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（5）DNA片段的扩增及电泳鉴定
——高考一轮复习生物学分离鉴定类实验专练
1.下列关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述，错误的是（ ）
A.PCR利用了DNA的热变性原理
B.带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动
C.凝胶中DNA分子迁移速率仅与DNA分子的大小有关
D.向电泳槽中加入缓冲液，没过凝胶1mm为宜
2.关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是（ ）
A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C.在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快
D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
3.对新型冠状病毒进行核酸检测其实就是对新型冠状病毒的遗传物质RNA进行检测。为检测某人是否感染了新型冠状病毒，需要进行以下相关操作：①分析PCR扩增结果；
②从组织样本中提取RNA；
③RT（逆转录）成cDNA；
④采集样本（咽拭子或鼻拭子）；
⑤利用PCR扩增DNA片段。下列相关叙述错误的是（ ）
A.欲得到正确的核酸检测结果，上述操作的顺序是④②⑤③①
B.通过PCR技术可专一地对新型冠状病毒的核酸序列进行扩增
C.操作⑤中，设计的引物自身不能存在互补序列
D.可以通过琼脂糖凝胶电泳法分析PCR扩增结果
4.PCR技术是能在体外进行DNA大量扩增的一种分子生物学技术。下列关于PCR技术的叙述正确的是（ ）
A.PCR过程中所添加的聚合酶和解旋酶都要耐高温
B.利用PCR技术扩增DNA的过程中，体系中酶和引物的含量不变
C.3轮循环后，两条链等长的DNA片段占所有片段的1/4
D.利用电泳技术鉴定PCR产物时，核酸片段的长度与迁移速率呈正相关
5.研究表明，每个人的DNA都不完全相同，DNA指纹技术就是利用这一原理，通过比较DNA来识别身份。警方收集犯罪现场及疑犯的DNA，经DNA扩增得到数量较多的相同DNA，再用限制性内切核酸酶将DNA切成若干片段进行凝胶电泳，结果如图所示。下列有关叙述错误的是（ ）
A.通过比较，基本可以排除疑犯1的嫌疑
B.将DNA切成片段利用了限制性内切核酸酶的高效性
C.DNA扩增得到数量较多的相同DNA，利用的原理是DNA复制
D.不同人的DNA不同主要是因为DNA中的脱氧核苷酸排列顺序不同
6.红豆草是一种品质优良的豆科多年生高蛋白牧草作物，被誉为“牧草皇后”。为提高红豆草的耐盐性、增大种植范围，科研人员将盐生植物碱蓬中的耐盐基因SsPSL转入红豆草中，对转基因耐盐红豆草DNA进行PCR，再对PCR的产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。下列有关叙述错误的是（ ）
A.利用PCR获取和扩增耐盐基因SsPSL，需添加一种引物，四种核糖核苷酸等组分
B.构建基因表达载体是培育转基因耐盐红豆草的核心工作
C.将植物材料和农杆菌共同培养之前，植物材料需要消毒处理
D.凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来
7.PCR和琼脂糖凝胶电泳是基因工程中常用的两种技术，下列对其中所用试剂和操作的叙述正确的是（ ）
A.PCR扩增时加入的各物质中仅有脱氧核苷酸会被消耗
B.在PCR过程中，变性、复性、延伸三个阶段的温度依次降低
C.琼脂糖凝胶电泳需要将DNA和含有指示剂的电泳缓冲液混合后加入点样孔
D.当DNA分子较大时可适当降低凝胶浓度或增大电压以提高电泳速度
8.基因工程中，通过PCR可以特异性地快速扩增目的基因，PCR产物常采用琼脂糖凝胶电泳实验进行鉴定。下列有关该实验的叙述，正确的是（ ）
A.在同一电场作用下，DNA片段越长迁移速率越快
B.DNA分子在凝胶中的迁移速率与凝胶的浓度无关
C.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在红外灯下被检测出来
D.如果引物特异性不强，扩增出来的条带可能不止一条
9.PCR技术在生物工程中应用广泛，PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。下列有关叙述正确的是（ ）
A.PCR过程中用到了缓冲液，缓冲液中一般要添加Mg2+用于激活RNA聚合酶
B.PCR反应体系中须加入耐高温的DNA聚合酶，该酶可在复性过程起作用
C.限制酶切割质粒前后，质粒的长度不变，故无法通过电泳检测质粒是否被切开
D.若采用PCR技术对一个双链目的基因进行扩增，则第n代复制共需要引物2n个
10.“路边摊便宜的羊肉串是否为真的羊肉？”针对这一普通民众关心的食品安全问题，某生物兴趣小组拟运用PCR技术探究不同食品中的动物源性成分。提取街边烧烤摊羊肉和自助烧烤店羊肉组织中的DNA；利用羊、鸭等物种的特异性引物对所提取样品DNA和确定来源猪、牛、羊、鸡、鸭肉的DNA进行PCR扩增，取PCR扩增产物进行电泳检测，实验结果如图所示，下列分析错误的是（ ）
A.该实验设置阴性对照的作用是排除引物非特异性扩增对实验结果的干扰
B.该实验设置阳性对照的目的是排除引物合成、酶的活性及PCR程序设定问题等无关变量对结果的干扰
C.PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的是第三步退火或复性
D.据图实验结果分析街边烧烤摊羊肉和自助烧烤店的羊肉来源分别为鸭源和羊源
11.甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应。某研究小组用甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交相关研究，基本过程包括获取原生质体、诱导原生质体融合、筛选融合细胞、杂种植株再生和鉴定，最终获得高产耐盐碱再生植株。回答下列问题：
（1）根据研究目标，在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否具备形成_________的能力。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进行融合，若甲植物原生质体来自幼苗的根，则乙植物原生质体来自幼苗的_________。
（2）植物细胞壁的主要成分为_________和果胶，在获取原生质体时，常采用相应的酶进行去壁处理。在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使甲原生质体和乙原生质体的_________失活。对处理后的原生质体在显微镜下用_________计数，确定原生质体密度。两种原生质体1：1混合后，通过添加适宜浓度的PEG进行融合；一定时间后，加入过量的培养基进行稀释，稀释的目的是_________。
（3）将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体分散固定在平板中，并独立生长、分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于_________。下列各项中能说明这些愈伤组织只能来自杂种细胞的理由是哪几项？_________。
A.甲、乙原生质体经处理后失活，无法正常生长、分裂
B.同种融合的原生质体因甲或乙原生质体失活而不能生长、分裂
C.培养基含有抑制物质，只有杂种细胞才能正常生长、分裂
D.杂种细胞由于结构和功能完整可以生长、分裂
（4）愈伤组织经_________可形成胚状体或芽。胚状体能长出_________，直接发育形成再生植株。
（5）用PCR技术鉴定再生植株。已知甲植物细胞核具有特异性DNA序列a，乙植物细胞质具有特异性DNA序列b；M1、M2为序列a的特异性引物，N1、N2为序列b的特异性引物。完善实验思路：
Ⅰ.提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR扩增的_________。
Ⅱ.将DNA提取物加入PCR反应体系，_________为特异性引物，扩增序列a；用同样的方法扩增序列b。
Ⅲ.得到的2个PCR扩增产物经_________后，若每个PCR扩增产物在凝胶中均出现了预期的_________个条带，则可初步确定再生植株来自杂种细胞。
12.PCR技术不仅可以扩增目的基因，还可用于定点诱变目的基因等。大引物PCR就是一种定点突变技术。大引物PCR 需要用到引物进行两次 PCR，其操作步骤为：
①根据目的基因序列设计引物，得到两个常规引物，分别为常规上游引物和常规下游引物；②根据突变碱基所处序列位置设计突变上游引物，突变位点位于突变引物序列的中间位置③由突变上游引物与常规下游引物进行第一次PCR反应得到下游大引物；④用得到的下游大引物中和另一个常规上游引物进行第二次PCR扩增，得到突变目的基因序列。回答下列问题：
（1）PCR扩增的第一步是使双链模板 DNA变性。DNA 中G+C的含量与变性要求的温度有关，DNA中G+C的含量越多，要求的变性温度越高。其原因是______________。该PCR扩增技术所需的基本条件是____种引物、原料、模板、_____。
（2）在第一次PCR反应中，形成图示双链 DNA 至少要经过_____次复制。第一次 PCR的产物 DNA的_____条链作为第二次PCR所用的引物。与X射线诱变相比，该突变技术的优点是________________。
（3）如果要利用微生物进一步克隆 PCR定点诱变产物，其步骤包括∶_____、_____、微生物的筛选和培养、从菌群中获取更多目的基因。将获取目的基因和质粒进行连接后，需先用 _____处理农杆菌以便将基因表达载体导入马铃薯细胞，将马铃薯细胞培养成幼苗时经过的两个过程是_____________。检测目的基因是否在马铃薯细胞中转录出了mRNA，所采用的方法是____________________。
答案以及解析
1.答案：C
解析：PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚和延伸，A叙述正确；在电场的作用下，带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳，B叙述正确；在凝胶中，DNA分子迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象有关，C叙述错误；将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜，D叙述正确。
2.答案：A
解析：琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物应根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液，A正确；凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示电泳的进度，而不是指示DNA分子的具体位置，B错误；在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度，DNA分子的大小和构象等有关，在同一电场作用下，DNA片段（带负电）越长，DNA向正极迁移的速率越慢，C错误；凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，D错误。
3.答案：A
解析：题述核酸检测法的主要操作步骤为：采集样本（咽拭子或鼻拭子）→从组织样本中提取RNA→RT（逆转录）成cDNA→利用PCR扩增DNA片段→分析PCR扩增结果，A错误。
进行PCR扩增时，需要加入设计好的一对引物，若引物是根据新型冠状病毒RNA的一段已知序列设计合成的，就能够专一地扩增新型冠状病毒的核酸序列，B正确。
设计引物时，引物自身不能存在互补序列，以避免引物自身通过折叠形成双链区，C正确。
常采用琼脂糖凝胶电泳法检测PCR产物的大小，从而确定是否存在目的片段，D正确。
4.答案：C
解析：PCR过程中不需要解旋酶，A错误；利用PCR合成DNA的过程中，体系中酶的含量不变，但每合成一个DNA分子消耗两个引物，B错误；经过3轮循环后，一个DNA分子扩增为8个DNA分子，其中两条链等长的有2个，占1/4，C正确；电泳时，核酸分子越大，迁移速率越慢，D错误。
5.答案：B
解析：比对犯罪现场的DNA经酶切后的片段与两个疑犯的DNA经酶切后的片段可知，疑犯2的DNA与犯罪现场的DNA相似性较大，基本可以排除疑犯1的嫌疑，A正确；将DNA切成片段利用了限制性内切核酸酶的专一性，B错误；利用PCR技术对DNA进行扩增，能得到数量较多的相同DNA，其原理是DNA的半保留复制，C正确；脱氧核苷酸的排列顺序储存着生物的遗传信息，不同人的DNA不同主要是因为DNA中的脱氧核苷酸排列顺序不同，D正确。
6.答案：A
解析：A、利用PCR获取和扩增耐盐基因SsPSL，需添加两种引物，四种脱氧核苷酸等组分，A错误；
B.构建基因表达载体是基因工程的核心，B正确；
C.为防止杂菌污染，将植物材料和农杆菌共同培养之前，植物材料需要消毒处理，C正确；
D.DNA分子的大小和构象等有关，凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，D正确。
故选A。
7.答案：D
解析：本题考查PCR技术和琼脂糖凝胶电泳技术。在PCR过程中，引物也会被消耗，成为新合成的DNA的一部分，A错误；变性、复性、延伸三个阶段的温度依次为90℃以上、50℃左右、72℃左右，并不是依次降低，B错误；与DNA混合的是含指示剂的载样缓冲液，不是电泳缓冲液，C错误；电泳过程中，DNA分子移动速度与凝胶浓度、DNA分子大小和构象、电压等有关，故当DNA分子较大时可适当降低凝胶浓度或增大电压以提高电泳速度，D正确。
8.答案：D
解析：A、在同一电场作用下，DNA片段越长迁移速率越慢，A错误；
B.凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移速率，B错误；
C.琼脂糖凝胶中的DNA分子经过核酸染料染色后可在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，C错误；
D.如果引物特异性不强，引物可能会与目的基因以外的其他的DNA片段结合，扩增出来的条带可能不止一条，D正确。
故选D。
9.答案：D
解析：A、PCR过程中用到了缓冲液，缓冲液中一般要添加Mg2+用于激活DNA聚合酶，A错误；
B.PCR反应体系中须加入耐高温的DNA聚合酶，该酶主要在延伸过程起作用，B错误；
C.因为质粒被切开后可能成为多个DNA片段，相对分子质量彼此不同，因而可通过电泳检测，C错误；
D.PCR技术大量扩增目的基因时，第n次复制形成2"个DNA，相当于新合成2n-1个DNA分子，合成一个DNA分子需要两个引物，因此需要的引物数目为2n-1x2=2n，D正确。
故选D。
10.答案：C
解析：该实验设置阴性对照的目的是保证羊特异性引物只能扩增羊的DNA，而不会与其他动物DNA相关区域结合完成扩增，即排除引物非特异性扩增对实验结果的干扰，A正确；该实验设置阳性对照是为了确定所用引物及PCR相关操作等都正常，能正常扩增相应DNA，排除引物合成问题、酶的活性问题及PCR程序设定问题等无关变量对实验结果的干扰，B正确；PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的应该是第二步退火或复性，C错误；题图实验结果分析街边烧烤摊羊肉和自助烧烤店的羊肉来源分别为鸭源和羊源，D正确。
11.答案：（1）再生；叶
（2）纤维素；细胞质和细胞核；血细胞计数板；降低PEG浓度，使其失去融合作用
（3）同一个杂种融合原生质体；ABD
（4）再分化；根和芽
（5）模板；M1、M2；凝胶电泳；1
解析：（1）在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否具备再生的能力。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进行融合，若甲植物原生质体采用幼苗的根为外植体，则乙植物可用幼苗的叶为外植体。
（2）植物细胞壁的主要成分为纤维素和果胶，在获取原生质体时，常采用相应的酶进行去壁处理。甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应，在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使甲原生质体和乙原生质体的细胞质和细胞核失活，融合后具有甲植物的细胞核基因和乙植物的细胞质基因。对处理后的原生质体在显微镜下用血细胞计数板计数，确定原生质体密度。两种原生质体1:1混合后，通过添加适宜浓度的PEG进行融合；一定时间后，加入过量的培养基进行稀释，稀释的目的是降低PEG浓度，使其失去融合作用。
（3）将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体分散固定在平板中，并独立生长、分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于同一个杂种融合的原生质体。未融合的原生质体因为细胞质或细胞核的失活，无法正常生长、分裂；同种融合的原生质体也因为甲原生质体细胞质或乙原生质体细胞核失活而不能生长、分裂：只有杂种细胞才具备有活性的细胞质和细胞核，可以生长、分裂，因此这些愈伤组织只能来自于杂种细胞。故选ABD。
（4）愈伤组织经再分化能形成胚状体或芽。胚状体能长出根、芽，直接发育成再生植株。
（5）Ⅰ.提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR扩增的模板。
Ⅱ.将DNA提取物加入PCR反应体系，M1、M2为特异性引物，扩增序列a；用同样的方法扩增序列b。
Ⅲ.得到的2个PC扩增产物经凝胶电泳后，若每个PCR扩增产物在凝胶中均出现了预期的1个条带，则可初步确定再生植株来自于杂种细胞。
12.答案：（1）DNA中G和C之间有三个氢键，A和T之间只有两个氢键，G+C含量越多，其氢键越多，变性时所需温度越高；3；耐高温的DNA聚合酶
（2）2；一；目的性强、突变概率高
（3）目的基因与载体结合；将重组DNA导入受体细胞；Ca2+；脱分化和再分化；PCR/核酸分子杂交技术
解析：（1）PCR扩增的第一步是使双链模板DNA变性，当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链。DNA中G和C之间有三个氢键，A和T之间只有两个氢键，G+C含量越多，其氢键越多，变性时所需温度越高。PCR扩增的基本条件包括DNA模板、4种脱氧核苷三磷酸、引物、耐高温的DNA聚合酶、缓冲液等，在该PCR扩增中，需要常规上游引物，常规下游引物和突变上游引物3种引物。
（2）由于DNA聚合酶只能从引物的3'端开始延伸，第一次复制时，以原有的DNA为模板，用突变上游引物可以合成突变部位在5'端的单链DNA，第二次复制时，可用突变部位在5'端的单链DNA为模板，用常规下游引物合成突变部位在3端的单链DNA，因此，在第一次PCR反应中，形成图示双链DNA至少要经过2次复制。DNA聚合酶只能从引物的3’端开始延伸，所以，第一次PCR的产物DNA的一条链作为第二次PCR所用的引物，与X射线诱变相比，该突变技术目的性强、突变概率更高。
（3）利用微生物进一步克隆PCR定点诱变产物，即利用基因工程技术来进行克隆，其基本步骤包括目的基因的获取（图中PCR的产物）、目的基因与载体结合、将重组DNA导入受体细胞、微生物的筛选和培养、从菌群中获取更多目的基因等。重组质粒导入微生物时，需要用Ca2+处理农杆菌，使农杆菌处于感受态，以便将基因表达载体导入马铃薯细胞。将马铃薯细胞培养成幼苗需要用到植物组织培养技术，包括脱分化和再分化两个过程。利用核酸分子杂交技术检测目的基因是否在受体细胞中转录出了mRNA。

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