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第10单元　生物技术与工程
第1课　微生物的培养技术及应用
[复习目标]　1.掌握培养基的成分及其作用，比较平板划线法和稀释涂布平板法的异同；掌握无菌技术及微生物的纯培养。(科学思维)　2.设计实验探究微生物培养的条件，利用选择培养基分离细菌，运用相关技术解决生产中有关微生物的计数。(科学探究)　3.关注有害微生物的控制及宣传健康生活等。(生命观念、社会责任)
考点一　微生物的基本培养技术
1．培养基的配制
(1)概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
(2)营养组成：各种培养基一般都含有水、碳源(提供碳元素的物质)、氮源(提供氮元素的物质)和无机盐等营养物质，此外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。
(3)配制原则
(4)种类
①按物理状态可分为液体培养基和固体培养基。
②按功能可分为选择培养基和鉴别培养基。
[教材深挖]
(选择性必修3 P10旁栏思考)培养基需要氮源的原因是培养基中的氮元素是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的。
2．无菌技术
(1)概念：在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。
(2)目的：获得纯净的微生物培养物。
(3)常用方法
(4)无菌技术的主要方法及适用对象(连一连)
3．微生物的纯培养
(1)概念：由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。
(2)过程：包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤。
(3)常用方法：平板划线法和稀释涂布平板法。
(4)实例——酵母菌的纯培养
[教材深挖]
(选择性必修3 P12～13探究·实践)(1)在未接种的培养基表面应该没有菌落生长，如果有，说明培养基被杂菌污染。
(2)在接种酵母菌的培养基上，如果观察到了不同形态的菌落，可能是接种的菌种不纯或者无菌操作不规范等原因引起的。
[易错辨析]
1．微生物在琼脂固体培养基表面或内部生长，可以形成肉眼可见的菌落。(√)
2．在培养霉菌时，一般需要将培养基调至中性或弱碱性。(×)
3．生物消毒法是指利用生物或其代谢物除去环境中的部分微生物的方法。(√)
4．为了避免周围环境中微生物的污染，接种过程中许多操作都应在超净工作台上并在酒精灯火焰附近进行。(√)
5．倒平板过程中，将培养基倒入培养皿并盖上皿盖后，立即将培养皿倒置。(×)
6．培养酵母菌时，可将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入适宜温度的恒温培养箱中培养24～48 h。(√)
1．培养物、纯培养物、纯培养辨析
2．平板划线操作的注意事项
(1)灼烧接种环，待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。
(2)第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使微生物的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
(3)划线时最后一区不要与第一区相连。
(4)划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。
(5)操作第一步即取菌种之前及每次划线之前都需要进行火焰灼烧灭菌，划线操作结束时，仍需灼烧接种环，每次灼烧的目的如表：
时期 第一次操作 每次划线之前 划线结束
目的 杀死接种环上原有的微生物 杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线菌种数目减少 杀死接种环上残存的菌种，避免微生物污染环境和感染操作者
命题点1　围绕培养基的配制过程考查生命观念及科学探究
1．(2022·浙江杭州模拟)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的过程中，关于倒平板的描述正确的是(　　)
A．倒平板后无需将培养基进行湿热灭菌
B．将倒好培养基的培养皿轻放在桌上，不能晃动
C．等待平板冷却5～10 s，将平板倒过来放置
D．等培养基冷却至40 ℃左右时，方可进行倒平板
解析：选A。配制培养基倒平板前，需要对培养基进行湿热灭菌，倒平板后无需将培养基进行湿热灭菌，A正确；每倒入一个培养皿后立即将培养皿置于水平位置上，并轻轻晃动，使培养基铺满底部，待凝固后即形成平面，B错误；等待平板冷却至凝固，将平板倒过来放置使皿盖在下，皿底在上，C错误；培养基冷却至50 ℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板，防止杂菌污染，D错误。
[归纳总结]　微生物对主要营养物质的需求特点
(1)自养型微生物所需的主要营养物质是无机盐，碳源可来自大气中的CO2，氮源可由含氮无机盐提供。
(2)异养型微生物所需的营养物质主要是有机物，即碳源必须由含碳有机物提供，氮源也主要由有机物提供，部分异养型微生物也可以利用无机氮源。
命题点2　围绕无菌技术考查科学探究
2．(2022·山东淄博一模)下列关于灭菌或消毒的相关叙述正确的是(　　)
A．巴氏消毒法常用于消毒牛奶，可以杀死牛奶中的全部微生物
B．在接种过程中，试管口、瓶口等都可以通过火焰灼烧进行灭菌
C．培养基、接种环、涂布器、外植体可采用湿热灭菌法进行灭菌
D．可用紫外线照射接种室，以杀死空气中的所有微生物及芽孢和孢子
解析：选B。巴氏消毒法常用于消毒牛奶，可以杀死牛奶中的绝大多数微生物，但不是全部，A错误；培养基采用湿热灭菌法进行灭菌，涂布器、接种环采用灼烧灭菌法进行灭菌，外植体进行消毒，不能灭菌，C错误；可用紫外线照射接种室，以杀死空气中的所有微生物，不包括芽孢和孢子，D错误。
3．(2022·重庆名校联盟联考)防止杂菌污染，获得纯净的培养物，是研究和应用微生物的前提。下列叙述错误的是(　　)
A．实验室里可用紫外线或化学药物对物体表面或空气进行消毒
B．实验室里不可吃东西，离开时一定要洗手以防被微生物感染
C．接种环、接种针等用具应在酒精灯火焰的内焰部位灼烧灭菌
D．使用后的培养基在丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境
解析：选C。常用的消毒方法有煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药物消毒法和紫外线消毒法等，实验室里可以用紫外线或化学药物进行消毒，A正确；实验室中，切记不可吃东西、喝水，离开实验室时一定要洗手，以防止被微生物感染，B正确；接种环、接种针等金属用具，应在酒精灯火焰的充分燃烧层即外焰部位灼烧灭菌，C错误；使用后的培养基丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境，D正确。
命题点3　围绕平板划线法的接种过程考查科学探究
4．(2022·山东德州质检)如图为微生物的实验室培养的有关操作，相关叙述错误的是(　　)
A．步骤①中，需将接种工具灼烧至变红，以杀灭杂菌
B．步骤②中，将接种工具冷却时不宜距酒精灯火焰太远
C．图中接种方法的目的是使菌种逐渐稀释，经培养后获得纯种菌落
D．接种后应将培养皿倒置培养，培养后可以根据结果进行微生物计数
解析：选D。图示的平板划线法不能用于微生物的计数，D错误。
5．(2022·江苏泰州质检)如图为用固体培养基培养某细菌的结果，对此下列有关叙述正确的是(　　)
A．此结果是利用平板划线法得到的，划线的顺序是①→③→②
B．图示显示的接种方法为稀释涂布平板法，②处可见单菌落
C．每次划线前均需灼烧接种环，其目的都是防止杂菌污染
D．培养基中的糖类、琼脂等含碳物质，可为该细菌提供碳源
解析：选A。根据菌落的生长状态可知，此结果是利用平板划线法得到的，划线的顺序是①→③→②，②处可见单菌落，A正确，B错误；除第一次划线外，每次划线前灼烧接种环的目的都是杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，从而保证菌落来自上一次划线的末端，C错误；培养基中的琼脂是凝固剂，不能为细菌提供碳源，D错误。
考点二　微生物的选择培养和计数
1．微生物的选择培养
(1)选择培养基：允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
(2)稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释后，将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基表面，进行培养。
①系列稀释操作
系列稀释：移液管需要经过灭菌。操作时，试管口和移液管应离火焰1～2 cm处。操作过程如下：
②涂布平板操作
序号 图示 操作
1 取0.1 mL菌液，滴加到培养基表面
2 将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中
3 将沾有少量酒精的涂布器在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布
4 用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使菌液涂布均匀
③培养：待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37 ℃的恒温培养箱中培养1～2 d。
2．微生物的数量测定
(1)稀释涂布平板法
①计数原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
②计数标准：为了保证结果准确，一般选择菌落数为30～300的平板进行计数。
③计数方法：通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数为30～300、适于计数的平板。在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。
④当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，统计结果一般用菌落数表示。
(2)显微镜直接计数法
①计数原理：利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。
②优点：是一种常用的、快速直观的测定微生物数量的方法。
③缺点：统计的结果一般是死菌数和活菌数的总和。
[教材深挖]
(选择性必修3 P18正文，拓展)为什么测定活菌的数量不能用平板划线法？
提示：由于在所划的线中，一般只有最后一次划线的末端才会形成只由一个细菌形成的菌落，而其他一些菌落往往由两个细菌或多个细菌繁殖而成，而在计数时一个菌落对应着一个细菌，这样在划线所得的平板中，菌落数目远低于活菌的实际数值，所以不能用平板划线法测定活菌数量。
3．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
[教材深挖]
(选择性必修3 P18～19探究·实践)为什么只有能分解尿素的微生物才能在该培养基上生长？
提示：分解尿素的微生物能合成脲酶，而脲酶可将尿素分解成氨，从而为微生物提供氮源。
[易错辨析]
1．对细菌进行计数可采用稀释涂布平板法，而不能用平板划线法。(√)
2．筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源。(√)
3．分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的酸碱度降低。(×)
4．统计菌落数目时为保证结果准确，一般选择菌落数目最多的平板进行统计。(×)
1．选择培养基四种常见制备方法及实例
(1)加入某些特定的物质(前提是培养基具备全部营养成分)
(2)改变培养基的营养成分
(3)利用培养基中的“特定化学成分”进行分离
(4)通过某些“特殊环境”进行分离
2．平板划线法和稀释涂布平板法的比较
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
图示
过程 用接种环在固体培养基表面连续划线，将聚集的菌种逐步分散到培养基的表面 将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养
优点 可以观察菌落特征，对混合菌进行分离 可以计数，可以观察菌落特征
缺点 不能计数 吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延
相同点 都使用固体培养基，若没有特殊要求，两种方法都可以用来分离微生物
3.两种微生物计数方法的比较
计数方法 间接计数法(稀释涂布平板法) 直接计数法(显微计数法)
计算方法 每克样品中的菌落数＝×MC：某稀释度下平板上生长的平均菌落数；V：涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)；M：稀释倍数 每毫升原液所含细菌数：每小格内平均细菌数×400×104×稀释倍数
缺点 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 统计的结果一般是死菌数与活菌数的总和
结果 比实际值偏小 比实际值偏大
命题点1　围绕选择培养基及微生物的筛选考查科学探究
1．(2022·德州二模)温泉中含有能够分解淀粉的耐热古细菌，在固体培养基中，该类细菌分解淀粉会形成透明圈。如图表示筛选能高效产生淀粉酶的耐热古细菌的过程，下列分析正确的是(　　)
A．②过程是利用稀释涂布平板法分离并筛选耐热古细菌
B．配制Ⅰ号培养基时需要加入琼脂，需要调节pH＜7
C．为防止杂菌污染需要对Ⅰ、Ⅱ号培养基及培养皿进行干热灭菌
D．从Ⅰ号培养基中选择透明圈最小的菌落接种到Ⅱ号培养基
解析：选A。Ⅰ号培养基中的菌落在平板上均匀分布，由此推测②过程是利用稀释涂布平板法分离并筛选耐热古细菌，A正确；配制Ⅰ号培养基时需要加入琼脂，需要调节pH≥7，B错误；培养基通常采用湿热灭菌法灭菌，培养皿为保持干燥可采用干热灭菌法灭菌，C错误；透明圈直径越大，说明产生淀粉酶的能力越强，故应从Ⅰ号培养基中选择透明圈最大的菌落接种到Ⅱ号培养基，D错误。
2．(2021·山东卷)解脂菌能利用分泌的脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸并吸收利用。脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色。将不能直接吸收脂肪的甲、乙两种菌分别等量接种在醇溶青琼脂平板上培养。甲菌菌落周围呈现深蓝色，乙菌菌落周围不变色，下列说法错误的是(　　)
A．甲菌属于解脂菌
B．实验中所用培养基以脂肪为唯一碳源
C．可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比
D．该平板可用来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力
解析：选B。根据题干信息“甲菌菌落周围呈现深蓝色”，说明甲可以分泌脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸，脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色，因此甲菌属于解脂菌，A正确；乙菌菌落周围没有出现深蓝色，说明乙菌落不能产生脂肪酶，不能利用脂肪为其供能，但乙菌菌落也可以在培养基上生存，说明该培养基不是以脂肪为唯一碳源，B错误；可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比，更加直观，C正确；可以利用该平板来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力，观察指标可以是菌落周围深蓝色圈的大小，D正确。
命题点2　围绕微生物的分离和计数考查科学思维及科学探究
3．如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验中样品稀释示意图。据图分析正确的是(　　)
A．3号试管中的菌落稀释倍数为103倍
B．4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数可能是5号试管的10倍
C．5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×107个
D．该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要高
解析：选B。2号试管中的菌落稀释倍数为103倍，A错误；4号试管的稀释倍数为105倍，5号试管的稀释倍数为106倍，因此4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数可能是5号试管的10倍，B正确；5号试管的稀释倍数为106倍，每克土壤中的菌株数为(168＋175＋167)÷3÷0.1×106＝1.7×109个，C错误；稀释涂布平板法得到的菌落可能存在两个或多个细菌细胞长成一个菌落，使该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要低，D错误。
4．(2020·全国卷Ⅰ)某种物质S(一种含有C、H、N的有机物)难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解S。研究人员按照如图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和S，乙的组分为无机盐、水、S和Y。
回答下列问题：
(1)实验时，盛有水或培养基的摇瓶通常采用____________________的方法进行灭菌。乙培养基中的Y物质是________。甲、乙培养基均属于________培养基。
(2)实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107个/mL，若要在每个平板上涂布100 μL稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个，则至少应将摇瓶M中的菌液稀释________倍。
(3)在步骤⑤的筛选过程中，发现当培养基中的S超过某一浓度时，某菌株对S的降解量反而下降，其原因可能是________________________(答出1点即可)。
(4)若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，请写出主要实验步骤：_________________________________________________________________
_________________________________________________________________。
(5)上述实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供4类营养物质，即_________________________。
解析：(1)常用高压蒸汽灭菌法处理盛有水或培养基的摇瓶，乙为固体培养基，故需要加入Y琼脂；甲和乙培养基可以用于筛选能降解S的菌株，故均属于选择培养基。(2)若要在每个平板上涂布100 μL稀释后的菌液，且每个平板上长出的菌落数不超过200个，假设稀释倍数为a，在每个平板上涂布100 μL(0.1 mL)稀释后的菌液，菌落则有200a÷0.1＝2×107，则稀释倍数为a＝104。(3)当培养基中的S超过某一浓度后，可能会抑制菌株的生长，从而造成其对S的降解量下降。(4)要测定淤泥中能降解S的细菌的细胞数，可以取淤泥加无菌水制成菌悬液，稀释涂布到乙培养基上，培养后进行计数。(5)甲、乙培养基均含有水、无机盐、碳源、氮源。
答案：(1)高压蒸汽灭菌　琼脂　选择　(2)104　(3)S的浓度超过某一值时会抑制菌株的生长　(4)取淤泥加入无菌水中，涂布(或稀释涂布)到乙培养基上，培养后计数　(5)水、碳源、氮源和无机盐
[真题演练]
1．(2021·天津卷)下列操作能达到灭菌目的的是(　　)
A．用免洗酒精凝胶擦手
B．制作泡菜前用开水烫洗容器
C．在火焰上灼烧接种环
D．防疫期间用石炭酸喷洒教室
解析：选C。用免洗酒精凝胶擦手属于消毒，A不符合题意；制作泡菜前用开水烫洗容器属于消毒过程，B不符合题意；在火焰上灼烧接种环能达到灭菌目的，C符合题意；防疫期间用石炭酸喷洒教室，属于消毒，D不符合题意。
2．(2021·北京卷)人体皮肤表面存在着多种微生物，某同学拟从中分离出葡萄球菌。下列操作不正确的是(　　)
A．对配制的培养基进行高压蒸汽灭菌
B．使用无菌棉拭子从皮肤表面取样
C．用取样后的棉拭子在固体培养基上涂布
D．观察菌落的形态和颜色等进行初步判断
解析：选C。为避免杂菌污染，需对配制的培养基进行高压蒸汽灭菌，A正确；葡萄球菌需从人体皮肤的微生物中分离，为避免杂菌污染，故需要使用无菌棉拭子从皮肤表面取样，B正确；不能直接用取样后的棉拭子在固体培养基上涂布，C错误；根据微生物在固体培养基表面形成的菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等特征进行初步判断，D正确。
3．(多选)(2021·江苏卷)为提高一株石油降解菌的净化能力，将菌涂布于石油为唯一碳源的固体培养基上，以致死率为90%的辐照剂量诱变处理，下列叙述不合理的是(　　)
A．将培养基分装于培养皿中后灭菌，可降低培养基污染的概率
B．涂布用的菌浓度应控制在30～300个/mL
C．需通过预实验考察辐射时间对存活率的影响，以确定最佳诱变时间
D．挑取培养基上长出的较大单菌落，经纯化后进行降解效率分析
解析：选AB。培养基应先灭菌再分装于培养皿中，A不合理；涂布用的菌浓度应控制在106倍，以避免菌种重叠而不能得到单菌落，B不合理；需通过预实验考察辐射时间对存活率的影响，再进行正式实验，以确定最佳诱变时间，C合理；石油降解菌能分解石油获得碳源，形成菌落，挑取培养基上长出的较大单菌落，纯化后进行降解效率分析，以获得能高效降解石油的菌种，D合理。
4．(2022·全国乙卷)化合物S被广泛应用于医药、食品和化工工业。用菌株C可生产S，S的产量与菌株C培养所利用的碳源关系密切。为此，某小组通过实验比较不同碳源对菌体生长和S产量的影响，结果见表。
碳源 细胞干重(g/L) S产量(g/L)
葡萄糖 3.12 0.15
淀粉 0.01 0.00
制糖废液 2.30 0.18
回答下列问题：
(1)通常在实验室培养微生物时，需要对所用的玻璃器皿进行灭菌，灭菌的方法有____________________(答出2点即可)。
(2)由实验结果可知，菌株C生长的最适碳源是________；用菌株C生产S的最适碳源是_______。菌株C的生长除需要碳源外，还需要________________(答出2点即可)等营养物质。
(3)由实验结果可知，碳源为淀粉时菌株C不能生长，其原因是______________。
(4)若以制糖废液作为碳源，为进一步确定生产S的最适碳源浓度，某同学进行了相关实验。请简要写出实验思路：________________________________。
(5)利用制糖废液生产S可以实现废物利用，其意义是_____________(答出1点即可)。
解析：(1)在实验室培养微生物时，对玻璃器皿进行灭菌的方法有干热灭菌和高压蒸汽灭菌等。(2)由实验结果可知，以葡萄糖作为碳源时，细胞干重最高，最有利于菌株C生长；而以制糖废液作为碳源时，S产量最高，此时更有利于生产S。微生物生长所需的营养物质除碳源外，一般还包括水、氮源和无机盐等。(3)碳源为淀粉时菌株C不能生长，可能是因为菌株C缺乏能分解淀粉的酶，不能分解利用淀粉。(4)若要进一步确定生产S的最适制糖废液浓度，可分别向一系列含有不同浓度制糖废液的培养基中接种等量且适量的菌株C，放在相同且适宜的条件下培养，一段时间后检测培养液中S的含量。(5)利用制糖废液生产S可以实现废物利用，减少环境污染。
答案：(1)干热灭菌和高压蒸汽灭菌　(2)葡萄糖　制糖废液　水、氮源、无机盐　(3)菌株C缺乏能分解淀粉的酶，不能分解利用淀粉　(4)分别向一系列含有不同浓度制糖废液的培养基中接种等量且适量的菌株C，放在相同且适宜的条件下培养，一段时间后检测培养液中S的含量　(5)减少环境污染(合理即可)
[长句特训]
土壤有“微生物的天然培养基”之称，如图表示对土壤中某种微生物进行分离和计数而进行的对样品的稀释和稀释液的取样培养流程示意图。请据图回答有关问题：
设问形式1　必备知识及其应用类命题
(1)图示统计样品活菌数目的方法叫做______________法，主要包括______________操作和______________操作。
设问形式2　必备知识表述类命题
(2)当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的______________，一般选择菌落数在__________________的平板进行计数。
设问形式3　必备知识应用类命题
(3)图中选择了104、105、106、107倍的稀释液进行平板培养，最可能是测定土壤中____________的数量，平板需要在____________ ℃温度下培养______________d。
设问形式4　问题解决类命题
(4)如果怀疑培养基被污染导致统计结果有误，则需要做对照实验，方法是_________________________________________________________________
_________________________________________________________________。
解析：(1)据图分析，图示为稀释涂布平板法进行活菌计数，这一过程包括梯度稀释操作和涂布平板操作。(2)当样品的稀释度足够高时，稀释涂布平板法接种的平板上的单菌落来源于样品稀释液中的一个活菌；一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。(3)图中选择用104、105、106、107倍的稀释液进行平板培养，最可能是测定土壤中细菌的数量；还需要在30～37 ℃温度下、pH调至中性或弱碱性培养1～2 d。(4)如果怀疑培养基被污染导致统计结果有误，则需要做对照实验，可将一个培养基在不加土壤溶液的情况下与加入土壤溶液的培养基同时培养。
答案：(1)稀释涂布平板　梯度稀释　涂布平板 (2)一个活菌　30～300　 (3)细菌　30～37　1～2　(4)将一个培养基在不加土壤溶液的情况下与加入土壤溶液的培养基同时培养
第1课　微生物的培养技术及应用
[基础练透]
1．已知某种细菌以CO2为唯一碳源，下列相关叙述正确的是(　　)
A．可推测该细菌的代谢类型为自养需氧型
B．无机盐是该细菌不可缺少的营养物质
C．培养过程中碳源同时充当该细菌的能源物质
D．培养该细菌的培养基中不需要添加氮源
解析：选B。该细菌以CO2为唯一碳源，可推测该细菌的代谢类型为自养型，但不能确定是不是需氧型，A错误；微生物生长一般需要水、碳源、氮源和无机盐等营养物质，B正确；CO2不能为微生物提供能量，C错误；氮源是微生物必需的营养物质，培养该细菌的培养基中需添加氮源，D错误。
2．如图是两种不同接种方法所得的结果，下列说法正确的是(　　)
A．A、B两种接种方法使用的接种工具在接种前都要在酒精灯火焰上灼烧，且处理方法完全相同
B．进行接种之前都要对操作者双手和培养基进行灭菌处理
C．A方法划线时，是沿方向①②③进行，且在③区域看到有单个菌落，可直接计数
D．A、B所使用的培养基可以相同，且制作时要先灭菌再倒平板
解析：选D。图A使用的工具是接种环，接种前需在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧灭菌，冷却后再进行划线操作，图B使用的接种工具是涂布器，涂布器的处理方法是将沾有少量酒精的涂布器在酒精灯上引燃，燃尽且冷却后即可涂布，A错误；操作者的双手应进行酒精消毒处理，B错误；平板划线法不能对细菌计数，C错误；A、B所使用的培养基可以相同，且制作时要先灭菌再倒平板，D正确。
3．如表是某培养基的成分，下列相关叙述错误的是(　　)
编号 ① ② ③ ④ ⑤
成分 (NH4)2SO4 KH2PO4 FeSO4 CaCl2 H2O
含量 0.4 g 4.0 g 0.5 g 0.5 g 定容至100 mL
A．此培养基可用于自养型微生物的培养
B．培养基中若加入氨基酸，则它可充当碳源、氮源
C．若除去①，此培养基可培养硝化细菌
D．此培养基按功能分类属于选择培养基
解析：选C。由题表可知，此培养基中不含含碳有机物，自养型微生物可利用空气中的CO2作碳源，故该培养基适合用来培养自养型微生物，A正确；氨基酸的元素组成主要为C、H、O、N，培养基中若加入氨基酸，则它可充当碳源、氮源，B正确；硝化细菌能进行化能合成作用，但不能固氮，因此若除去①，此培养基不能培养硝化细菌，C错误；此培养基缺少碳源，可以筛选出自养型微生物，故此培养基按功能分类属于选择培养基，D正确。
4．微生物的接种技术有很多，有关常用的两种微生物接种方法的叙述不正确的是(　　)
A．只能应用于固体培养基接种
B．都可以用于微生物的计数
C．接种培养后均可获得单菌落
D．接种用具都需进行严格灭菌
解析：选B。平板划线法和稀释涂布平板法都只能用于固体培养基接种，A正确；稀释涂布平板法接种可以形成单菌落，所以常用来进行微生物的计数，平板划线法常用来筛选分离微生物，B错误；两种接种方法在培养基中都可形成单菌落，C正确；为防止杂菌污染，接种用具需要灭菌后使用，D正确。
5．微信传言手机屏幕上的细菌比马桶按钮上的多。两个兴趣小组分别展开如图所示的实验过程。下列分析错误的是(　　)
A．通过观察菌落的形态、大小，可知手机屏幕和马桶按钮上都存在多种微生物
B．以上两组实验接种方法相同，且都需要用到酒精灯、涂布器等
C．该实验对照组可以设置为取相同培养基接种等量无菌水进行培养
D．两组实验操作结果截然不同，说明其中有一组实验的操作出现失误
解析：选D。不同的菌落形态、大小不同，图示两个报道中的手机屏幕和马桶按钮的实验结果都有多种形态的菌落，即存在多种微生物，A正确；根据图示中菌落分布情况分析，该实验的接种方法为稀释涂布平板法，该方法用到的工具有酒精灯、移液管、涂布器等，B正确；该实验的对照组应设置为取相同培养基接种等量无菌水进行培养，C正确；两报道实验操作结果截然不同，应是由于手机屏幕的取样和马桶的取样都不相同引起的，D错误。
6．土壤中有丰富的微生物，若要利用其中某种微生物，则需要进行菌种的分离和纯化，过程如图。下列相关叙述错误的是(　　)
A．若目的是筛选分解尿素[CO(NH2)2]的细菌，则尿素可以作为该菌的氮源和碳源
B．3号试管的稀释倍数为104，理论上3号试管的活菌数应是4号试管的10倍
C．4号试管的结果表明每克土壤中的活菌数约为1.1×108个
D．该种方法统计的菌落数比活菌的实际数目少
解析：选A。若目的是筛选分解尿素[CO(NH2)2]的细菌，则尿素可以作为该菌的氮源，不能作为碳源，A错误；由样品稀释示意图分析可知，3号试管的稀释倍数为104倍，理论上3号试管的活菌数应是4号试管的10倍，B正确；4号试管进行稀释涂布平板法计数的结果表明每克土壤中的菌株数为(110＋108＋112)÷3×10×105＝1.1×108个，C正确；稀释涂布平板法得到的菌落可能存在两个或多个细菌细胞长成一个菌落的现象，使该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目少，D正确。
7．(多选)化工厂的污水池中含有一种有害且难以降解的有机化合物A，研究人员用化合物A、磷酸盐、镁盐以及一些微量元素配制的培养基成功筛选到能高效降解化合物A的细菌(目的菌)，实验的主要步骤如图所示。下列有关叙述错误的是(　　)
A．该培养基中化合物A只可作碳源
B．实验培养过程中进行振荡培养，可使目的菌和培养液充分接触
C．实验操作过程中，获得纯净“目的菌”的关键是防止外来杂菌污染
D．将固体培养基得到的目的菌重复多次上述实验的目的是获得大量菌种
解析：选AD。磷酸盐、镁盐以及一些微量元素中不含有N元素，推测该培养基中有机化合物A可能既作碳源又作氮源，A错误；实验培养过程中进行振荡培养可以增加培养液中的溶氧量，满足微生物对氧气的需求，同时可使目的菌和培养液充分接触，B正确；筛选微生物的过程中应注意防止外来杂菌污染，C正确；在以化合物A为唯一碳源和氮源的培养基中只有能降解化合物A的微生物才能生长繁殖，不能利用化合物A的微生物因缺乏碳源和氮源，无法生长繁殖，将固体培养基得到的目的菌重复多次上述实验的目的是对菌种“纯化”，D错误。
8．下面是有关土壤中分解尿素的细菌分离和计数的实验过程，请据图回答相关问题：
(1)为分离出土壤中分解尿素的细菌，应该用__________________的培养基进行分离，并加入__________指示剂进行鉴别。
(2)若取土样5 g，应加入__________ mL的无菌水配制成稀释10倍土壤溶液。因土壤中细菌密度很大，需要不断加以稀释，配制成如图所示的不同浓度的土壤溶液，分别吸取0.1 mL的稀释液涂布到固体培养基上，这种接种方法称为______________。某同学用该方法接种后，在某个平板上没有得到菌落，可能的原因是_______________________________________________。
(3)将接种的培养皿放置在37 ℃恒温培养箱中培养24～48 h，观察并统计符合要求的菌落数，结果如表，其中____________________倍的稀释比较合适。
稀释倍数 103 104 105 106 107
菌落数 >500 367 248 36 18
解析：(1)为分离出土壤中分解尿素的细菌，应该用以尿素为唯一氮源的培养基进行分离，并加入酚红指示剂进行鉴别。尿素分解产生的NH3使酚红指示剂表现为红色。(2)取土样5 g，制成稀释10倍土壤溶液，应加入45 mL的无菌水配制。分离细菌并计数，应使用稀释涂布平板法。用该方法接种后，在某个平板上没有得到菌落，可能的原因是涂布器灼烧后未冷却就用于涂布，杀死了菌种。(3)菌落数在30～300之间的平板符合统计要求，据表可知，105和106倍的稀释比较合适。
答案：(1)以尿素为唯一氮源　酚红　(2)45　稀释涂布平板法　涂布器灼烧后未冷却就用于涂布，杀死了菌种　(3)105和106
[能力提升]
9．(2022·北京西城区二模)为筛选高效抑制苹果树腐烂病菌生长的芽孢杆菌，取直径为3 mm的果树腐烂病菌菌落转移至A处，B处接种芽孢杆菌(图1)。培养若干天，实验组与对照组的结果如图2所示。下列抑菌率的计算公式正确的是(　　)
　
图1　　　　　　　　图2　　
A．×100%　　　　 B．×100%
C．×100% D．×100%
解析：选B。根据题干信息分析，图1中应该取直径为3 mm的果树腐烂病菌菌落移置于A处，B处接种芽孢杆菌，培养若干天后，测量并计算抑菌率，图2显示实验组果树腐烂病菌的菌落直径为d，对照组果树腐烂病菌的菌落直径为D，又因为一开始接种的苹果腐烂病菌的直径为3 mm，则抑菌率(%)＝×100%。
10．土壤中有些细菌可以降解焦化厂淤泥中的污染物X。如图是分离、纯化和筛选高效降解X的优质菌株的过程。下列叙述中正确的是(　　)
A．甲是土样经灭菌后用无菌水配置的土壤稀释液
B．稀释涂布平板法操作简单，且单菌落容易形成
C．丙培养一段时间后，计数培养基中的菌落数小于培养前的活菌数
D．经多次稀释和筛选，形成的一个菌落中所有细胞的遗传物质相同
解析：选C。土样不能灭菌，这样会杀死土样中的目的菌，A错误；平板划线法与稀释涂布平板法相比较，平板划线法操作简单，B错误；丙为分离选择高效降解X的菌株，不能降解X的菌株不能存活，因此丙培养后，计数培养基中的菌落数小于培养前的活菌数，C正确；菌落往往是由一个细菌繁殖而成的子细胞群体，经多次稀释和筛选，形成的单菌落中所有细胞的遗传物质不一定相同，原因是可能发生了变异，故细胞的遗传物质不一定相同，D错误。
11．(多选)为探究某物种的等位基因“CST1”与“cst1E81K”的功能，科研人员将表达CST1和cst1E81K的质粒分别导入到无法吸收葡萄糖的酵母菌(以麦芽糖为碳源)中，经处理后再将其接种在含不同碳源的培养基上，结果如图所示，下列说法正确的是(　　)
A．上述酵母菌在接种前的处理是对其进行等浓度梯度的稀释
B．在含葡萄糖类似物的培养基上，导入CST1的酵母菌存活率最高
C．据图推测，CST1的功能可能是转运葡萄糖进入细胞
D．导入cst1E81K的酵母菌葡萄糖吸收速率大于导入CST1的酵母菌
解析：选AC。从图中可以看出，后者稀释浓度是前者稀释浓度的5倍，所以是进行等浓度梯度的稀释，A正确；在含葡萄糖类似物的培养基上，导入CST1的酵母菌菌落颜色最浅，说明存活率最低，B错误；导入CST1的酵母菌在葡萄糖类似物的培养基上菌落数目降低，由于葡萄糖类似物被吸收后可以杀死酵母菌，因此可以推测CST1能转运葡萄糖类似物进入酵母菌，所以其功能可能是转运葡萄糖进入细胞，C正确；在麦芽糖＋葡萄糖类似物的培养基中，导入cst1E81K的酵母菌菌落数目多，说明其存活率更高，由于葡萄糖类似物被吸收后可以杀死酵母菌，因此可以推测导入cst1E81K的酵母菌葡萄糖吸收速率小于导入CST1的酵母菌，D错误。
12．(2022·北京顺义区二模)苯乳酸是植物乳杆菌的次生代谢产物，对致病菌有很强的抑制作用，在食品工业中有广阔的应用前景。为提高苯乳酸的产量，科研人员对其培养基进行优化。
图1
(1)称取不同剂量的葡萄糖、蛋白胨等成分，溶化分装，经__________后，制备成各种培养基备用。将植物乳杆菌接种在固体培养基上培养14 h，挑取__________，分别接种至A、B、C、D四种液体培养基中，每隔2 h取样一次，用______________________________法测定培养液中乳杆菌的数目，结果如图1。培养24 h后，测定苯乳酸含量，发现D组苯乳酸含量最高，从而初步确定优化培养基配方。
(2)有研究显示，酵母菌的代谢产物有利于苯乳酸的产生。用YPD培养基培养酵母菌，分别收集培养20 h和40 h的发酵液，离心过滤除菌，得到无酵母菌的上清液(CFS)。将植物乳杆菌接种至与D组成分相同的培养基中，再分别将CFS按照一定的比例添加到培养基中，24 h后测定苯乳酸含量，结果如图2。图2实验中对照组的处理是________________，综合上述研究分析有利于苯乳酸产生的最佳培养基配方是____________________________________。
图2
(3)研究表明CFS中不含苯乳酸，含有苯丙氨酸和α-酮戊二酸。在植物乳杆菌细胞内苯丙氨酸经转氨作用生成苯丙酮酸，脱下的氨基转移到受体α-酮戊二酸上，苯丙酮酸被乳酸脱氢酶还原为苯乳酸。进一步研究发现CFS中单独添加苯丙氨酸或α-酮戊二酸均可提高苯乳酸产量。依据研究结果，分析在培养基中只添加适量苯丙氨酸与同时添加适量苯丙氨酸和α-酮戊二酸相比苯乳酸产量提高的程度是否相同，并解释原因_______________________________________________。
解析：(1)微生物培养的关键是无菌操作，故制备培养基之前需要先灭菌；为保证纯培养，需要挑取单菌落分别接种至A、B、C、D四种液体培养基中；微生物计数的方法有显微镜直接计数法(活菌、死菌数目均被统计)或稀释涂布平板法(统计活菌数目)。(2)分析题意可知，本实验过程中将不同比例的CFS添加到YPD培养基培养酵母菌，实验设计应遵循对照原则与单一变量原则，故对照组的处理应是不含CFS相应比例的YPD培养基；综合比较图1、图2可知，在葡萄糖27.5 g/L、蛋白胨30 g/L(D组)、发酵40 h的CFS占比15%时乳杆菌数量和苯乳酸含量均最高，故该条件是有利于苯乳酸产生的最佳培养基配方。(3)由于苯丙氨酸是苯乳酸的原料，增加其含量可提高苯乳酸产量；而苯丙氨酸脱下的氨基可被α-酮戊二酸消耗，产生更多的苯丙酮酸和苯乳酸；只增加苯丙氨酸，会因为苯丙氨酸脱下的氨基没有更多的α-酮戊二酸接受而会使增加的苯丙氨酸向苯丙酮酸的转换效率降低，故添加α-酮戊二酸和苯丙氨酸时苯乳酸产量提高的程度更高。
答案：(1)灭菌　单菌落　显微镜直接计数法或稀释涂布平板　(2)不含CFS相应比例的YPD培养基　葡萄糖27.5 g/L、蛋白胨30 g/L、发酵40 h的CFS占比15%时　(3)添加α-酮戊二酸和苯丙氨酸时苯乳酸产量提高的程度更高；原因：苯丙氨酸是苯乳酸的原料，增加其含量可提高苯乳酸产量；而苯丙氨酸脱下的氨基可被α-酮戊二酸消耗，产生更多的苯丙酮酸和苯乳酸；只增加苯丙氨酸，会因为苯丙氨酸脱下氨基没有更多的α-酮戊二酸接受而会使增加的苯丙氨酸向苯丙酮酸的转换效率降低

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