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第十四单元 发酵工程
1. 发酵：
利用微生物，在适宜的条件下，将原料通过微生物的代谢转化为人类所需要的产物的过程。
2. 腐乳制作的原理
菌种 青霉、毛霉、曲霉、酵母等，主要是毛霉
代谢类型 异养需氧型
繁殖方式 孢子生殖
前期发酵 主要是毛霉等微生物生长。需要满足微生物生长所需要的适宜的温度、充足的氧气、一定的湿度
后期发酵 是微生物生长产生的酶发挥作用的过程。需要抑制微生物的生长，主要是控制高盐、无氧等条件，同时加入酒和香辛料
3. 腐乳的制作流程
让豆腐上长出毛霉→加盐腌制→加卤汤装瓶→密封腌制。
4.泡菜制作的原理
（1）菌种：乳酸菌。
分布：广泛分布在空气、土壤、植物体表、人或动物的肠道等处。
代谢类型：异养厌氧型。
常见种类：乳酸链球菌和乳酸杆菌。其中乳酸杆菌常用于生产酸奶。
（2）发酵原理：乳酸菌在无氧条件下，将葡萄糖分解为乳酸。
5.泡菜制作的实验设计
（1）制作流程
（2）准备材料
选择泡菜坛：选用火候好、无裂纹、无砂眼、坛沿深、盖子吻合好的泡菜坛。
选择原料：质地鲜嫩，肉丰富，无虫咬，无烂痕，无斑点。
（3）制作过程
原料处理：将鲜菜修整、清洗、阳光下晾晒到菜表皮萎蔫时收起，切成条状或片状。
配制盐水：按照清水与盐的质量比为4∶1的比例配制盐水，并将盐水煮沸冷却。
装坛：将经过预处理的新鲜蔬菜混合均匀，装入泡菜坛中，装至半坛时放入香辛料，继续装到八成满，再徐徐注入配制好的盐水，使盐水没过全部菜料，盖好坛盖。
封坛发酵：向坛盖边沿的水槽中注满水，以保证坛内乳酸菌发酵所需的无氧环境。要注意经常补充水槽中的水。
成品：将封好的坛子，放在室温环境中约15天，便可制成清脆爽口的泡菜。
（4）腌制条件：在腌制过程中，要控制腌制的时间、温度和食盐的用量。温度过高、食盐用量过低、腌制时间过短，容易造成细菌大量繁殖，亚硝酸盐含量增加。
6.果酒的制作原理
菌种：酵母菌。
代谢类型：兼性厌氧型。
最适生长温度：20℃左右。
7.果酒发酵原理：
在有氧条件下，进行有氧呼吸，大量繁殖。反应式：C6H12O6＋6O2→6CO2＋6H2O。
在无氧条件下，进行酒精发酵，产生酒精。反应式：C6H12O6→2C2H5OH＋2CO2。
（3）菌种来源：自然发酵过程中，来源于附着在葡萄皮上的野生型酵母菌。
（4）果醋的制作原理
菌种：醋酸菌。
代谢类型：需氧型。
最适生长温度：30～35℃。
（5）果醋发酵原理：
当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸。
当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。反应简式：C2H5OH＋O2―→CH3COOH＋H2O。
8.果醋和果酒的制作流程
（1）实验流程
（2）实验装置
充气口：在醋酸发酵时连接充气泵进行充气；
排气口：排出酒精发酵时产生的CO2；
出料口：用来取样。
（3）发酵条件
果酒制作 果醋制作
温度 18～25℃ 30～35℃
时间 10～12d 7～8d
通气 先通气后密封，或预留约1/3的空间 始终通气
（4）操作要求
器具的清洗、消毒：榨汁机要洗净晾干，发酵瓶要清洗干净并用体积分数为70%的酒精消毒。
材料的选择和处理：选择新鲜的葡萄，先用清水冲洗1～2遍除去污物后，再去枝梗。
榨汁装瓶：将冲洗干净并除枝梗的葡萄放入榨汁机榨取葡萄汁，然后将葡萄汁装入发酵瓶，要留大约1/3的空间，并封闭充气口。
发酵：
①制葡萄酒的过程中，将温度严格控制在18～25℃，时间控制在10～12d，每天定时排出发酵产生的CO2，10d后开始从出料口抽样，监测酒精浓度或菌体数量。
②制葡萄醋的过程中，用充气泵不断从充气口泵入空气，温度严格控制在30～35℃，发酵7～8d，即可制成果醋。
酒精检测
①检测试剂：重铬酸钾。
②检测条件：酸性条件。
③实验现象：呈现灰绿色。
9.培养基的配制
（1）培养基的概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质——培养基，用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
（2）培养基的分类：按照物理性质不同分为两类。
液体培养基：呈液体状态的培养基，不加入凝固剂（如琼脂）。
固体培养基：呈固体状态的培养基，加入凝固剂（如琼脂）。
（3）营养组成：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，此外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。
（4）培养基特殊需求：
培养乳酸杆菌时，在培养基中添加维生素。
培养霉菌时，将培养基调至酸性。
培养细菌时，将培养基调至中性或弱碱性。
培养厌氧微生物时，需要提供无氧的条件。
10.无菌技术
关键：防止杂菌污染。
目的：
（1）可防止实验室的培养物被其他微生物污染。
（2）有效避免操作者自身被微生物感染。
无菌技术的选择原则：
（1）考虑效果：灭菌的效果比消毒要好。
（2）考虑操作对象的承受能力：活体生物材料、操作者的手等只能采用消毒的方法，而不能采用灭菌的方法。
11.消毒与灭菌：
（1）概念：
消毒：使用较为温和的物理、化学或生物等方法仅杀死物体表面或内部的部分微生物（不包括芽孢和孢子）。
灭菌：使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物（包括芽孢和孢子）。
（2）类型
消毒 灭菌
常用方法 煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法 灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌
适用对象 操作空间、操作者双手等 接种环、接种针、玻璃器皿、培养基等
12.微生物的纯培养
概念：由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。
酵母菌的纯培养：
（1）纯培养的原理：设法在培养基上得到由单个微生物繁殖形成的纯培养物（单菌落）。
（2）纯培养方法：平板划线法和稀释涂布平板法。
（3）纯培养过程
配制培养基：
灭菌：培养基转移至锥形瓶，加棉塞，包上牛皮纸，如图所示，然后放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌，培养皿包扎后放入干热灭菌箱内灭菌。
倒平板：待培养基冷却到50 ℃左右时，在酒精灯火焰附近进行。具体操作过程：
（4）平板划线法接种和分离酵母菌
平板划线法：通过接种环在固体培养基表面连续划线操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。
平板划线法结果：平板划线示意图（A）及培养后菌落分布示意图（B）如下图所示。
几次灼烧的目的：
灼烧时期 目的
第一次操作（取菌种前） 杀死接种环上原有的微生物，避免污染培养物
每次划线之前 杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线菌种数目减少
划线结束 杀死接种环上残存的菌种，避免微生物污染环境和感染操作者
（5）培养酵母菌：接种和未接种的平板在温度适宜的恒温箱中培养。
13.选择培养基
实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。
选择培养基概念：在微生物学中，允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
选择培养基配方的设计：
（1）原理：分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解产生NH3。
（2）培养基配方设计：以尿素为唯一氮源的选择培养基。
14.微生物的选择培养：对样品进行充分稀释，然后将菌液涂布到制备好的选择培养基上。
15.稀释涂布平板法的操作过程：
（1）系列梯度稀释操作：
（2）涂布平板操作。
取菌液：取0.1mL菌液，添加到培养基表面。
涂布器灭菌：取出浸在酒精中的涂布器，放在火焰上燃烧，酒精燃尽后，冷却涂布器。
涂布过程：用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面，涂布时可转动培养皿，使菌液分布均匀。
培养：待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入恒温培养箱中培养，观察。
16.微生物的数量测定
稀释涂布平板法
（1）统计依据。
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
（2）操作。
一般选择菌落数为30～300的平板进行计数。
选用一定稀释范围的样品液进行培养，在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求平均值。
（3）注意问题：统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
显微镜直接计数
（1）原理：此法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定体积的样品中微生物的数量。
（2）方法：显微镜下观察，细菌计数板或血细胞计数板计数。
（3）计算公式：
每毫升原液所含细菌数=每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数
（4）缺点：统计的结果一般是活细菌和死细菌的总和，计算结果比实际值偏大。
17.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
（1）实验流程示意图：
（2）实验操作过程：
流程 具体操作 操作提示
土壤取样 先铲去表层土，取距地表 3～8 cm的土壤层，将样品装入纸袋中 ①适宜在富含有机质，酸碱度接近中性的潮湿土壤中取样②取样用的铁铲和取样的纸袋使用前都需要灭菌
制备培养基 分别配制牛肉膏蛋白胨培养基和以尿素为唯一氮源的选择培养基 牛肉膏蛋白胨培养基作为对照组，用来判断选择培养基是否具有选择的作用
样品的稀释和涂布 ①火焰旁称取土壤样本②将稀释倍数为103～107的稀释液涂布平板。每个稀释度至少涂布三个平板作为重复组 ①注意无菌操作 ②对所用的平板、试管做好标记③初次实验对于稀释的范围没有把握，可选择一个较为宽泛范围103～107倍的稀释液
培养、观察和计数 ①将涂布好的平板和空白平板放在适宜温度下的培养箱中倒置培养②每隔24 h统计一次菌落数目，比较牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录③当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300 的平板进行计数 ①空白平板作为对照，检测培养基制备是否合格②观察时还要记录不同菌落的形状、大小、颜色等③在同一稀释度下，至少对3个平板进行计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中活菌的数目
18.发酵工程：利用微生物的特定功能，通过现代工程技术，规模化生产对人类有用的产品。
19.发酵工程与传统发酵技术相比的特点
主要以可再生资源为原料；反应条件温和；环境污染较少；能生产目前不能生产或通过化学方法生产困难的性能优异的产品；投资较少。
20.发酵工程的基本环节
（1）菌种的选育（诱变育种、基因工程和细胞工程）
（2）扩大培养
（3）培养基的配制
（4）培养基和设备的灭菌
（5）接种（注意防止杂菌的污染，发酵罐冷却后才可加入）
（6）发酵罐内发酵——中心环节
需严格控制温度、pH、溶氧、通气量与转速等发酵条件。
（7）产品的分离和提纯
菌体可采用过滤、沉淀等方法分离。
代谢产物可采用蒸馏、萃取、离子交换等方法提取。
21.发酵工程中菌种的选择
如果生产的是微生物直接合成的产物：可以从自然界中先分离出相应的菌种，再用物理或化学的方法使菌种产生突变，从突变个体中筛选出符合生产要求的优良菌种。
如果生产的是一般微生物不能合成的产品：可用基因工程、细胞工程的方法

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