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周测5　重组DNA技术的基本工具、基因工程的基本操作程序
一、选择题(本题包括20小题，每小题3分，共60分，每小题只有一个选项符合题目要求。)
1．下列叙述符合基因工程概念的是(　　)
A．在细胞内将DNA进行重组，赋予生物新的遗传特性
B．将人的干扰素基因重组到质粒上后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株
C．用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株
D．自然界中天然存在的T2噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上
2．(2024·洛阳高二期中)质粒是基因工程中的“分子运输车”，其结构与功能相适应，下列说法错误的是(　　)
A．质粒上含有一个至多个限制酶切割位点，便于外源DNA插入
B．质粒可以携带外源DNA片段进入受体细胞并进行自我复制
C．质粒上常具有某些特殊的标记基因
D．目前常用的质粒主要来自噬菌体或动植物病毒
3．(2024·鞍山高二月考)基因工程需要三种工具——限制酶、DNA连接酶和载体。下列相关叙述错误的是(　　)
A．限制酶主要从原核生物中分离纯化得到，具有特异性
B．T4 DNA连接酶可连接黏性末端和平末端，不具有专一性
C．质粒是常用的载体，是一种环状双链DNA分子
D．不同限制酶切割后产生的DNA片段可能被某种DNA连接酶“缝合”
4．(2024·运城高二月考)有3种限制酶对DNA分子的识别序列和剪切位点(图中箭头所示，酶切后均形成黏性末端)依次为限制酶1：—↓GATC—；限制酶2：—CCGC↓GG—；限制酶3：—G↓GATCC—。下列叙述错误的是(　　)
A．不同的限制酶有不同的识别序列和切割位点
B．限制酶2和限制酶3识别的序列都由6个核苷酸组成
C．能够识别和切割RNA分子的酶只有限制酶2
D．限制酶1和限制酶3剪出的黏性末端相同
5．(2024·石家庄高二月考)如图表示“DNA的粗提取与鉴定”实验的基本流程，下列相关叙述错误的是(　　)
①取材→②破碎细胞→③获得滤液→④去除杂质→⑤进一步提纯→⑥DNA鉴定
A．本实验使用了体积分数为95%的酒精
B．步骤①中可以使用猪的肝细胞作为实验材料
C．步骤③中可以使用纱布对研磨液进行过滤，并获取上清液
D．步骤⑥向试管中加入二苯胺试剂后静置5 min后即可呈现蓝色
6．如图为不同限制酶识别的序列及切割位置(箭头所指)，下列叙述错误的是(　　)
A．图示4种限制酶均不能够识别和切割RNA分子内的核苷酸序列
B．若DNA上的碱基随机排列，限制酶NotⅠ切割位点出现频率较其他三种限制酶高
C．酶切时同时使用EcoRⅠ、BamHⅠ两种限制酶是为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化
D．用限制酶BglⅡ切出的目的基因与限制酶BamHⅠ切割的质粒重组后，不能再被这两种酶切开
7．土壤农杆菌侵染植物细胞时，其Ti质粒上的T－DNA片段可转移到植物细胞的基因组中。以Ti质粒作载体，利用农杆菌转化法培育转基因植物。下列相关叙述正确的是(　　)
A．目的基因应插入T－DNA片段外，以防止破坏T－DNA
B．用Ca2＋处理农杆菌，以利于其侵染植物细胞
C．Ti质粒是一种环状DNA分子，属于农杆菌的拟核DNA
D．T－DNA可介导外源DNA整合到植物细胞的染色体DNA上
8．(2024·广州高二月考)引物在极大程度上决定了PCR的成败，下列关于引物的说法，不正确的是(　　)
A．PCR和生物体内的DNA合成都需要引物，PCR引物一般是单链DNA
B．若引物的C/G碱基含量相对较高，PCR复性步骤的温度需要适当升高
C．在PCR的复性步骤，两种引物分别结合在模板链的3′端和5′端
D．若初始有10个胰岛素基因，PCR中进行10轮循环，至少需要20 460个引物分子
9．(2024·天津市南开区高二期中)下列关于PCR扩增DNA片段及电泳鉴定的叙述，正确的是(　　)
A．PCR反应中，复性阶段需要DNA聚合酶连接磷酸二酯键
B．PCR反应中，延伸阶段需要反应体系中的ATP提供能量
C．电泳时，DNA分子在凝胶中的迁移速率与DNA的大小和构象等有关
D．电泳时，将PCR产物、核酸染料和电泳指示剂混合后注入凝胶加样孔
10．(2024·济宁高二月考)将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88号中，培育耐盐碱海水稻新品种。如图PCR扩增OsMYB56时需要添加引物，应选用的引物组合为(　　)
A．5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TCTGTTGAAT－3′
B．5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TAAGTTGTCT－3′
C．5′－ATTCAACAGA－3′和5′－ATCATCCAAG－3′
D．5′－ATTCAACAGA－3′和5′－GAACCTACTA－3′
11．受伤的双子叶植物能分泌某些酚类物质诱导农杆菌Ti质粒中的Vir基因区段表达，该表达产物能诱导Ti质粒产生一条新的T－DNA单链分子。此单链分子进入植物细胞并整合到染色体后， 通过碱基互补配对形成双链。将目的基因插入T－DNA中，可使目的基因进入植物细胞。下列相关叙述错误的是(　　)
A．借助农杆菌将目的基因导入水稻细胞时需添加酚类物质
B．T－DNA的整合具有随机性，需经过筛选获得符合要求的转化苗
C．目的基因能够表达依赖于T－DNA上的起始密码子和终止密码子
D．农杆菌中合成新的T－DNA单链需要农杆菌细胞提供四种脱氧核糖核苷酸
12．基因工程中因受体细胞不同，目的基因导入的方法也不同。下列叙述不正确的是(　　)
A．将目的基因导入棉花细胞内可用花粉管通道法
B．将目的基因导入老鼠细胞内常用显微注射技术
C．将目的基因导入大肠杆菌内常用Mg2＋处理法
D．将目的基因导入双子叶植物细胞内常用农杆菌转化法
13．(2024·汉中高二期末)研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。以下说法正确的是(　　)
A．目的基因的筛选与获取是培育转基因生物的核心工作
B．海鱼的抗冻蛋白基因afp是培育抗冻番茄用到的目的基因
C．构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和解旋酶
D．只要检测出番茄细胞中含有afp基因就代表抗冻番茄培育成功
14．C基因编码具有高度特异性杀虫活性的C蛋白，V基因编码的V蛋白是结构和作用机理不同于C蛋白的杀虫蛋白。利用C－V融合基因和载体(如图)，获得具有高抗虫性的转基因玉米。下列叙述错误的是(　　)
A．此载体中的T－DNA可转移至植物细胞基因组中
B．可采用含卡那霉素的培养基筛选转基因植株
C．可从分子水平、个体水平对转基因玉米进行检测与鉴定
D．与转一种抗虫基因相比，此玉米可延缓害虫抗性基因频率的增加
15．如图为利用基因工程培育抗虫植物的示意图。下列相关叙述正确的是(　　)
A．图示②→③是基因工程的核心步骤
B．③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上
C．④的染色体上若含有抗虫基因，⑤可能不具备抗虫性状
D．检测⑤的抗虫性状，常用的方法是检测其是否含有Bt蛋白
16．(2024·南通高二月考)下列关于“DNA的粗提取与鉴定”“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述，错误的是(　　)
A．将预冷的酒精加入上清液后，出现的白色丝状物为粗提取的DNA
B．用二苯胺鉴定DNA时，需沸水浴加热
C．将扩增得到的PCR产物与含指示剂的电泳缓冲液混合，注入加样孔
D．凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来
17．(2024·徐州高二期中)科学家通过改变一种名为NR2B的基因研制出了转基因超级小鼠Hobbie－J，Hobbie－J比普通老鼠更加聪明，大脑运转更加迅速，它能够轻松完成迷宫任务。下列关于Hobbie－J产生过程的叙述，正确的是(　　)
A．通过PCR技术扩增NR2B基因的前提是已知该基因全部的核苷酸序列
B．改变后的NR2B基因作为目的基因，可直接注入小鼠受精卵内
C．启动子和终止密码子均在NR2B基因转录时发挥作用
D．可采用PCR等技术检测改变后的NR2B基因是否导入小鼠体内
18．(2024·南充高二月考)用限制酶EcoRⅤ、MboⅠ单独或联合完全切割同一种质粒，得到的DNA片段长度如图所示。下列相关分析不正确的是(　　)
A．限制酶EcoRⅤ、MboⅠ识别的序列不同，体现了酶的专一性
B．该质粒上含有一个限制酶EcoRⅤ的识别序列
C．该质粒上含有两个限制酶MboⅠ的识别序列
D．用上述两种酶联合切割多个质粒后都能得到三个不同长度的DNA片段
19．RT－PCR是将RNA逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式反应相结合的技术，可利用此技术获取目的基因，具体过程如图所示。下列说法不正确的是(　　)
A．设计扩增目的基因的引物时需考虑目的基因两端的碱基序列
B．G/C含量高的引物在与模板链结合时，需要更高的温度
C．该技术用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度
D．过程Ⅰ需要加入缓冲液、原料、耐高温的DNA聚合酶和引物A等
20．(2024·杭州高二期中)如图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，其中tetR是四环素抗性基因、AmpR是氨苄青霉素抗性基因。图2表示重组质粒，甲、乙、丙为3种引物所在的位置。下列有关叙述错误的是(　　)
A．质粒P1经“酶处理”后平末端转变成黏性末端，有利于与目的基因片段的连接
B．质粒P2和目的基因片段可在DNA连接酶的作用下形成重组质粒
C．若受体微生物能在含有氨苄青霉素的培养基上生长，说明成功导入了重组质粒P3
D．用PCR鉴定筛选出的菌落中是否含正确插入目的基因的重组质粒，应选择引物乙和丙
二、非选择题(本题包括3小题，共40分。)
21．(14分)(2024·烟台高二月考)人体肝脏细胞中的乙醛脱氢酶2(ALDH2)是人体酒精代谢中的关键酶。如图表示利用基因工程生产ALDH2过程中使用的质粒及目的基因的部分结构，β-半乳糖苷酶(LacZ基因编码产生)能分解无色的X－gal产生蓝色物质。图中氨苄青霉素抗性基因、β-半乳糖苷酶基因、目的基因的序列中分别含有1种、5种、2种限制酶的识别序列及切割位点。
(1)构建基因表达载体时一般至少需要两种限制酶，以防止__________________和__________________。设计启动子的作用是__________________。
(2)为了使目的基因与载体能正确连接，应在扩增的目的基因A、B两端分别引入________和______________两种不同限制酶的识别序列。
(3)MunⅠ酶切后的末端与EcoRⅠ酶切后的末端能连接，原因是_______________________。
(4)以大肠杆菌为受体细胞，在筛选插入ALDH2基因成功的受体细胞时，除营养物质外，还要在培养基中加入的物质有________________________________________________。
22．(14分)普通棉花中β-甘露糖苷酶基因(GhMnaA2)表达出的3－甘露糖苷酶能催化半纤维素降解，使棉纤维长度变短。为了培育长绒棉，科研人员构建了反义GhMnaA2基因表达载体，获得了转基因长绒棉新品种，具体过程如图所示，SmaⅠ、NotⅠ、HindⅢ和BamHⅠ为酶切位点，LB为T－DNA左边界，RB为T－DNA右边界。回答下列问题：
(1)过程①中不用限制酶NotⅠ的原因是_________________________________________。
GhMnaA2的序列中包含内含子等序列，可增大重组质粒的分子量，使导入效率降低，请提出一个解决此问题的方案：________________________________________________________。
(2)过程②中在培养基中添加__________可将含有重组质粒的农杆菌筛选出来。反义表达载体T－DNA区段的________________________________片段整合到棉花细胞的染色体中，并在翻译过程中起作用。
(3)过程③中目的基因导入棉花细胞后，可采用__________技术从分子水平上检测目的基因是否插入染色体；个体水平上的检测为_________________________________。
(4)由图分析可知，转基因长绒棉棉纤维较普通棉棉纤维长的原因是_________________。
23．(12分)如图所示为A、B、C三种质粒和一个含目的基因D的DNA片段示意图。图中AmpR为氨苄青霉素抗性基因，tetR为四环素抗性基因，LacZ为蓝色显色基因，EcoRⅠ、PvuⅠ为两种限制酶，质粒上限制酶括号内的数字表示限制酶切割位点与复制原点的距离。请回答下列相关问题：
(1)据图分析，质粒A、C一般不能作为载体的理由分别是___________。若要获取目的基因，应该选用限制酶__________________切割。
(2)(4分)将图中的目的基因与质粒B进行重组。在基因工程的操作过程中，需要检查目的基因是否重组到质粒中，应使用限制酶__________________酶切重组质粒，完全酶切后，进行电泳检测。若电泳图谱中出现长度为1.1 kb和5.6 kb，或者______________kb和______________kb的片段，则可判断目的基因已插入质粒B中。
(3)若选择自身不含LacZ基因并对抗生素敏感的大肠杆菌作为受体细胞，则如何筛选成功导入重组质粒的受体细胞？_______________________________________________________。
目的基因能在大肠杆菌细胞内表达出相同的蛋白质，其遗传学基础是___________________。
参考答案及解析
一、选择题(本题包括20小题，每小题3分，共60分，每小题只有一个选项符合题目要求。)
1．下列叙述符合基因工程概念的是(　　)
A．在细胞内将DNA进行重组，赋予生物新的遗传特性
B．将人的干扰素基因重组到质粒上后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株
C．用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株
D．自然界中天然存在的T2噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上
答案　B
解析　基因工程是在生物体外将DNA进行重组，赋予生物新的遗传特性，A不符合题意；用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株，属于诱变育种，C不符合题意；T2噬菌体的DNA整合到细菌DNA上不是人为操作的，不属于基因工程的范畴，D不符合题意。
2．(2024·洛阳高二期中)质粒是基因工程中的“分子运输车”，其结构与功能相适应，下列说法错误的是(　　)
A．质粒上含有一个至多个限制酶切割位点，便于外源DNA插入
B．质粒可以携带外源DNA片段进入受体细胞并进行自我复制
C．质粒上常具有某些特殊的标记基因
D．目前常用的质粒主要来自噬菌体或动植物病毒
答案　D
解析　质粒上含有一个至多个限制酶切割位点，能够给外源DNA片段插入提供更多的选择，便于外源DNA片段插入，A正确；质粒上常具有某些特殊的标记基因，便于筛选含有目的基因的受体细胞，C正确；目前常用的质粒主要来自原核生物，病毒不含质粒，D错误。
3．(2024·鞍山高二月考)基因工程需要三种工具——限制酶、DNA连接酶和载体。下列相关叙述错误的是(　　)
A．限制酶主要从原核生物中分离纯化得到，具有特异性
B．T4 DNA连接酶可连接黏性末端和平末端，不具有专一性
C．质粒是常用的载体，是一种环状双链DNA分子
D．不同限制酶切割后产生的DNA片段可能被某种DNA连接酶“缝合”
答案　B
解析　限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的，能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，A正确；限制酶切割产生的DNA末端有黏性末端和平末端，其中T4 DNA连接酶既可以连接黏性末端，又可以连接平末端，具有特异性(专一性)，B错误；质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子，C正确。
4．(2024·运城高二月考)有3种限制酶对DNA分子的识别序列和剪切位点(图中箭头所示，酶切后均形成黏性末端)依次为限制酶1：—↓GATC—；限制酶2：—CCGC↓GG—；限制酶3：—G↓GATCC—。下列叙述错误的是(　　)
A．不同的限制酶有不同的识别序列和切割位点
B．限制酶2和限制酶3识别的序列都由6个核苷酸组成
C．能够识别和切割RNA分子的酶只有限制酶2
D．限制酶1和限制酶3剪出的黏性末端相同
答案　C
解析　限制酶具有专一性，一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且在特定部位切割DNA分子，即不同的限制酶有不同的识别序列和切割位点，A正确；限制酶2和限制酶3都能识别6个核苷酸序列，B正确；限制酶只能识别和切割DNA分子内一小段特定的核苷酸序列，C错误。
5．(2024·石家庄高二月考)如图表示“DNA的粗提取与鉴定”实验的基本流程，下列相关叙述错误的是(　　)
①取材→②破碎细胞→③获得滤液→④去除杂质→⑤进一步提纯→⑥DNA鉴定
A．本实验使用了体积分数为95%的酒精
B．步骤①中可以使用猪的肝细胞作为实验材料
C．步骤③中可以使用纱布对研磨液进行过滤，并获取上清液
D．步骤⑥向试管中加入二苯胺试剂后静置5 min后即可呈现蓝色
答案　D
解析　DNA不溶于酒精，但细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，本实验使用了体积分数为95%的酒精，目的是去除DNA中的残留杂质，获得较纯净的DNA，A正确；猪的肝细胞含有细胞核和众多的细胞器，步骤①中可以使用猪的肝细胞作为实验材料，B正确；步骤③中可以使用纱布对研磨液进行过滤，并获取上清液，上清液中含有DNA，C正确；步骤⑥中DNA鉴定时，向试管中加入二苯胺试剂后，应将试管置于沸水中加热5 min，待试管冷却后可观察到蓝色，D错误。
6．如图为不同限制酶识别的序列及切割位置(箭头所指)，下列叙述错误的是(　　)
A．图示4种限制酶均不能够识别和切割RNA分子内的核苷酸序列
B．若DNA上的碱基随机排列，限制酶NotⅠ切割位点出现频率较其他三种限制酶高
C．酶切时同时使用EcoRⅠ、BamHⅠ两种限制酶是为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化
D．用限制酶BglⅡ切出的目的基因与限制酶BamHⅠ切割的质粒重组后，不能再被这两种酶切开
答案　B
解析　由于限制酶NotⅠ识别的序列比其他三种限制酶的序列长，若DNA上的碱基随机排列，限制酶NotⅠ切割位点出现频率较其他三种限制酶低，B错误。
7．土壤农杆菌侵染植物细胞时，其Ti质粒上的T－DNA片段可转移到植物细胞的基因组中。以Ti质粒作载体，利用农杆菌转化法培育转基因植物。下列相关叙述正确的是(　　)
A．目的基因应插入T－DNA片段外，以防止破坏T－DNA
B．用Ca2＋处理农杆菌，以利于其侵染植物细胞
C．Ti质粒是一种环状DNA分子，属于农杆菌的拟核DNA
D．T－DNA可介导外源DNA整合到植物细胞的染色体DNA上
答案　D
解析　农杆菌的Ti质粒上的T－DNA可转移到受体细胞，并且整合到受体细胞的染色体DNA上，根据农杆菌的这一特点，目的基因应插入T－DNA片段中，通过农杆菌的转化作用，把目的基因整合到植物细胞染色体的DNA上，A错误，D正确；用Ca2＋处理农杆菌，有利于基因表达载体导入农杆菌，B错误；Ti质粒是一种环状DNA分子，独立于农杆菌拟核DNA之外，C错误。
8．(2024·广州高二月考)引物在极大程度上决定了PCR的成败，下列关于引物的说法，不正确的是(　　)
A．PCR和生物体内的DNA合成都需要引物，PCR引物一般是单链DNA
B．若引物的C/G碱基含量相对较高，PCR复性步骤的温度需要适当升高
C．在PCR的复性步骤，两种引物分别结合在模板链的3′端和5′端
D．若初始有10个胰岛素基因，PCR中进行10轮循环，至少需要20 460个引物分子
答案　C
解析　PCR和生物体内的DNA合成都需要引物，生物体内的DNA复制引物通常是RNA，PCR反应中引物一般是单链DNA，A正确；G与C之间有3个氢键，稳定性高，若引物的C/G碱基含量相对较高，PCR复性步骤的温度需要适当升高，B正确；在PCR的复性步骤，两种引物都结合在模板链的3′端，C错误；若初始有10个胰岛素基因，PCR中进行10轮循环，得到10×210＝10 240(个)DNA分子，共10 240×2＝20 480(条)链，由于初始的20条链不需要引物，故至少需要20 480－20＝20 460(个)引物分子，D正确。
9．(2024·天津市南开区高二期中)下列关于PCR扩增DNA片段及电泳鉴定的叙述，正确的是(　　)
A．PCR反应中，复性阶段需要DNA聚合酶连接磷酸二酯键
B．PCR反应中，延伸阶段需要反应体系中的ATP提供能量
C．电泳时，DNA分子在凝胶中的迁移速率与DNA的大小和构象等有关
D．电泳时，将PCR产物、核酸染料和电泳指示剂混合后注入凝胶加样孔
答案　C
解析　PCR反应中，复性阶段，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，延伸阶段，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶作用下，合成新的DNA链，A错误；PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，C正确；核酸染料在制备凝胶时加入，将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内，留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物，D错误。
10．(2024·济宁高二月考)将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88号中，培育耐盐碱海水稻新品种。如图PCR扩增OsMYB56时需要添加引物，应选用的引物组合为(　　)
A．5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TCTGTTGAAT－3′
B．5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TAAGTTGTCT－3′
C．5′－ATTCAACAGA－3′和5′－ATCATCCAAG－3′
D．5′－ATTCAACAGA－3′和5′－GAACCTACTA－3′
答案　A
解析　—为DNA链的5′端，—OH端为DNA链的3′端。进行PCR时，引物与模板链的3′端结合(DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸)，因此在扩增OsMYB56时需要添加的引物是5′—CTTGGATGAT—3′和5′—TCTGTTGAAT—3′，A正确。
11．受伤的双子叶植物能分泌某些酚类物质诱导农杆菌Ti质粒中的Vir基因区段表达，该表达产物能诱导Ti质粒产生一条新的T－DNA单链分子。此单链分子进入植物细胞并整合到染色体后， 通过碱基互补配对形成双链。将目的基因插入T－DNA中，可使目的基因进入植物细胞。下列相关叙述错误的是(　　)
A．借助农杆菌将目的基因导入水稻细胞时需添加酚类物质
B．T－DNA的整合具有随机性，需经过筛选获得符合要求的转化苗
C．目的基因能够表达依赖于T－DNA上的起始密码子和终止密码子
D．农杆菌中合成新的T－DNA单链需要农杆菌细胞提供四种脱氧核糖核苷酸
答案　C
解析　农杆菌容易侵染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有侵染能力，因为多数单子叶植物不能合成酚类化合物，借助农杆菌将目的基因导入水稻(单子叶植物)细胞时需添加酚类物质，A正确；目的基因能够表达依赖于T－DNA上的启动子和终止子，C错误。
12．基因工程中因受体细胞不同，目的基因导入的方法也不同。下列叙述不正确的是(　　)
A．将目的基因导入棉花细胞内可用花粉管通道法
B．将目的基因导入老鼠细胞内常用显微注射技术
C．将目的基因导入大肠杆菌内常用Mg2＋处理法
D．将目的基因导入双子叶植物细胞内常用农杆菌转化法
答案　C
解析　将目的基因导入大肠杆菌细胞时，一般先用 Ca2＋处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态，然后将重组基因表达载体导入其中。
13．(2024·汉中高二期末)研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。以下说法正确的是(　　)
A．目的基因的筛选与获取是培育转基因生物的核心工作
B．海鱼的抗冻蛋白基因afp是培育抗冻番茄用到的目的基因
C．构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和解旋酶
D．只要检测出番茄细胞中含有afp基因就代表抗冻番茄培育成功
答案　B
解析　基因表达载体的构建是培育转基因生物的核心工作，A错误；实验目的是获得抗冻的番茄品种，因此抗冻蛋白基因afp属于目的基因，B正确；构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶，不需要解旋酶，C错误；只有番茄具有抗冻性才能代表抗冻番茄培育成功，D错误。
14．C基因编码具有高度特异性杀虫活性的C蛋白，V基因编码的V蛋白是结构和作用机理不同于C蛋白的杀虫蛋白。利用C－V融合基因和载体(如图)，获得具有高抗虫性的转基因玉米。下列叙述错误的是(　　)
A．此载体中的T－DNA可转移至植物细胞基因组中
B．可采用含卡那霉素的培养基筛选转基因植株
C．可从分子水平、个体水平对转基因玉米进行检测与鉴定
D．与转一种抗虫基因相比，此玉米可延缓害虫抗性基因频率的增加
答案　B
解析　潮霉素抗性基因在T－DNA片段上，因此潮霉素抗性基因可作为标记基因，培养基中应加入潮霉素以检测玉米细胞中是否含有目的基因，B错误。
15．如图为利用基因工程培育抗虫植物的示意图。下列相关叙述正确的是(　　)
A．图示②→③是基因工程的核心步骤
B．③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上
C．④的染色体上若含有抗虫基因，⑤可能不具备抗虫性状
D．检测⑤的抗虫性状，常用的方法是检测其是否含有Bt蛋白
答案　C
解析　图示①→②为基因表达载体的构建，是基因工程的核心步骤，A错误；③→④用农杆菌侵染植物细胞，重组Ti质粒上的T－DNA整合到植物细胞的染色体DNA上，B错误；④的染色体上若含有抗虫基因，抗虫基因可能不能转录或不能翻译，或表达的蛋白质不具有生物活性，因此⑤可能不具备抗虫性状，C正确；转基因植株⑤含有Bt基因，能合成Bt蛋白杀死棉铃虫，要检测其抗虫性状，常用方法是抗虫接种试验，D错误。
16．(2024·南通高二月考)下列关于“DNA的粗提取与鉴定”“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述，错误的是(　　)
A．将预冷的酒精加入上清液后，出现的白色丝状物为粗提取的DNA
B．用二苯胺鉴定DNA时，需沸水浴加热
C．将扩增得到的PCR产物与含指示剂的电泳缓冲液混合，注入加样孔
D．凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来
答案　C
解析　DNA不溶于酒精，但细胞中的某些蛋白质溶解于酒精，因此将预冷的酒精加入上清液后，出现的白色丝状物为粗提取的DNA，A正确；鉴定DNA时，应先将丝状物溶解在2 mol/L的NaCl溶液中，再加入二苯胺试剂混合均匀，然后沸水中加热5 min，B正确；将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内，C错误。
17．(2024·徐州高二期中)科学家通过改变一种名为NR2B的基因研制出了转基因超级小鼠Hobbie－J，Hobbie－J比普通老鼠更加聪明，大脑运转更加迅速，它能够轻松完成迷宫任务。下列关于Hobbie－J产生过程的叙述，正确的是(　　)
A．通过PCR技术扩增NR2B基因的前提是已知该基因全部的核苷酸序列
B．改变后的NR2B基因作为目的基因，可直接注入小鼠受精卵内
C．启动子和终止密码子均在NR2B基因转录时发挥作用
D．可采用PCR等技术检测改变后的NR2B基因是否导入小鼠体内
答案　D
解析　通过PCR技术扩增NR2B基因的前提是掌握NR2B基因的两端的部分核苷酸序列，以便合成引物，A错误；改变后的NR2B基因作为目的基因，需要先构建基因表达载体，然后将构建好的基因表达载体通过一定方式进入小鼠受精卵内，B错误；启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，可用于驱动基因的转录，而终止密码子位于mRNA上，与基因的翻译过程有关，C错误。
18．(2024·南充高二月考)用限制酶EcoRⅤ、MboⅠ单独或联合完全切割同一种质粒，得到的DNA片段长度如图所示。下列相关分析不正确的是(　　)
A．限制酶EcoRⅤ、MboⅠ识别的序列不同，体现了酶的专一性
B．该质粒上含有一个限制酶EcoRⅤ的识别序列
C．该质粒上含有两个限制酶MboⅠ的识别序列
D．用上述两种酶联合切割多个质粒后都能得到三个不同长度的DNA片段
答案　D
解析　质粒为环状双链DNA分子，经限制酶EcoRⅤ单独切割后形成一条链状DNA，说明该酶在该质粒上有一个切割位点，B正确；限制酶MboⅠ单独切割，产生了两条链状DNA，说明该酶在该质粒上有两个酶切位点，C正确；由于不同的质粒的碱基排列顺序不一定相同，所以用上述两种酶联合切割多个质粒后不一定都能得到三个不同长度的DNA片段，D错误。
19．RT－PCR是将RNA逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式反应相结合的技术，可利用此技术获取目的基因，具体过程如图所示。下列说法不正确的是(　　)
A．设计扩增目的基因的引物时需考虑目的基因两端的碱基序列
B．G/C含量高的引物在与模板链结合时，需要更高的温度
C．该技术用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度
D．过程Ⅰ需要加入缓冲液、原料、耐高温的DNA聚合酶和引物A等
答案　D
解析　过程Ⅰ是逆转录过程，所以需要加入缓冲液、原料、逆转录酶和引物A等，D错误。
20．(2024·杭州高二期中)如图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，其中tetR是四环素抗性基因、AmpR是氨苄青霉素抗性基因。图2表示重组质粒，甲、乙、丙为3种引物所在的位置。下列有关叙述错误的是(　　)
A．质粒P1经“酶处理”后平末端转变成黏性末端，有利于与目的基因片段的连接
B．质粒P2和目的基因片段可在DNA连接酶的作用下形成重组质粒
C．若受体微生物能在含有氨苄青霉素的培养基上生长，说明成功导入了重组质粒P3
D．用PCR鉴定筛选出的菌落中是否含正确插入目的基因的重组质粒，应选择引物乙和丙
答案　C
解析　质粒P2和目的基因片段可在DNA连接酶的作用下形成重组质粒，B正确；成功导入重组质粒P3的受体细胞和导入普通质粒P0的受体细胞都能在含有氨苄青霉素的培养基上生长，C错误。
二、非选择题(本题包括3小题，共40分。)
21．(14分)(2024·烟台高二月考)人体肝脏细胞中的乙醛脱氢酶2(ALDH2)是人体酒精代谢中的关键酶。如图表示利用基因工程生产ALDH2过程中使用的质粒及目的基因的部分结构，β-半乳糖苷酶(LacZ基因编码产生)能分解无色的X－gal产生蓝色物质。图中氨苄青霉素抗性基因、β-半乳糖苷酶基因、目的基因的序列中分别含有1种、5种、2种限制酶的识别序列及切割位点。
(1)构建基因表达载体时一般至少需要两种限制酶，以防止__________________和__________________。设计启动子的作用是__________________。
(2)为了使目的基因与载体能正确连接，应在扩增的目的基因A、B两端分别引入________和______________两种不同限制酶的识别序列。
(3)MunⅠ酶切后的末端与EcoRⅠ酶切后的末端能连接，原因是_______________________。
(4)以大肠杆菌为受体细胞，在筛选插入ALDH2基因成功的受体细胞时，除营养物质外，还要在培养基中加入的物质有________________________________________________。
答案　(1)质粒或目的基因自身环化　目的基因与质粒反向连接　使目的基因正常转录(表达)　(2)XhoⅠ　MunⅠ　(3)MunⅠ酶与EcoRⅠ酶切后的黏性末端相同(可以互补配对)　(4)氨苄青霉素和X－gal
解析　(1)构建基因表达载体时若只用一种限制酶，可能会出现质粒或目的基因自身环化、目的基因与质粒反向连接等问题，因此一般至少需要两种限制酶，以避免这些问题。启动子是转录的起点，设计启动子的作用是使目的基因正常转录(表达)。(2)由于目的基因内含有SalⅠ和NheⅠ的酶切位点，因此不能选用这两种酶，而EcoRⅠ会同时破坏氨苄青霉素抗性基因、β-半乳糖苷酶基因而失去标记基因，也不能选用，所以选择XhoⅠ、MunⅠ。根据质粒的启动子位置、转录方向和目的基因的转录方向，A、B两端分别引入XhoⅠ、MunⅠ的识别序列。(3)MunⅠ酶切后的黏性末端序列为AATT－，EcoRⅠ酶切后的黏性末端序列也为AATT－，两者相同(可以互补配对)，所以可以连接。(4)通过能够在氨苄青霉素中生存筛选出导入质粒的细胞，再通过不能使X－gal产生蓝色，筛选出其中导入重组质粒的细胞，就是插入ALDH2基因成功的受体细胞，即需要在培养基中加入氨苄青霉素和X－gal进而可以选择抗氨苄青霉素且菌落呈白色的受体细胞。
22．(14分)普通棉花中β-甘露糖苷酶基因(GhMnaA2)表达出的3－甘露糖苷酶能催化半纤维素降解，使棉纤维长度变短。为了培育长绒棉，科研人员构建了反义GhMnaA2基因表达载体，获得了转基因长绒棉新品种，具体过程如图所示，SmaⅠ、NotⅠ、HindⅢ和BamHⅠ为酶切位点，LB为T－DNA左边界，RB为T－DNA右边界。回答下列问题：
(1)过程①中不用限制酶NotⅠ的原因是_________________________________________。
GhMnaA2的序列中包含内含子等序列，可增大重组质粒的分子量，使导入效率降低，请提出一个解决此问题的方案：________________________________________________________。
(2)过程②中在培养基中添加__________可将含有重组质粒的农杆菌筛选出来。反义表达载体T－DNA区段的________________________________片段整合到棉花细胞的染色体中，并在翻译过程中起作用。
(3)过程③中目的基因导入棉花细胞后，可采用__________技术从分子水平上检测目的基因是否插入染色体；个体水平上的检测为_________________________________。
(4)由图分析可知，转基因长绒棉棉纤维较普通棉棉纤维长的原因是_________________。
答案　(1)限制酶NotⅠ会破坏目的基因，且质粒上没有NotⅠ的切割位点　从棉花细胞中提取GhMnaA2的mRNA，逆转录获得GhMnaA2的cDNA　(2)抗生素　E6启动子和GhMnaA2基因　(3)PCR　观察转基因棉花的棉纤维是否变长　(4)转基因长绒棉细胞内的反义GhMnaA2基因转录的mRNA能与细胞内的GhMnaA2基因转录的mRNA互补配对，从而抑制GhMnaA2基因的表达，缺少3－甘露糖苷酶，半纤维素不被降解，从而使转基因长绒棉的棉纤维长于普通棉花
23．(12分)如图所示为A、B、C三种质粒和一个含目的基因D的DNA片段示意图。图中AmpR为氨苄青霉素抗性基因，tetR为四环素抗性基因，LacZ为蓝色显色基因，EcoRⅠ、PvuⅠ为两种限制酶，质粒上限制酶括号内的数字表示限制酶切割位点与复制原点的距离。请回答下列相关问题：
(1)据图分析，质粒A、C一般不能作为载体的理由分别是___________。若要获取目的基因，应该选用限制酶__________________切割。
(2)(4分)将图中的目的基因与质粒B进行重组。在基因工程的操作过程中，需要检查目的基因是否重组到质粒中，应使用限制酶__________________酶切重组质粒，完全酶切后，进行电泳检测。若电泳图谱中出现长度为1.1 kb和5.6 kb，或者______________kb和______________kb的片段，则可判断目的基因已插入质粒B中。
(3)若选择自身不含LacZ基因并对抗生素敏感的大肠杆菌作为受体细胞，则如何筛选成功导入重组质粒的受体细胞？_______________________________________________________。
目的基因能在大肠杆菌细胞内表达出相同的蛋白质，其遗传学基础是___________________。
答案　(1)(质粒A)缺少标记基因、(质粒C)复制原点会被限制酶切割　PvuⅠ　(2)EcoRⅠ　3.1　3.6　(3)在含有氨苄青霉素的培养基上培养经过导入处理的大肠杆菌，能形成白色菌落的即为导入重组质粒的大肠杆菌　自然界的生物共用一套遗传密码子
解析　(1)由题图可知，质粒A缺乏标记基因，质粒C中PvuⅠ的切割位点位于复制原点，故一般不能选择质粒A、C作为载体。由于目的基因的两端都有限制酶PvuⅠ的切割位点，而限制酶EcoRⅠ会破坏目的基因，故要获取目的基因，应该选用限制酶PvuⅠ切割。(2)目的基因中除了有限制酶PvuⅠ的切割位点外，还存在限制酶EcoRⅠ的切割位点，由于目的基因的长度为4.0 kb，若用PvuⅠ切割重组质粒则得不到1.1 kb的片段，所以应用限制酶EcoRⅠ切割。由于目的基因和载体用一种酶进行切割，重组质粒(含2个EcoRⅠ酶切位点)会出现正向连接和反向连接两种类型，质粒B中EcoR Ⅰ酶切位点与PvuⅠ酶切位点之间的距离为0.1 kb，重组质粒中2个EcoRⅠ酶切位点之间的距离可能是0.1＋(4－3)＝1.1(kb)或0.1＋3＝3.1(kb)，重组质粒长度为2.7＋4＝6.7(kb)，故EcoRⅠ酶切后，电泳图谱中出现长度为1.1 kb和5.6 kb的片段或者3.1 kb和3.6 kb的片段，说明目的基因已插入质粒B中。(3)由题意可知，重组质粒中的LacZ基因会被破坏，但保留氨苄青霉素抗性基因，故若选择自身不含LacZ基因并对抗生素敏感的大肠杆菌作为受体细胞，在含有氨苄青霉素的培养基上培养经过导入处理的大肠杆菌，则未成功导入重组质粒的大肠杆菌无法存活，而成功导入重组质粒的可以存活，能形成白色菌落的即为导入重组质粒的大肠杆菌。由于自然界的生物共用一套遗传密码子，故目的基因能在大肠杆菌细胞内表达出相同的蛋白质。

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