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（3）土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
——高考一轮复习生物学分离鉴定类实验专练
1.土壤中分解尿素的细菌的分离和计数过程如图，相关叙述不正确的是（ ）
A.需要配制以尿素为唯一氮源的培养基，从功能上来说这属于选择培养基
B.5号试管的结果表明每克土壤中的活菌的菌株数为1.7×108个
C.除了用稀释涂布平板法对尿素分解菌计数外，还可以用显微镜直接计数
D.若培养高效分解尿素的细菌，可在固体培养基中额外添加酚红进行筛选
2.欲从土壤中分离出能分解尿素的细菌，下列实验操作中不正确的是（ ）
A.将土壤用无菌水进行一系列的梯度稀释
B.同一浓度的土壤稀释液应至少涂布三个平板
C.可将未接种的培养基在相同条件下培养作为对照
D.用加入刚果红指示剂的培养基可筛选出分解尿素的细菌
3.在做分离分解尿素的细菌实验时，甲同学从稀释倍数为106对应的培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只选择出大约50个菌落。下列有关叙述存在科学性错误的是（ ）
A.甲同学出现这种结果的原因可能是土样不同，也可能是操作过程出了问题
B.将甲配制的培养基不加土样进行培养作为空白对照，以检验培养基是否受到污染
C.让其他同学用与甲一样的土样进行实验，如果结果与甲一致，则可以证明甲同学无误
D.B、C选项的实验思路都遵循了实验的对照原则
4.关于土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验的叙述正确的是（ ）
A.培养基应以尿素为唯一氮源，该细菌与硝化细菌所利用的碳源是相同的
B.土壤取样时应选取表面的土壤
C.对10g土样稀释106倍后，取0.1mL该溶液进行重复的涂布实验，测得的菌落数分别为18、234、276，则该10g土样中分解尿素的细菌数为2.55×108个
D.应该设置对照以排除非测试因素对实验结果的干扰，提高可信度
5.在做分离分解尿素的细菌实验时，甲同学从稀释倍数为106对应的培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只选择出大约50个菌落。下列有关叙述存在科学性错误的是（ ）
A.甲同学出现这种结果的原因可能是土样不同，也可能是操作过程出了问题
B.将甲配制的培养基不加土样进行培养作为空白对照，以检验培养基是否受到污染
C.让其他同学用与甲一样的土样进行实验，如果结果与甲一致，则可以证明甲同学无误
D.B、C两项的实验思路都遵循了实验的对照原则
6.某实验小组完成了“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验，下列关于实验的叙述正确的是（ ）
A.利用以尿素为唯一氮源的培养基培养土壤微生物，其上生长的均是能分解尿素的细菌
B.培养一段时间后，培养基中的营养成分会减少，有害成分积累，pH会升高
C.观察培养24h时的培养基，其菌落特征往往不稳定，最可能的原因是稀释倍数不当
D.用血细胞计数板在显微镜下观察计数，获得的个数就是该体积样品中活菌数与死菌数之和
7.下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验操作的叙述，不正确的是（ ）
A.利用稀释涂布平板法准确估计菌落数目的关键是恰当的稀释度
B.若要判断选择培养基是否起到了选择作用，需设置接种了的牛肉膏蛋白胨培养基做对照
C.将实验组和对照组平板倒置，25℃恒温培养24～48小时
D.选择菌落数在30~300的实验组平板进行计数
8.某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。下列关于土壤中分解尿素的细菌的分离和计数的相关叙述，正确的是（ ）
A.分解尿素的细菌是以尿素的分解产物CO2作为碳源的
B.接种时应单手打开皿盖，然后取出浸泡的玻璃刮刀直接涂布
C.本实验采用稀释涂布平板法接种，可能导致实验结果偏小
D.若实验组菌落平均数为37个/平板，空白对照平板上有3个菌落，则本组菌落数的平均值为34个/平板
9.下列叙述中不正确的是（ ）
A.因为土壤中各类微生物的数量不同，所以，为获得不同类型的微生物要按不同的稀释倍数进行分离
B.测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围不同
C.牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目明显少于选择培养基上的菌落数目，说明选择培养基已筛选出一些菌种
D.如果得到了3个或3个以上菌落数目在30~300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数
10.下列关于土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验操作的叙述，错误的是（ ）
A.利用稀释涂布平板法准确估计菌落数目的关键是有恰当的稀释度
B.若要判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置未接种的牛肉膏蛋白胨培养基作为对照
C.该实验每隔24h统计一次菌落数目，并以菌落数目稳定时的记录作为结果
D.用以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基来培养该细菌后不会使酚红指示剂变红
11.如图是某课题小组设计的“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”的实验流程示意图。请回答下列问题：
（1）微生物接种的方法有很多，该图所示为______法，这一方法常用来统计样品中______（填“活菌”“死菌”或“活菌和死菌”）的数目。实验统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，这是因为_________________________。
（2）实验过程中，需对培养基进行灭菌，常用的灭菌方法是______。接种操作都应在酒精灯火焰附近进行，目的是防止_____。
（3）对分离得到的分解尿素的细菌做进一步鉴定时，可在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂进行细菌培养，其鉴定原理是_____。
12.用添加了琼脂的培养基在试管中制成斜面，在此面上对细菌、霉菌等微生物进行培养称为斜面培养。斜面培养有利于观察所培养的微生物的生长状态并对菌种进行保藏。如图为某兴趣小组从土壤中分离尿素分解菌并进行临时保藏的过程。回答下列问题：
（1）不同培养基的成分存在差异，但一般都包括_____这四类物质，配制培养基时，除了要考虑各种成分外，还需要考虑_____（答出两点）等条件。
（2）图中接种之前，配制好的固体培养基应_____（填“先灭菌后倒平板”或“先倒平板后灭菌”），灭菌时常采用的方法是_____；过程①和过程②所涉及的接种方法中，便于对平板上的尿素分解菌进行计数的方法是_____（序号+方法），利用该方法统计得到的菌落数往往比实际数目_____，原因是_____。
（3）鉴定尿素分解菌的试剂是_____，原理是_____。
（4）将筛选出的菌种接种至斜面时，为了避免杂菌污染，接种操作应在_____附近进行。
答案以及解析
1.答案：B
解析：只有分解尿素的细菌能产生脲酶，在以尿素为唯一氮源的培养基中能生存下来，A正确；5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为（168+175+167）/3/0.1×106=1.7×109个，B错误；除了用稀释涂布平板法对尿素分解菌计数外，还可以用显微镜直接计数，C正确；细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，可使含有酚红的培养基变红，可根据变红的范围、直径大小筛选出高效降解尿素的细菌，D正确。
2.答案：D
解析：A、为防止土壤浸出液浓度过高，不能获得单菌落，要将土壤用无菌水进行一系列的梯度稀释，A正确；
B.同一浓度的土壤稀释液应至少涂布三个平板，防止偶然因素对实验结果的影响，B正确；
C.可以将未接种的培养基在相同条件下培养作为对照，以判断培养基灭菌是否彻底，C正确；
D.可筛选出分解尿素的细菌的培养基是以尿素为唯一氮源的选择培养基，D错误。故选D。
3.答案：D
解析：甲同学获得的菌落数量远大于其他同学，可能是由于所取的土样不同，也可能操作过程中培养基被污染了，A正确；污染的原因可能是培养基灭菌不彻底，或操作过程没有保证无菌操作，将甲同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养作为空白对照，以检验培养基是否受到污染，B正确；让其他同学用与甲同学一样的土样进行实验，如果结果与甲同学一致，则可以证明甲同学操作正确，C正确；B项的实验思路遵循了实验的对照原则，C项的实验思路遵循了实验的重复性原则，D错误。
4.答案：D
解析：分离土壤中分解尿素的细菌的培养基应以尿素为唯一氮源，硝化细菌是自养生物，其碳源为二氧化碳，故二者利用的碳源不同，A错误；细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿的土壤中生长，绝大多数分布在距地表3～8cm的土壤层中所以应在距离地表3～8cm的土壤层取样，B错误；对10mL土样稀释106倍后，取0.1mL该溶液进行重复的涂布实验，测得的菌落数分别为18、234、276，则该10mL土样中分解尿素的细菌数为（234+276）/2÷0.1×10×106=2.55×1010（个），C错误；分离微生物时，需要设置不接种的培养基与实验组一起培养作空白对照，设置对照的目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的干扰，D正确。
5.答案：D
解析：甲同学获得的菌落数量远大于其他同学，可能是由于所取的土样不同，也可能操作过程中培养基被污染了，A正确；污染的原因可能是培养基灭菌不彻底，或操作过程没有保证无菌操作，将甲同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养作为空白对照，以检验培养基是否受到污染，B正确；让其他同学用与甲同学一样的土样进行实验，如果结果与甲同学一致，则可以证明甲同学操作正确，C正确；B项的实验思路遵循了实验的对照原则，C项的实验思路遵循了实验的重复性原则，D错误。
6.答案：B
解析：培养基以尿素为唯一氮源，其上生长的都是能合成脲酶的微生物，某些固氮菌不需要培养基提供氮源，A错误；分解尿素的细菌大多是异养生物，培养基的营养成分会因代谢而减少，脲酶能将尿素分解成氨，氨是一种碱性物质，pH会升高，B正确；培养24h，培养基中的菌落特征往往不稳定，可能是由于培养时长不足，也可能是由于稀释倍数不当菌落重叠造成的，C错误；用血细胞计数板在显微镜下观察计数，获得的个数再经计算一定体积样品中的数量才是该体积样品中活菌数与死菌数之和，D错误。
7.答案：C
解析：利用稀释涂布平板法准确估计菌落数目的关键是恰当的稀释度，稀释倍数太低，菌落太多会长在一起，稀释倍数太高，平板上菌落数目过少，都不易进行计数，A正确；若要判断选择培养基是否起到了选择作用，需设置接种没有选择作用的细菌通用的牛肉膏蛋白胨培养基做对照，B正确；将实验组和对照组平板倒置，30～37℃恒温培养24～48小时，C错误；计数时通常选择菌落数在30~300的实验组平板进行计数，D正确。
8.答案：C
解析：分解尿素的细菌是异养型，不能以CO2作为碳源，A错误。接种时单手打开皿盖，取适量菌液，滴加到培养基表面，然后用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面，B错误。用稀释涂布平板法统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，C正确。在完全正确的操作情况下，空白对照组中不应出现菌落。若空白对照组出现菌落，说明操作过程中存在微生物污染，属于实验失误，所有实验数据均不应采用，D错误。
9.答案：C
解析：土壤中各种微生物数量不同，细菌大约为70%～90%，其次是放线菌，真菌最少，故不同类型微生物，要按不同稀释倍数进行，A正确；根据选项A可知，测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，需要选用的稀释范围不同，B正确；验证选择培养基是否具有选择作用，需设牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，若后者上的菌落数明显大于前者，说明选择培养基已筛选出一些菌种，C错误；如果得到了3个或3个以上菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，D正确。
10.答案：B
解析：A、利用稀释涂布平板法准确估计菌落数目的关键是有恰当的稀释度，才能保证培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，A正确；
B.若要判断选择培养基是否起到了选择作用，需设置接种在牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，B错误；
C.该实验每隔24h统计一次菌落数目，并以菌落数目稳定时的记录作为结果，C正确；
D.分解尿素的细菌能合成脲酶，将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强，酸碱缓冲剂能够维持pH不变，所以用以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基来培养该细菌后不会使酚红指示剂变红，D正确。
故选B。
11.答案：（1）稀释涂布平板；活菌；当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
（2）高压蒸汽灭菌法；杂菌污染
（3）分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，酚红指示剂变红
解析：（1）微生物接种的方法有很多，最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法，题图所示为稀释涂布平板法，这一方法常用来统计样品中活菌的数目。实验统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
（2）常见的灭菌方法有灼烧灭菌、高压蒸汽灭菌，实验过程中，对培养基进行灭菌常用的方法是高压蒸汽灭菌法。酒精灯火焰附近存在无菌区域，接种操作都应在酒精灯火焰附近进行，目的是防止杂菌污染。
（3）对分离得到的分解尿素的细菌做进一步鉴定时，可在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂进行细菌培养，其鉴定原理是分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，酚红指示剂变红。
12.答案：（1）水、碳源、氮源和无机盐；渗透压、pH
（2）先灭菌后倒平板；高压蒸汽灭菌法；过程①的稀释涂布平板法；小；当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
（3）酚红；尿素分解菌分解尿素产生的氨会使培养基的碱性增强，碱性情况下酚红指示剂呈红色
（4）酒精灯火焰
解析：（1）不同培养基的成分可能会存在差异，但一般都含有水、碳源、氮源和无机盐这四类物质。配制培养基时，除了要考虑各成分外，还要考虑培养基的渗透压、pH等条件。
（2）培养基应先灭菌后倒平板；对培养基进行灭菌时，常采用的方法是高压蒸汽灭菌法。根据题图可知，过程①和过程②所涉及的接种方法分别是稀释涂布平板法和平板划线法【依据：过程①所用的接种工具为涂布器，过程②所用的接种工具为接种环】，其中稀释涂布平板法更适合用于对平板上的菌落进行计数。用稀释涂布平板法计数时，由于两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，所以统计的菌落数往往比实际数目小。
（3）尿素分解菌分解尿素产生的氨会使培养基的碱性增强，碱性情况下酚红指示剂呈红色。
（4）将菌种接种至斜面时，操作应在酒精灯火焰附近进行，这样可以避免杂菌污染。

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