质粒，并导入酵母菌GS115（组氨酸缺陷菌株）中，筛选得到了能分泌IL-2的工程菌株。下列有关叙述错误的是（ B　）
A.组氨酸合成基因可作为标记基因筛选导入重组质粒的酵母菌细胞
B.构建重组质粒时可选用Avr Ⅱ和Not Ⅰ切割目的基因和质粒pPIC9K
C.RNA聚合酶识别并结合质粒上的启动子，驱动基因转录
D.酵母菌细胞内的内质网和高尔基体能对蛋白质进行加工修饰
解析　酵母菌GS115是组氨酸缺陷菌株，不能合成组氨酸，导入组氨酸合成基因后就可以合成组氨酸，可以用不含组氨酸的培养基筛选导入重组质粒的酵母菌GS115，A正确；据图可知，为保证目的基因（Avr Ⅱ会破坏目的基因）和启动子（Sac Ⅰ会破坏启动子）的完整性，可用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ分别切割含有IL-2基因的DNA片段和质粒pPIC9K，B错误；质粒上的启动子可作为RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动基因转录，C正确；酵母菌细胞是真核细胞，其含有的内质网和高尔基体能对蛋白质进行加工修饰，D正确。
18.[2023大同检测]为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C（图1），拟将其与质粒（图2）重组，再借助农杆菌导入菊花细胞中。
下列操作与实验目的不符的是（ C　）
A.用限制性内切核酸酶EcoRⅠ和DNA连接酶构建重组质粒
B.用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞
C.在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的农杆菌细胞
D.用PCR技术检测C基因是否整合到菊花染色体上
解析　根据目的基因两侧的限制酶切割位点可知，用限制性内切核酸酶EcoR Ⅰ和DNA连接酶构建重组质粒，A不符合题意；将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法，即用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞，B不符合题意；图2中显示标记基因是潮霉素抗性基因，因此可在培养基中添加潮霉素，筛选被转化的农杆菌细胞，C符合题意；可采用PCR技术检测C基因是否整合到菊花染色体上，D不符合题意。
19.[2023长春模拟]用Xho Ⅰ和Sal Ⅰ 两种限制酶分别处理同一DNA片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图1和图2所示。以下叙述错误的是（ C　）
A.图1中两种酶识别的核苷酸序列不同
B.图2中泳道②的酶切产物说明该限制酶断开了4个磷酸二酯键
C.若用两种限制酶同时切割该DNA，电泳后泳道中将出现7条条带
D.图2泳道①中是用Sal Ⅰ 处理得到的酶切产物
解析　不同的限制酶识别并切割的核苷酸序列不同，图1中两种酶识别的核苷酸序列不同，A正确。分析图1和图2可知，泳道②是限制酶Xho Ⅰ的酶切产物分离结果，该DNA片段共有2个该限制酶酶切位点，所以断开了4个磷酸二酯键，B正确。由题图可知，若用两种限制酶同时切割该DNA，该DNA的每个酶切位点都会被切开，则将被切成6个片段，如果6个片段分子大小不同则在泳道中出现6条条带；如果其中有片段分子大小相同，则条带数目小于6条，C错误。根据图2分析泳道①中是用Sal Ⅰ（其有3处切割位点，切割后产生4个DNA片段）处理得到的酶切产物分离结果，D正确。
20.[2023南京六校调研]大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR反应即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物用作第二轮PCR扩增的大引物，过程如图所示。下列有关叙述正确的是（ D　）
A.两轮PCR过程中复性时的温度一样
B.单核苷酸的定点诱变所属变异类型为基因重组
C.第二轮PCR所用的引物都是第一轮PCR的产物——DNA的两条链
D.利用该技术将某功能蛋白的结构改变属于蛋白质工程
解析　单核苷酸的定点诱变需进行两轮PCR反应，第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物，为了使引物与模板链准确配对，第二轮PCR的复性温度应比第一轮的高，A错误；单核苷酸的定点诱变所属变异类型为基因突变，B错误；由图可知，第二轮PCR需加入另一种侧翼引物，C错误；蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，利用该技术将某功能蛋白的结构改变属于蛋白质工程，D正确。
21.[ 2023南通检测，多选]CAR-T细胞疗法是通过设计CAR基因，导入癌症患者的T细胞中，使其转化为CAR-T细胞，CAR-T细胞膜上的CAR蛋白与癌细胞表面抗原特异结合后，激活CAR-T细胞使其增殖、分化，从而实现对癌细胞的特异性杀伤和记忆，主要过程如图。肿瘤浸润淋巴细胞是对肿瘤起识别、抵抗和攻击作用的细胞群体。下列说法正确的是（ AD　）
A.胞外结合区DNA序列可来自患者自身的肿瘤浸润淋巴细胞
B.CAR基因缺少启动子，无法在T细胞中复制，故过程②在导入T细胞前完成
C.重组分子导入T细胞后，应当用PCR技术检验指导CAR合成的基因是否表达成功
D.CAR-T细胞经过程④形成的效应细胞能准确识别癌细胞并引发细胞凋亡
解析　由题意可知，CAR-T细胞膜上的CAR蛋白可与癌细胞表面抗原特异结合，因此CAR蛋白的胞外结合区DNA序列可来自患者自身的肿瘤浸润淋巴细胞，A正确；启动子能启动目的基因的转录，CAR基因缺少启动子，无法在T细胞中转录，故过程②在导入T细胞前完成，B错误；通过PCR技术可以检测目的基因是否成功插入或转录出mRNA，不能检验指导CAR合成的基因是否表达成功，C错误；CAR-T细胞经CAR蛋白的作用接受癌细胞的信息后，会增殖分化成效应细胞进而准确识别癌细胞并引发癌细胞凋亡，D正确。
22.[2024广东七校第一次联考]E蛋白是一种具有特定功能的人体蛋白质。某研究小组拟利用乳腺生物反应器合成E蛋白，主要过程如图所示。结合基因工程和胚胎工程的相关知识，回答问题。
（1）步骤①过程中需要将E基因和奶牛乳腺蛋白基因的启动子等调控元件重组在一起，目的是　使E基因能在乳腺细胞中特异性表达（或让E基因只在乳腺细胞中表达）　。步骤②通常采用　显微注射　法将基因表达载体导入奶牛的　受精卵　。为了提高移植后胚胎的发育率，通常需要等胚胎发育到　囊胚　阶段才进行步骤④。
（2）在进行步骤④之前，应该选取　滋养层　细胞进行性别鉴定，获取该细胞后，通过PCR反应扩增SRY基因（Y染色体上特有的性别决定基因）片段，然后对扩增产物进行检测，将检测反应呈　阴性　（填“阳性”或“阴性”）的胚胎进行胚胎移植。
（3）若要在分子水平上判断E基因是否翻译出E蛋白，可从转基因动物的乳汁中提取蛋白质，采用　抗原—抗体杂交　技术进行鉴定。
解析　（1）将目的基因与奶牛乳腺蛋白基因的启动子等调控元件重组在一起的目的是让目的基因在乳腺细胞中特异性表达。将目的基因导入受体（奶牛）的常用方法是显微注射法。欲让目的基因能够在奶牛中成功表达，应该将重组载体导入奶牛的受精卵中。胚胎发育到囊胚阶段（注：由于本题中需对胚胎进行性别鉴定，胚胎需发育至囊胚阶段。）进行移植可提高移植后胚胎的发育率。（2）胚胎移植前，应选取滋养层细胞做性别鉴定。Y染色体是雄性个体中存在的染色体，而进行胚胎移植时应选择雌性的胚胎，因此获取滋养层细胞后，通过PCR反应扩增SRY基因片段，然后对扩增产物进行检测，需要选取反应呈阴性的胚胎进行移植。（3）可通过抗原—抗体杂交技术检测转基因动物的乳汁中是否含有E蛋白。

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