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练习7　基因工程的应用与蛋白质工程
1.[2023湖南]盐碱胁迫下植物应激反应产生的H2O2对细胞有毒害作用。禾本科农作物AT1蛋白通过调节细胞膜上PIP2s蛋白磷酸化水平，影响H2O2的跨膜转运，如图所示。下列叙述错误的是（ 　）
A.细胞膜上PIP2s蛋白高磷酸化水平是其提高H2O2外排能力所必需的
B.PIP2s蛋白磷酸化被抑制，促进H2O2外排，从而减轻其对细胞的毒害
C.敲除AT1基因或降低其表达可提高禾本科农作物的耐盐碱能力
D.从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因是改良农作物抗逆性的有效途径
2.[2022江苏]采用基因工程技术调控植物激素代谢，可实现作物改良。下列相关叙述不合理的是（　）
A.用特异启动子诱导表达iaaM（生长素合成基因）可获得无子果实
B.大量表达ipt（细胞分裂素合成关键基因）可抑制芽的分化
C.提高ga2ox（氧化赤霉素的酶基因）的表达水平可获得矮化品种
D.在果实中表达acs（乙烯合成关键酶基因）的反义基因可延迟果实成熟
3.[2021辽宁]腈水合酶（N0）广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域，但不耐高温。利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶（N1）。下列有关叙述错误的是（　）
A.N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一
B.加入连接肽需要通过改造基因实现
C.获得N1的过程需要进行转录和翻译
D.检测N1的活性时先将N1与底物充分混合，再置于高温环境
4.[2024重庆联考]蛋白质工程是基因工程的延伸，下列关于蛋白质工程的叙述，错误的是（　）
A.通过蛋白质工程改造后的蛋白质的性状不可以遗传
B.蛋白质工程和基因工程都需要构建基因表达载体
C.蛋白质工程需要限制酶、DNA连接酶和载体等工具
D.蛋白质工程经常要建立蛋白质高级结构的三维模型
5.[2023东莞模拟]干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，可以用于治疗癌症，但体外保存相当困难。如图是利用蛋白质工程设计生产干扰素的流程图，据图分析下列叙述错误的是（　）
A.图中构建新的干扰素模型的主要依据是新的干扰素的预期功能
B.图中新的干扰素基因必须插入质粒上的启动子和终止子之间才能表达
C.图中改造干扰素结构的实质是改造干扰素基因的结构
D.图中各过程并没有涉及基因工程技术
6.[2024湖北联考]科学家利用基因工程培育出了能产生乙肝病毒蛋白质的西红柿，被称为“西红柿乙肝疫苗”。具体操作：将乙肝抗原基因M导入农杆菌，然后利用农杆菌将基因M导入西红柿细胞。实验显示小白鼠连续五周吃这样的西红柿，体内产生了抗乙肝病毒的抗体，下列叙述错误的是（　）
A.实验过程中用PCR技术对基因M进行扩增，需要两种引物
B.含基因M的重组Ti质粒必须插入到西红柿细胞的染色体DNA上
C.即使基因M在西红柿中成功表达，也要进行个体生物学水平的鉴定
D.“西红柿乙肝疫苗”成本相对较低
7.[2022广东，12分]“绿水逶迤去，青山相向开。”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气（含CO2等一碳温室气体，多来自高污染排放企业）为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。
回答下列问题：
（1）研究者针对每个需要扩增的酶基因（如图）设计一对　 　，利用PCR技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。
（2）研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是　 　，终止子的作用是　 　。
（3）培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是　 　，此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
（4）这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了　 　，体现了循环经济的特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于　 　，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
8.[2022湖南改编]水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题：
（1）蛋白质工程流程如图所示，物质a是　 　，物质b是　 　。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是　 　。
（2）蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因常用PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是　 　。
（3）将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的　 　（填“种类”或“含量”）有关，其活性不同的原因是　 　。
（4）若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路：　 　。
9.[2023豫北名校联考]α1－抗胰蛋白酶缺乏症是一种单基因遗传病，患者会出现肺气肿及其他疾病，严重者甚至死亡，可采用注射α1－抗胰蛋白酶的方法来缓解患者的症状。科研团队决定结合如图所示流程，运用蛋白质工程设计、制造出全新的α1－抗胰蛋白酶，同时结合基因工程和胚胎工程进行扩大生产。
回答下列问题：
（1）①～③过程属于蛋白质工程，仅从③过程看，由氨基酸序列获得的核酸序列　 　（填“是”或“不是”）唯一的，原因是　 　。
（2）基因工程的核心是构建基因表达载体，基因表达载体除含目的基因外，还必须有启动子、　 　（填两种）等。可用　 　技术将基因表达载体导入受精卵中。
（3）⑧过程中，卵母细胞要在体外人工培养成熟后才能与　 　的精子受精。为提高培育成功率，进行⑨过程之前，要对提供卵母细胞的雌性动物和受体动物进行　 　处理。
（4）欲通过乳腺生物反应器生产预期α1－抗胰蛋白酶，则构建基因表达载体时所用的启动子应为　 　，且在⑧过程之前，要除去含　 　（填“X”或“Y”）染色体的精子。
10.[2023宿迁检测]一种天然蛋白t-PA能高效降解因纤维蛋白凝聚而成的血栓，但是心梗患者注射大剂量的t-PA会诱发颅内出血。研究证实，将t-PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低其诱发出血的副作用。据此，先对天然t-PA基因的碱基序列进行改造，再采取传统的基因工程方法表达该改造后的基因，可制造出性能优异的改良t-PA蛋白。如图1表示相关的目的基因、载体及限制酶识别序列和切割位点，pCLY11为质粒，请回答下列问题：
图1
（1）通过改造t-PA基因制造出性能优异的改良t-PA蛋白的过程称为　 　工程。
（2）若改造后的t-PA基因的黏性末端如图1所示，则需要选用限制酶　 切割质粒pCLY11，保证质粒与t-PA改良基因高效连接。再用DNA连接酶催化形成　 　键，构建重组质粒。
（3）以大肠杆菌作为受体细胞，在含新霉素的培养基中形成菌落的受体细胞并非都是目的菌株，原因是　 　。成功获取能生产改良t-PA蛋白的工程菌株后，利用　 　（填“固体”或“液体”）培养基在发酵罐中进行大量生产。
（4）除了用工程菌株，还可以用图2所示方法从转基因牛乳汁中获得改良t-PA蛋白：
图2
过程②常用的方法是　 　；在过程④前需要取囊胚的　 　细胞做DNA分析进行性别鉴定。
11.[2023南京调研]人胰岛素基因表达的最初产物是一条肽链构成的前胰岛素原，经图1所示过程形成具生物活性的胰岛素。此后科学家又提出了利用基因工程改造大肠杆菌生产人胰岛素的两种方法：AB法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素；BCA法是利用胰岛B细胞中的mRNA得到胰岛素基因，表达出胰岛素原后再用特定酶切掉C肽段。这两种方法使用同一种质粒作为载体。请据图分析并回答下列问题：
（1）在人体胰岛B细胞内，图1中前胰岛素原形成具生物活性的胰岛素过程中参与的细胞器有　 　。
（2）由于密码子的　 　，AB法中人工合成的两种DNA片段均有多种可能的序列。　 　（填“AB”“BCA”或“AB和BCA”）法获取的目的基因中不含人胰岛素基因启动子。
（3）图2是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。为使目的基因与载体正确连接，在设计PCR引物时可添加限制酶　 　的识别序列。通过上述方法获得人的胰岛素基因后，需要通过PCR技术进行扩增，已知胰岛素基因左端①处的碱基序列为－CCTTTCAGCTCA－，则其中一种引物设计的序列是
5'　 　3'。
（4）β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。经Ca2＋处理的大肠杆菌与重组质粒混合培养一段时间后，采用　 　法将大肠杆菌接种到添加了　 　的培养基上筛选出　 　色的菌落，即工程菌种。
解析版
1.[2023湖南]盐碱胁迫下植物应激反应产生的H2O2对细胞有毒害作用。禾本科农作物AT1蛋白通过调节细胞膜上PIP2s蛋白磷酸化水平，影响H2O2的跨膜转运，如图所示。下列叙述错误的是（ B　）
A.细胞膜上PIP2s蛋白高磷酸化水平是其提高H2O2外排能力所必需的
B.PIP2s蛋白磷酸化被抑制，促进H2O2外排，从而减轻其对细胞的毒害
C.敲除AT1基因或降低其表达可提高禾本科农作物的耐盐碱能力
D.从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因是改良农作物抗逆性的有效途径
解析　分析题图可知，AT1蛋白存在时，AT1蛋白可与Gβ结合，抑制PIP2s蛋白磷酸化，H2O2外排能力弱；AT1蛋白缺陷时，AT1蛋白不能与Gβ结合，PIP2s蛋白被磷酸化，H2O2外排能力强。因此，细胞膜上PIP2s蛋白保持高磷酸化水平是其提高H2O2外排能力所必需的，A正确。PIP2s蛋白磷酸化被抑制时，会抑制H2O2外排，从而增强其对细胞的毒害，B错误。敲除AT1基因或降低其表达可使PIP2s蛋白保持高磷酸化水平，H2O2外排能力较强，可提高禾本科农作物的耐盐碱能力，C正确。基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。可以从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因，通过基因工程技术改良农作物的抗逆性，D正确。
2.[2022江苏]采用基因工程技术调控植物激素代谢，可实现作物改良。下列相关叙述不合理的是（ B　）
A.用特异启动子诱导表达iaaM（生长素合成基因）可获得无子果实
B.大量表达ipt（细胞分裂素合成关键基因）可抑制芽的分化
C.提高ga2ox（氧化赤霉素的酶基因）的表达水平可获得矮化品种
D.在果实中表达acs（乙烯合成关键酶基因）的反义基因可延迟果实成熟
解析　生长素可促进果实发育，用特异启动子诱导表达iaaM（生长素合成基因）可获得无子果实，A不符合题意；大量表达ipt（细胞分裂素合成关键基因）可使细胞分裂素含量升高，细胞分裂素含量升高，有利于芽的分化，B符合题意；赤霉素能促进细胞伸长，从而引起植株增高，提高ga2ox（氧化赤霉素的酶基因）的表达水平可促进赤霉素被氧化分解，使赤霉素含量降低，从而获得矮化品种，C不符合题意；乙烯有催熟作用，在果实中表达acs（乙烯合成关键酶基因）的反义基因可抑制乙烯的合成，果实成熟会延迟，D不符合题意。
3.[2021辽宁]腈水合酶（N0）广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域，但不耐高温。利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶（N1）。下列有关叙述错误的是（ D　）
A.N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一
B.加入连接肽需要通过改造基因实现
C.获得N1的过程需要进行转录和翻译
D.检测N1的活性时先将N1与底物充分混合，再置于高温环境
解析　据题意可知，利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶（N1），故N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一，A正确；改造蛋白质的结构需要通过改造基因来实现，B正确；利用蛋白质工程技术获得N1的过程涉及转录和翻译，C正确；检测N1的活性时，应先将N1置于高温环境中，再将其与底物充分混合，D错误。
4.[2024重庆联考]蛋白质工程是基因工程的延伸，下列关于蛋白质工程的叙述，错误的是（ A　）
A.通过蛋白质工程改造后的蛋白质的性状不可以遗传
B.蛋白质工程和基因工程都需要构建基因表达载体
C.蛋白质工程需要限制酶、DNA连接酶和载体等工具
D.蛋白质工程经常要建立蛋白质高级结构的三维模型
解析　蛋白质工程是通过对基因进行修饰改造或重新合成，从而改造蛋白质进而改造性状，其本质是通过基因控制性状，故可遗传，A错误；蛋白质工程通过对基因进行修饰改造或重新合成，然后进行基因表达，同基因工程一样，都需要构建基因表达载体，B正确；蛋白质工程需要限制酶、DNA连接酶和载体等工具，C正确；蛋白质工程先要根据预期的蛋白质功能设计建立蛋白质高级结构的三维模型，D正确。
5.[2023东莞模拟]干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，可以用于治疗癌症，但体外保存相当困难。如图是利用蛋白质工程设计生产干扰素的流程图，据图分析下列叙述错误的是（ D　）
A.图中构建新的干扰素模型的主要依据是新的干扰素的预期功能
B.图中新的干扰素基因必须插入质粒上的启动子和终止子之间才能表达
C.图中改造干扰素结构的实质是改造干扰素基因的结构
D.图中各过程并没有涉及基因工程技术
解析　构建新的干扰素模型的主要依据是新的干扰素的预期功能，A正确；新的干扰素基因必须插入质粒上的启动子和终止子之间才能表达，B正确；改造干扰素结构的实质是对干扰素基因的结构进行改造，C正确；题图中从“人工合成DNA”到“在受体细胞中表达”的过程运用了基因工程技术，D错误。
6.[2024湖北联考]科学家利用基因工程培育出了能产生乙肝病毒蛋白质的西红柿，被称为“西红柿乙肝疫苗”。具体操作：将乙肝抗原基因M导入农杆菌，然后利用农杆菌将基因M导入西红柿细胞。实验显示小白鼠连续五周吃这样的西红柿，体内产生了抗乙肝病毒的抗体，下列叙述错误的是（ B　）
A.实验过程中用PCR技术对基因M进行扩增，需要两种引物
B.含基因M的重组Ti质粒必须插入到西红柿细胞的染色体DNA上
C.即使基因M在西红柿中成功表达，也要进行个体生物学水平的鉴定
D.“西红柿乙肝疫苗”成本相对较低
解析　构建基因表达载体前需要对基因M进行扩增，运用PCR技术扩增基因M时，需要两种引物结合基因M的两条链从而合成相应子链，A正确；含基因M的T－DNA插入到西红柿染色体DNA上，才能稳定存在和表达，而不是整个Ti质粒必须插入到西红柿细胞的染色体DNA上，B错误；即使基因M在西红柿中成功表达，也必须进行个体生物学水平的鉴定，来确定实际效果，C正确；西红柿种植容易，成本低，D正确。
7.[2022广东，12分]“绿水逶迤去，青山相向开。”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气（含CO2等一碳温室气体，多来自高污染排放企业）为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。
回答下列问题：
（1）研究者针对每个需要扩增的酶基因（如图）设计一对　引物　，利用PCR技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。
（2）研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是　作为标记基因，筛选含有目的基因的受体细胞　，终止子的作用是　终止转录，使转录在所需要的地方停下来　。
（3）培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是　二氧化碳等气体用于大量合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长　，此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
（4）这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了　废物的资源化　，体现了循环经济的特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于　不仅不排放二氧化碳，还可以消耗工业废气中的二氧化碳　，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
解析　（1）利用PCR技术扩增目标酶基因的前提是根据目标酶基因两端的碱基序列设计一对引物。（2）基因表达载体中，抗生素抗性基因作为标记基因，可用于鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。终止子相当于一盏红色信号灯，可使转录在所需要的地方停下来。（3）重组梭菌可大量表达题述酶蛋白，在这些酶蛋白的作用下，二氧化碳等气体用于大量合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长，所以重组梭菌大量表达题述酶蛋白会导致其生长迟缓。（4）根据题意可知，这种生产高附加值化工产品的新技术，以高污染排放企业排出的二氧化碳等一碳温室气体为原料生产丙酮，实现了废物的资源化，体现了循环经济的特点。从“碳中和”的角度看，利用该技术生产丙酮的过程中不仅不排放二氧化碳，还可以消耗工业废气中的二氧化碳，有利于减缓温室效应，并实现较高的经济效益，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
8.[2022湖南改编]水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题：
（1）蛋白质工程流程如图所示，物质a是　多肽链　，物质b是　mRNA　。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是　密码子的简并　。
（2）蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因常用PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是　DNA半保留复制　。
（3）将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的　种类　（填“种类”或“含量”）有关，其活性不同的原因是　酶处理后形成的肽中氨基酸的种类、数目和排列顺序不同　。
（4）若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路：　取四支试管，分别加入等量的生理盐水、蛋白质工程改造后的水蛭素、水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素，再向四支试管中各加入等量的新鲜血液，观察四支试管中血液的凝血情况　。
解析　（1）蛋白质工程的流程一般为预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。密码子的简并指的是同一种氨基酸可以由几种不同的密码子决定。（3）由题图可知，将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，水解产物中的肽含量差别不大，但抗凝血活性差别较大，推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关。两种处理后酶解产物中氨基酸的种类、数目和排列顺序不同，从而导致两种处理后抗凝血活性有差异。
9.[2023豫北名校联考]α1－抗胰蛋白酶缺乏症是一种单基因遗传病，患者会出现肺气肿及其他疾病，严重者甚至死亡，可采用注射α1－抗胰蛋白酶的方法来缓解患者的症状。科研团队决定结合如图所示流程，运用蛋白质工程设计、制造出全新的α1－抗胰蛋白酶，同时结合基因工程和胚胎工程进行扩大生产。
回答下列问题：
（1）①～③过程属于蛋白质工程，仅从③过程看，由氨基酸序列获得的核酸序列　不是　（填“是”或“不是”）唯一的，原因是　密码子的简并（或一种氨基酸可对应多种密码子）　。
（2）基因工程的核心是构建基因表达载体，基因表达载体除含目的基因外，还必须有启动子、　终止子、标记基因　（填两种）等。可用　显微注射　技术将基因表达载体导入受精卵中。
（3）⑧过程中，卵母细胞要在体外人工培养成熟后才能与　获能　的精子受精。为提高培育成功率，进行⑨过程之前，要对提供卵母细胞的雌性动物和受体动物进行　同期发情　处理。
（4）欲通过乳腺生物反应器生产预期α1－抗胰蛋白酶，则构建基因表达载体时所用的启动子应为　乳腺蛋白基因的启动子　，且在⑧过程之前，要除去含　Y　（填“X”或“Y”）染色体的精子。
解析　（1）因为密码子的简并，所以由氨基酸序列得到的mRNA的碱基序列不是唯一的，再通过逆转录得到的核酸序列也不是唯一的。（2）基因表达载体上一般有启动子、终止子、标记基因（如抗生素抗性基因）、目的基因等。将目的基因导入受体细胞可以采用农杆菌转化法（导入植物细胞）、Ca2＋处理法（导入微生物细胞）、显微注射法（导入动物细胞）等。（3）采集的卵母细胞要在体外经人工培养成熟后才能与获能的精子受精。进行胚胎移植前，需要使供体动物和受体动物生殖器官的生理变化相同，以保证胚胎能够移植成功，因此进行⑨过程之前，需要对受体动物和提供卵母细胞的雌性动物进行同期发情处理。（4）利用乳腺生物反应器生产药物时，需要让目的基因在乳腺细胞中表达，因此启动子应该用乳腺蛋白基因的启动子。由于只有雌性动物才可以表达出乳腺蛋白，所以在体外受精之前可除去含Y染色体的精子，使受精卵的性染色体组成为XX。
10.[2023宿迁检测]一种天然蛋白t-PA能高效降解因纤维蛋白凝聚而成的血栓，但是心梗患者注射大剂量的t-PA会诱发颅内出血。研究证实，将t-PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低其诱发出血的副作用。据此，先对天然t-PA基因的碱基序列进行改造，再采取传统的基因工程方法表达该改造后的基因，可制造出性能优异的改良t-PA蛋白。如图1表示相关的目的基因、载体及限制酶识别序列和切割位点，pCLY11为质粒，请回答下列问题：
图1
（1）通过改造t-PA基因制造出性能优异的改良t-PA蛋白的过程称为　蛋白质　工程。
（2）若改造后的t-PA基因的黏性末端如图1所示，则需要选用限制酶　Xma Ⅰ和Bgl　Ⅱ　切割质粒pCLY11，保证质粒与t-PA改良基因高效连接。再用DNA连接酶催化形成　磷酸二酯　键，构建重组质粒。
（3）以大肠杆菌作为受体细胞，在含新霉素的培养基中形成菌落的受体细胞并非都是目的菌株，原因是　导入未连接目的基因的质粒（或pCLY11或空质粒或普通质粒）的大肠杆菌也可以在这种培养基上生长　。成功获取能生产改良t-PA蛋白的工程菌株后，利用　液体　（填“固体”或“液体”）培养基在发酵罐中进行大量生产。
（4）除了用工程菌株，还可以用图2所示方法从转基因牛乳汁中获得改良t-PA蛋白：
图2
过程②常用的方法是　显微注射法　；在过程④前需要取囊胚的　滋养层　细胞做DNA分析进行性别鉴定。
解析　（1）对天然的t-PA基因进行改造，以制造出性能优异的改良t-PA蛋白的技术称为蛋白质工程。（2）根据碱基互补配对原则，t-PA基因的左端黏性末端为CCGG-，可用Xma Ⅰ酶切得到，t-PA基因的右端黏性末端为GATC-，可用Bgl Ⅱ酶切得到，质粒需要用相同的酶进行酶切以得到与目的基因相同的黏性末端，因此需选用限制酶Xma Ⅰ和Bgl Ⅱ切割质粒pCLY11。通过DNA连接酶连接DNA片段之间的磷酸二酯键，构建重组质粒。（3）导入未连接目的基因的质粒的大肠杆菌也可以在含新霉素的培养基中生长，因此在含新霉素的培养基中形成菌落的受体细胞并非都是目的菌株（含有目的基因的大肠杆菌）。液体培养基常用于扩大培养，因此利用液体培养基在发酵罐中进行大量生产。（4）过程②表示将目的基因导入受体细胞，导入动物细胞常用显微注射法。囊胚期细胞逐渐分化，内细胞团将来发育成胎儿的各种组织，滋养层细胞将发育成胎膜和胎盘，做DNA分析进行性别鉴定时常取囊胚的滋养层细胞。
11.[2023南京调研]人胰岛素基因表达的最初产物是一条肽链构成的前胰岛素原，经图1所示过程形成具生物活性的胰岛素。此后科学家又提出了利用基因工程改造大肠杆菌生产人胰岛素的两种方法：AB法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素；BCA法是利用胰岛B细胞中的mRNA得到胰岛素基因，表达出胰岛素原后再用特定酶切掉C肽段。这两种方法使用同一种质粒作为载体。请据图分析并回答下列问题：
（1）在人体胰岛B细胞内，图1中前胰岛素原形成具生物活性的胰岛素过程中参与的细胞器有　内质网、高尔基体和线粒体　。
（2）由于密码子的　简并　，AB法中人工合成的两种DNA片段均有多种可能的序列。　AB和BCA　（填“AB”“BCA”或“AB和BCA”）法获取的目的基因中不含人胰岛素基因启动子。
（3）图2是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。为使目的基因与载体正确连接，在设计PCR引物时可添加限制酶　Xho Ⅰ和Mun Ⅰ　的识别序列。通过上述方法获得人的胰岛素基因后，需要通过PCR技术进行扩增，已知胰岛素基因左端①处的碱基序列为－CCTTTCAGCTCA－，则其中一种引物设计的序列是
5'　－CTCGAGCCTTTCAGCTCA－　3'。
（4）β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。经Ca2＋处理的大肠杆菌与重组质粒混合培养一段时间后，采用　稀释涂布平板　法将大肠杆菌接种到添加了　氨苄青霉素和X-gal　的培养基上筛选出　白　色的菌落，即工程菌种。
解析　（1）胰岛素属于分泌蛋白，前胰岛素原形成具生物活性的胰岛素过程中参与的细胞器有内质网、高尔基体和线粒体。（2）由于密码子的简并，一种氨基酸可对应几种密码子，则相应的DNA片段就会有多种可能序列。结合题干信息可知，AB法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素；结合题干信息可知，BCA法是从人体胰岛B细胞中获取mRNA，启动子在非编码区，不被转录和翻译，因此，以肽链或mRNA为模板合成的DNA分子都不具有启动子，即AB和BCA法获取的目的基因中均不含人胰岛素基因启动子。（3）分析图2，Sal Ⅰ 和Nhe Ⅰ 限制酶会破坏目的基因，EcoR Ⅰ 会破坏标记基因，所以在设计PCR引物时可添加限制酶Xho Ⅰ和Mun Ⅰ的识别序列。已知胰岛素基因左端①处的碱基序列为
－CCTTTCAGCTCA－，在设计PCR引物时需要添加限制酶Xho Ⅰ和Mun Ⅰ 的识别序列，根据两种酶在质粒上的位置可知，Xho Ⅰ的识别序列需要添加在目的基因左侧，Mun Ⅰ的识别序列需要添加在目的基因右侧，由于DNA合成时新链的延伸方向是5'→3'，即其中一种引物与模板链3'端（①处互补的位置）碱基互补配对，同时该引物序列需要包含Xho Ⅰ的识别序列，所以其中一种引物设计的序列是5'－CTCGAGCCTTTCAGCTCA－3'。（4）常见的微生物接种方法有稀释涂布平板法和平板划线法，其中稀释涂布平板法可使获得的菌落均匀分布。由于重组质粒中含有氨苄青霉素抗性基因，成功导入重组质粒的大肠杆菌可以在含有氨苄青霉素的培养基上存活下来，而未导入的则会死亡。将目的基因导入微生物细胞常用的方法是Ca2＋处理法。目的基因的插入位置破坏了LacZ基因的结构，不能产生β-半乳糖苷酶，底物X-gal不会被分解，所以筛选导入重组质粒的大肠杆菌时，在添加了氨苄青霉素和X-gal的培养基上应选择白色的菌落。

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