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1.2发酵工程的无菌技术——2024—2025学年高二生物学苏教版（2019）选择性必修三随堂练习
一、单选题
1．需要在火焰旁操作的有( )
①土壤取样
②称取土壤
③稀释土壤溶液
④涂布平板
⑤微生物的培养
A.①②③④⑤ B.②③④ C.③④⑤ D.②③④⑤
2．采用干热灭菌、灼烧灭菌、高压蒸汽灭菌、紫外线照射等几种方法，可分别杀死哪些部位的杂菌( )
A.接种环、吸管、培养基、接种室 B.吸管、接种环、培养基、接种箱
C.培养基、吸管、接种环、接种箱 D.培养皿、吸管、培养基、双手
3．分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是( )
①加尿素
②不加尿素
③加琼脂
④不加琼脂
⑤加葡萄糖
⑥不加葡萄糖
⑦加硝酸盐
⑧不加硝酸盐
A.①③⑤② B.①④⑤⑧ C.①③⑤⑧ D.①③⑥⑦
4．下面关于微生物的纯培养操作中，划线接种(甲)、培养结果(乙)如图，a、b、c、d是划线的四个区域。下列叙述错误的是( )
A.每次划线前后都要对接种环灼烧灭菌
B.连续划线的目的是获得单个微生物纯培养形成的纯培养物
C.图甲中的a区域为划线的起始区域
D.蘸取菌液和划线要在酒精灯火焰旁进行
5．获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，研究人员对于无菌技术则围绕着如何避免杂菌污染展开讨论。下列操作中错误的是( )
A.灭菌常用方法有湿热灭菌，干热灭菌，灼烧灭菌等
B.在接种箱或超净工作台的使用前，可用紫外线照射30min来进行消毒
C.若培养皿盖和皿底之间溅有培养基，则不宜用此培养皿培养微生物
D.接种环，接种针等用具应在酒精灯火焰的内焰部位灼烧灭菌
6．高压蒸汽、酒精擦拭、火焰灼烧三种处理方法分别适用于哪些材料（或用具）的杀菌处理( )
A.接种环、培养基、超净工作台 B.接种环、操作者的双手、培养基
C.培养基、操作者的双手、接种环 D.接种环、超净工作台、培养基
7．微生物培养最基本的要求是无菌操作，下列对培养基、培养皿、接种环、双手、空气、牛奶所采用的灭菌或消毒方法的正确顺序依次是( )
①化学药物消毒
②高压蒸汽灭菌
③干热灭菌
④紫外线消毒
⑤灼烧灭菌
⑥巴氏消毒法
A.⑤③⑤①④⑥ B.③②⑤④①⑥ C.②③⑤①④⑥ D.②②⑤④①⑥
8．地衣芽孢杆菌可用于降解土壤中残留的除草剂，修复土壤。某公司生产的企业标准是当发酵液中菌体的浓度为2×1011个/L时发酵结束，经处理后分装、质检、上市。下列说法错误的是( )
A.地衣芽孢杆菌菌种的纯培养包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤
B.为保证活菌数量符合产品要求不宜采用显微镜直接计数
C.发酵结束前取0.2mL发酵液涂布平板计数时稀释度为10 最合适
D.发酵结束后可采用过滤、沉淀等方法将菌体分离和干燥
9．由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。下列关于酵母菌纯培养的叙述错误的是( )
A.酵母菌的纯培养包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤
B.配制好的培养基和倒平板用的培养皿均要采用高压蒸汽灭菌
C.如果采用平板划线法接种酵母菌，接种环在接种前后均要进行灼烧灭菌
D.如果接种的培养基有不同形态的菌落，可能是接种的菌种不纯
10．分离、纯化细菌的实验中，平板划线法接种（甲）及培养结果（乙）如图所示，a、b、c、d是划线的四个区域。下列叙述正确的是( )
A.实验所用培养基一般用干热灭菌法进行灭菌
B.图中d区域的划线操作是从c区域划线的末端开始的
C.为了防止杂菌污染，接种环灼烧后立即蘸取菌液进行划线
D.图示划线接种过程中至少需要对接种环灼烧5次
11．某兴趣小组配制了伊红—亚甲蓝琼脂培养基（大肠杆菌菌落在此培养基上呈深紫色并带有金属光泽）对饮用水进行检测。卫生部门规定的饮用水标准为1mL自来水检测出的菌落总数不超过100个。下列有关叙述错误的是( )
A.饮用水取样后先进行梯度稀释，再选择其中三个稀释度进行涂布平板
B.每个稀释度至少涂布3个平板，统计菌落数时应取3个平板的平均数
C.计数时当两个或者多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
D.实验者的手和衣服需要进行酒精消毒，培养皿和培养基需要进行湿热灭菌
12．为保障公共健康，需要定期对公共饮用水进行卫生检测。饮用水的卫生标准是100mL不应检出总大肠菌群。若要确定饮用水是否合格，可采用膜过滤法检测，过程如图所示。下列相关叙述错误的是( )
A.检测前一般需要对水样收集瓶、培养皿、镊子等进行干热灭菌
B.完成过滤后需将滤膜置于固体培养基上，在37℃下培养观察
C.可用计数板直接计数法替代膜过滤法检测饮用水中的活细菌数量
D.为减少实验误差，应按照上述实验步骤多次取样重复进行检测
13．解脂菌能利用分泌的脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸并吸收利用。脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色。将不能直接吸收脂肪的甲，乙两种菌分别等量接种在醇溶青琼脂平板上培养。甲菌菌落周围呈现深蓝色，乙菌菌落周围不变色，下列说法错误的是( )
A.甲菌属于解脂菌
B.实验中所用培养基以脂肪为唯一碳源
C.可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比
D.该平板可用来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力
14．物质W是一种含氮有机物，W在培养基中达到一定量时培养基表现为不透明。某小组欲从土壤中筛选出能降解W的细菌，结果如图。下列说法错误的是( )
A.透明圈的形成是因为W物质被分解
B.乙菌落中的细菌都能降解W，不需要进一步纯化
C.甲菌落中的细菌可能是利用空气中的氮气作为氮源
D.所用的选择培养基应该是以物质W为唯一氮源
15．苯酚是工业废水中的主要污染物，用微生物降解苯酚对环境无害且成本低廉。某科研所得到了某种高效降解苯酚的菌株并进行了相关实验，结果如图所示。下列有关分析错误的是( )
A.分离纯化苯酚降解菌株可以从含苯酚的废水中取样
B．一定时间内，苯酚初始浓度不同，菌株对苯酚的降解率不同
C．苯酚初始浓度的变化，对该菌株适应环境的时间几乎无影响
D．较高浓度的苯酚可能对菌株产生了毒害作用
二、多选题
16．研究人员将结核杆菌分别接种在含有不同浓度抗生素A与B的培养基中（+代表含抗生素，+多少代表抗生素浓度，-代表不含抗生素），对两种抗生素药性分析。在37℃环境下培养24小时后，细菌生长情况如图。下列说法错误的是( )
A.为排除杂菌的影响，倒平板前需对培养基采用高压蒸汽灭菌
B.该实验使用稀释涂布平板法接种结核杆菌，待菌液被吸收后方可倒置培养
C.长期使用抗生素A不会增加结核杆菌的抗药性基因频率
D.与单独使用抗生素A相比，联合使用抗生素B可显著增强对结核杆菌的抑制作用
17．鸡蛋表面污染的细菌会逐渐侵入蛋内，缩短鸡蛋保质期。对某地不同季节及不同养殖模式下生产的鸡蛋取样，按每克鸡蛋用1mL无菌生理盐水清洗鸡蛋表面，收集清洗液，培养计数结果如下表。相关叙述正确的是( )
季节 菌落数（个·g-1）
半封闭式养殖模式 全封闭式养殖模式
夏季 3.92×104 7.24×103
冬季 7.60×104 1.24×104
A.表中数据是对清洗液稀释1×103倍后涂布平板获得的
B.稀释涂布平板法得到的鸡蛋表面菌落数比实际数略少
C.夏季鸡舍更需要消毒以减少鸡蛋表面的细菌污染
D.全封闭养殖模式更有利于减少鸡蛋表面的细菌污染
三、读图填空题
18．③号试管稀释倍数为______。
19．氮素污染物是造成水体污染和富营养化的主要原因之一，水体中氮素的去除对清洁水体有重要意义、异养硝化细菌能降解硝酸铵产生氨，科研工作者从污水中筛选出异养硝化细菌ZW2和ZW5菌株，并研究其去氮能力。回答下列问题：
(1)进行ZW2和ZW5菌株初步筛选时，通常采用______法或______法进行接种。初步筛选时，样品中含有多种微生物，培养后，一般依据______来区分不同的微生物。
(2)从污水中分离ZW2和ZW5菌株时，培养基中需要加入硝酸铵等营养物质、琼脂和酚红指示剂。培养后，这两种细菌都能生长并形成菌落，结果如图所示。______(填“ZW2”或“ZW5”)菌株的去氮能力更强，判断依据是______。
(3)在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为106的样品液0.1mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为168、171、165、178和168。则每毫升样品中的细菌数量______个、与此方法相比，用血细胞计数板计数法统计得到的细菌数量______。
(4)上图培养基从物理性质分应属于______，接种用到的工具是______。
20．自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是有关土壤中分解尿素的细菌分离和计数的实验过程，请回答有关问题。
（1）为分离出土壤中分解尿素的细菌，应该用_______________________的培养基进行分离。
（2）若取土样6g，应加入_______mL的无菌水配制成稀释10倍土壤溶液。因土壤中细菌密度很大，需要不断加以稀释，配制成101～107不同浓度的土壤溶液。将103～107倍的稀释液分别吸取0.2mL加入到固体培养基上，用涂布器将菌液铺平，每个稀释度下至少涂布3个平板。将接种的培养皿放置在37℃恒温培养箱中培养24h～48h，观察并统计菌落数，结果如下表，其中_______倍的稀释比较合适，由此计算出每克土壤中的菌落数为__________。
稀释倍数 103 104 105 106 107
菌落数 （个） 1号平板 478 367 270 26 5
2号平板 496 354 264 20 8
3号平板 509 332 252 29 3
（3）若研究尿素分解菌的群体生长规律，可采用平板划线法分离土壤中的尿素分解菌。操作时，接种环通过灼烧灭菌，在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线。这样做的目的是_______________________。将分离纯化后的单个菌落进行液体培养，可采用定期取样的方法进行计数。若以一个大方格（体积为0.1mm3）有25个中方格的计数板为例进行计算，设五个中方格中总菌数为50，菌液稀释倍数为102 ，那么原菌液的菌群密度为________个/mL。
参考答案
1．答案：B
解析：①土壤是微生物的天然培养基，土壤取样时不需要在酒精灯含有旁操作，①错误；②称取土壤时，为避免杂菌污染，需要在酒精灯火焰旁进行操作，②正确；③稀释土壤溶液时为避免杂菌污染，需要在酒精灯火焰旁进行，③正确；④进行涂布平板接种操作时需要在酒精灯火焰旁进行，④正确；⑤微生物的培养需要在一定温度的恒温箱中进行，⑤错误。综上②③④正确。故选B。
2．答案：B
解析：接种环属于接种用的金属工具，需要用灼烧灭菌；吸管在使用前需保持干燥，需要用干热灭菌；培养基应该用高压蒸汽灭菌；接种室、接种箱需要用紫外线照射灭菌；双手可以用医用酒精消毒；综上所述，B符合题意，ACD不符合题意。故选B。
3．答案：C
解析：①②要分离分解尿素的细菌，应配置以尿素为唯一氮源的培养基，①正确、②错误；③④分离土壤中分解尿素的细菌时，制备固体培养基需加入琼脂糖，③正确，④错误；⑤⑥培养基中需要加碳源即葡萄糖，⑤正确，⑥错误；⑦⑧要分离分解尿素的细菌，应以尿素为唯一氮源，故不加硝酸盐，⑦错误，⑧正确；故正确的有①③⑤⑧，D正确。故选D。
4．答案：C
解析：A、平板划线法中每次划线前都要灼烧接种环，保证菌种来自于上一次划线的末端，划线结束后也要灼烧接种环，防止污染环境、感染接种者，A正确;B、连续划线可以将聚集的菌种逐步稀释，以便获得单个微生物纯培养形成的纯培养物，B正确，C、图甲中a对应的区域出现了单个菌落，d区域菌落最多，因此a区域应该为划线的最终区域，d区域为划线的起始区域，C错误;D、为了防止空气中杂菌的污染，蘸取菌液和划线都要在酒精灯火焰旁进行，D正确。故选C。
5．答案：D
解析：A、无菌技术包括消毒和灭菌,灭菌常用方法有湿热灭菌，干热灭菌，灼烧灭菌等，A正确;B、在接种箱或超净工作台在使用前，可用紫外线照射30min来进行消毒，以杀死物体表面或空气中的微生物，B正确;C、空气中的微生物可能在皿盖和皿底之间的培养基上滋生，因此若培养皿盖和皿底之间溅有培养基，则不宜用此培养基培养微生物，C正确;D、接种环，接种针等用具应在酒精灯火焰的外焰部位灼烧灭菌，D错误。故选D。
6．答案：C
解析：
7．答案：C
解析：为了保持培养基中的水分不被烘干，常采用②高压蒸汽灭菌法对培养基进行灭菌；培养皿等需要保持干燥的玻璃器皿可以采用③干热灭菌进行灭菌；接种过程中需要对接种环进行⑤灼烧灭菌；操作者双手可用酒精等化学药剂进行消毒，即①化学消毒法；为了杀死空气中微生物，常采用④紫外线消毒法；为防止牛奶中营养成分被破坏，常采用⑥巴氏消毒法处理牛奶，综上所述，对培养基、培养皿、接种环、双手、空气、牛奶所采用的灭菌或消毒方法的正确顺序依次是②③⑤①④⑥，ABD错误，C正确。故选C。
8．答案：C
解析：A、地衣芽孢杆菌菌种属于微生物，其纯培养包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤，A正确；B、显微镜直接计数时死菌和活菌均包含在内，且无法区分，导致统计结果偏大，不符合产品要求，B正确；C、符合生产标准的发酵液中菌体的浓度为2×1011个/L，发酵结束前取0.2mL发酵液涂布平板计数时稀释度为10-7时平板上的菌落数约为2×1011个/L×0.2ml×10-7×10-3=4个，不在30~300范围内，影响结果的准确性，因此稀释度为10-7不合适，C错误；D、发酵产品不同，分离提纯的方法一般不同，如果产品是菌体，可采用过滤、沉淀等方法将菌体从培养液中分离和干燥，D正确。故选C。
9．答案：B
解析：A、酵母菌的纯培养，包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤，尤其注意防止杂菌污染，A正确；B、培养基采用高压蒸汽灭菌，培养皿要采用干热灭菌，B错误；C、如果采用平板划线法接种酵母菌，接种环在接种前后均要进行灼烧灭菌，接种前灭菌可以防止杂菌污染，实验完成后接种工具灭菌，以免污染环境，C正确；D、未接种的培养基如果有菌落，说明培养基被杂菌污染，接种的培养基有不同形态的菌落，可能是接种的菌种不纯或操作不规范等导致的，D正确。故选B。
10．答案：D
解析：A、实验所用培养基一般用湿热灭菌法（高压蒸汽灭菌）进行灭菌，A错误；B、图中a对应的区域出现了单菌落，d区域菌落最多，因此a区域应该为划线的最终区域，d区域为划线的起始区域，即图中c区域的划线操作是从d区域划线的末端开始的，B错误；C、接种环灼烧后需适当冷却再蘸取菌液进行划线，避免将菌种烫死，C错误；D、蘸取菌液前需要灼烧一次接种环，之后在c、b、a区域划线前都要灼烧接种环，以保证菌种来自上一次划线的末端，划线结束后也要灼烧接种环，防止接种环上的菌种污染环境、感染接种者，因此接种过程中至少需要对接种环灼烧5次，D正确。故选D。
11．答案：A
解析：A、微生物数量的测定可以利用稀释涂布平板法，微生物种群密度比较大的情况下先梯度稀释再涂布平板，而饮用水中大肠杆菌种群密度小，不需要稀释，A错误；B、每个稀释度至少涂布3个平板，统计菌落数时应取3个平板的平均数，B正确；C、计数时当两个或者多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，C正确；D、实验者的手和衣着需要进行酒精消毒，培养基需要进行湿热灭菌，培养皿是玻璃器皿，干热灭菌和湿热灭菌都可以，D正确。故选A。
12．答案：C
解析：A、检测前需要对水样收集瓶、培养基、镊子灭菌，防止杂菌污染，A正确；B、为控制无关变量的影响，完成过滤后需将滤膜置于固体培养基上，应在37℃下培养观察，B正确；C、大肠杆菌较小，不能用血细胞计数板直接计数法替代膜过滤法检测，C错误；D、为减少实验误差，按照上述实验步骤多次取样重复进行检测，取平均值作为实验数据，D正确。故选C。
13．答案：B
解析：A、根据题干信息“甲菌菌落周围呈现深蓝色”，说明甲可以分泌脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸，脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色，因此甲菌属于解脂菌，A正确；B、乙菌落周围没有出现深蓝色，说明乙菌落不能产生脂肪酶，不能利用脂肪为其供能，但乙菌落也可以在培养基上生存，说明该培养基不是以脂肪为唯一碳源，B错误；C、可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比，更加直观，C正确；D、可以利用该平板来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力，观察指标可以是菌落周围深蓝色圈的大小，D正确。故选B。
14．答案：B
解析：A、由题干可知，W在培养基中达到一定量时培养基表现为不透明，因此透明圈的形成是因为W物质被分解，A正确;B、乙菌落中的细菌不一定都能降解W，因此仍需要进一步纯化，B错误;C、该培养基以W物质为唯一氨源，而甲菌落周围未出现透明圈，因此甲菌落中的细菌可能是利用空气中的氮气作为氮源，C正确;D、物质W是一种含氨有机物，要筛选出能降解W的细菌，所用的选择培养基应该是以物质W为唯一氮源，D正确。故选B。
15．答案：C
解析：从坐标图来看，随着苯酚初始浓度的增大，菌株对该环境的适应时间(降解率大幅度增加之前的时间)越长。错误。
16．答案：CD
解析：A、为排除杂菌的影响，倒平板前应该用高压蒸汽灭菌法对培养基进行灭菌，然后冷却到50℃左右倒平板，A正确；B、如图，菌落分布均匀，是利用了稀释涂布平板法接种结核杆菌，待菌液被吸收后方可倒置培养，B正确；C、长期使用抗生素A，在抗生素A的选择作用下，结核杆菌的抗药性基因频率可能会增加，C错误；D、根据图中平板上菌落的分布可知，与单独使用抗生素A相比，联合使用抗生素B不能增强对结核杆菌的抑制作用，D错误。故选CD。
17．答案：BD
解析：A、稀释平板计数法涂布的菌液体积为0.1mL，菌落数为30-300的平板适于计数，根据图中数据分析，半封闭式养殖模式对清洗液稀释1×102倍后涂板，全封闭式养殖模式对清洗液稀释1×101倍后涂板，A错误;B、由于两个或更多的细胞可能聚集在一起形成一个菌落，因此稀释涂布平板法得到的鸡蛋表面菌落数比实际数略少，B正确;C、从表中数据可以看出，冬季鸡蛋表面的菌落数明显高于夏季，这可能是因为冬季气温低，细菌更容易在鸡蛋表面生存和繁殖，因此需要加强消毒措施，C错误;D、从表中数据可以看出，全封闭养殖模式下的鸡蛋表面的菌落數明显低于半封闭养殖模式，所以全封闭养殖模式更有利于减少鸡蛋表面的细菌污染，D正确。故选BD。
18．答案：104
解析：略
19．答案：(1)稀释涂布平板；平板划线；菌落特征(或菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等)；
(2)ZW5；ZW5菌落周围的红色圈面积大，其降解硝酸铵产生氨的能力更强；
(3)1.7×109；多。
(4)固体培养基；涂布器。
解析：(1)进行ZW2和ZW5菌株初步筛选时,通常采用平板划线法或稀释涂布平板法进行接种。一般来说,在相同的培养条件下,同种微生物表现出稳定的菌落特征。故初步筛选时,可根据菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等方面的菌落特征区别不同微生物。
(2)由图分析可知,ZW5菌落周围的红色圈面积大,说明其降解硝酸较产生氨的能力更强,故如果要得到目标菌,应该选择ZW5。
(3)结合题干实验过程可知,该过程采取了稀释涂布平板法,为了保证结果准确,一般选择菌落数在30-300的平板进行计数。在5个细菌培养基平板上,均接种稀释倍数为10的溶液0.1mL,培养一段时间后,平板上长出的细菌菌落数分别为168、171、165、178和168,菌落平均数-(168+171+165+178+168)+5-170,所以每克土样品中的细菌数量=170-0.1×10=1.7×109个。若要测定培养液中选定菌种的数量,也可以在显微镜下用血细胞计数板直接计数,包括培养液中的死亡的细胞,所以统计得到的细菌数量多。
(4)上图是稀释涂布平板法得到的菌落,培养基从物理性质分应属于固体培养基,接种用到的工具是涂布器。
20．答案：（1）尿素作为唯一的氮源
（2）54；105；1.31×108
（3）将聚集的菌体逐步稀释以便获得（不连续）单个菌落；2.5×108
解析：（1）要分离出分解尿素的细菌,应该用以尿素作为唯一氮源的培养基,属于选择培养基,细菌合成的脲酶将尿素分解成氨,会使培养基的碱性增强,pH升高,培养基中加入的酚红指示剂将变红,可以鉴定该类微生物。
（2）6 g土样配制成稀释10倍土壤溶液,总体积应为60 mL,因此应加入54 mL的无菌水。稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释,然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面,进行培养。一般选择菌落数在30 300的平板进行计数。稀释105倍的三个平板中平均菌落数为(277+261+254)+ 3=264 个,故每克土壤中的菌落数为:264 ÷0.2×105=1.32×108个。这种方法统计的菌落数往往比活菌的实际数目低,因为当两个或多个菌落连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落。
（3）在第二次及以后划线时,总是从上一次的末端开始划线。这样做的目的是将聚集的菌体逐步稀释以便获得(不连续)单个菌落。五个中方格中总菌数为45,则每个小格中菌数为(45÷5÷16) 个,血细胞计数板一个大方格(体积为0.1mm3)中400个小格,菌液稀释倍数为102,那么1mL原菌液的菌群数量为45÷5÷16×400÷10000×102=2. 25×108个。

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