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第10单元　生物技术与工程
第5课　基因工程
[复习目标]　1.基因结构决定其功能；掌握目的基因的筛选与获取方法；理解蛋白质工程的原理。(生命观念)　2.建立基因工程的操作流程模型，掌握目的基因的检测与鉴定方法。(科学思维)　3.基因工程和蛋白质工程在生产实践上的应用。(社会责任)　4.探究基因工程在生产上的应用和蛋白质工程的应用，掌握DNA片段的扩增及电泳鉴定的方法。(科学探究)
考点一　重组DNA技术的基本工具
1．基因工程的概念
2．基因工程的基本工具
[教材深挖]
(选择性必修3 P74拓展应用1)限制酶不切割细菌本身的DNA分子是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。
(2)DNA连接酶——“分子缝合针”
种类 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源 大肠杆菌 T4噬菌体
特点 只缝合黏性末端 缝合黏性末端和平末端
作用 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，并连接两个DNA片段
(3)基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
[教材深挖]
(选择性必修3 P72正文，拓展)天然质粒是否可以直接用作基因工程载体？为什么？
提示：不可以。具有能自我复制、有一个或多个限制酶切割位点、有标记基因及对受体细胞无害等特点的质粒才可以直接用作基因工程的载体。实际上天然质粒一般不完全具备上述条件，往往需要进行人工改造后才能用于基因工程操作。
[易错辨析]
1．重组DNA技术所需要的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体。(×)
2．切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。(×)
3．DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事。(×)
4．DNA连接酶可以连接目的基因与载体的氢键，形成重组DNA。(×)
5．载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选的标记基因。(×)
1．基因工程的理论基础
2．与DNA有关的几种酶的比较
命题点1　围绕基因工程所需工具酶考查科学思维
1．(2023·泰安模拟)限制酶的发现为DNA的切割和功能基因的获得创造了条件。限制酶Sau3A Ⅰ、EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ的识别序列及切割位点分别为。含某目的基因的DNA片段如图所示，若利用质粒A(含限制酶Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点各1个)构建基因表达载体，为克服目的基因和质粒A的自身环化以及目的基因与质粒的任意连接等，应该如何选择限制酶(　　)
A．用限制酶EcoRⅠ或BamHⅠ处理含某目的基因的DNA和质粒A
B．用限制酶Sau3AⅠ和BamHⅠ处理含某目的基因的DNA和质粒A
C．用限制酶Sau3AⅠ和EcoRⅠ处理含某目的基因的DNA和质粒A
D．用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ处理含某目的基因的DNA和质粒A
解析：选D。限制酶Sau3AⅠ切割目的基因会破坏目的基因，质粒含有限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，获取目的基因也可以用限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ进行切割，但为了防止目的基因或质粒自身环化，需要使用不同种限制酶进行切割，则可以使用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ去切割质粒，也可以用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ去切割目的基因，则获得的重组质粒会进行正常连接。
2．下列是基因工程的有关问题，请回答：
(1)限制性内切核酸酶可以识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并可以使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的______________(填化学键名称)断开，形成的末端总体可分为两种类型，分别是__________________。
(2)目的基因和载体重组时需要的工具酶是______________，和限制性内切核酸酶相比，它对所重组的DNA两端碱基序列________________(填“有”或“无”)专一性要求。
(3)如图表示构建表达载体时的某种质粒与目的基因。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切割位点是，限制酶Ⅱ的识别序列和切割位点是。分析可知，最好选择限制酶____________切割质粒，限制酶__________切割目的基因所在的DNA，这样做的好处分别是___________。
解析：(1)限制性内切核酸酶(限制酶)能够识别双链DNA分子中的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式，分别为黏性末端和平末端。(2)目的基因和载体重组时需要DNA连接酶恢复两个核苷酸之间的磷酸二酯键。多种限制酶切割，形成不同的切割位点，所用的DNA连接酶对所连接的DNA两端碱基序列无专一性要求。(3)由题干及图示可知，限制酶Ⅰ的识别序列和切割位点是，限制酶Ⅰ切割质粒不会把两个标记基因都破坏，最好选择限制酶Ⅰ切割质粒。限制酶Ⅱ的识别序列和切割位点是，目的基因两端均有限制酶Ⅱ的识别序列，因此用限制酶Ⅱ切割目的基因所在的DNA。
答案：(1)磷酸二酯键　黏性末端和平末端 (2)DNA连接酶　无　(3)Ⅰ　Ⅱ　限制酶Ⅰ切割质粒不会把两个标记基因都破坏　目的基因两端均有限制酶Ⅱ的识别序列
[技法提炼]　限制酶的选择技巧
甲　　　　　　　　乙
(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类
命题点2　围绕载体的作用及特点考查科学思维
3．(2022·章丘区模拟)如图为某种质粒的简图，小箭头所指分别为限制性内切核酸酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，P为转录的启动部位。已知目的基因的两端有EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，受体细胞为无任何抗药性的原核细胞。下列有关叙述正确的是(　　)
A．将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoRⅠ酶切，在DNA连接酶作用下，生成的由两个DNA片段连接形成的产物有两种
B．DNA连接酶的作用是将酶切后得到的黏性末端连接起来，形成一个重组质粒时形成两个磷酸二酯键
C．为了防止目的基因反向连接和质粒自身环化，酶切时可选用的酶是EcoRⅠ和BamHⅠ
D．能在含青霉素的培养基中生长的受体细胞中已成功导入该目的基因
解析：选C。根据题意可知，目的基因的两端有EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，将含有目的基因的DNA用EcoRⅠ酶切，会得到目的基因片段；根据质粒的简图可知，将质粒用EcoRⅠ酶切，会得到与质粒周长等长的链状DNA；因此将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoRⅠ酶切，在DNA连接酶作用下，可生成目的基因—目的基因片段、目的基因—质粒片段、质粒—质粒片段三种产物，A错误。DNA连接酶的作用是将酶切后得到的黏性末端连接起来形成一个重组质粒，该过程形成四个磷酸二酯键，B错误。EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列不同，获取目的基因和切割质粒时，同时选用EcoRⅠ和BamHⅠ切割，目的基因两端形成的末端不同，切割后的质粒两端形成的末端不同，再用DNA连接酶连接，可以防止目的基因反向连接和质粒自身环化，C正确；导入普通质粒的大肠杆菌和导入重组质粒的大肠杆菌都能在含青霉素的培养基中生长，因此能在含青霉素的培养基中生长的受体细胞不一定含有目的基因，D错误。
4.(经典高考题)某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有____________(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。
(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是___________；并且__________和__________的细胞也是不能区分的，其原因是____________。
在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有__________________的固体培养基。
(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自_________________________________________________。
解析：(1)质粒作为载体，应具备的基本条件有：有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段(基因)插入其中；在受体细胞中能自我复制，或能整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制；有特殊的标记基因，供重组DNA的鉴定和选择等。(2)在培养基中加入氨苄青霉素进行筛选，其中未被转化的大肠杆菌和仅含环状目的基因的大肠杆菌，因不含氨苄青霉素抗性基因而都不能在此培养基上存活，二者不能区分。含有质粒载体的大肠杆菌和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌中都含有氨苄青霉素抗性基因，都能在此培养基上存活，二者也不能区分。若要将含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌进一步筛选出来，还需要使用含有四环素的固体培养基。(3)某些噬菌体经改造后作为载体，导入受体细胞后，其DNA复制所需的原料来自受体细胞。
答案：(1)能自我复制、具有标记基因(答出两点即可)　(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长　含有质粒载体　含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒)　二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长　四环素　(3)受体细胞
考点二　基因工程的基本操作程序
1．目的基因的筛选与获取
(1)筛选合适的目的基因
①目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要是指编码蛋白质的基因。
②筛选目的基因的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
(2)利用PCR获取和扩增目的基因
①原理：DNA半保留复制。
②条件：DNA模板、2种引物、耐高温的DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸。
③扩增过程
(3)通过构建基因文库获取目的基因。
[教材深挖]
(选择性必修3 P77正文，拓展)利用PCR扩增目的基因时，为什么要用2种不同的引物？
提示：DNA是两条反向平行的双链结构，而复制时只能从固定的方向(模板链的3′端)开始，所以引物的碱基序列是不同的。
2．基因表达载体的构建
(1)构建基因表达载体的目的
①使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
②使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)基因表达载体的组成
(3)基因表达载体的构建过程
[教材深挖]
(选择性必修3 P80正文，拓展)为什么切割含有目的基因的DNA片段和载体要选用同一种限制酶？是否只能用同一种限制酶？
提示：选用同一种限制酶切割会产生相同的黏性末端，可以在DNA连接酶的作用下将切割的目的基因和载体连接起来。也可以使用能产生相同末端的限制酶切割。
3．将目的基因导入受体细胞
类型 方法 过程 优点
植物细胞 农杆菌转化法 将目的基因插入到农杆菌Ti质粒的T－DNA上→转入农杆菌→用农杆菌侵染植物细胞→将目的基因整合到植物细胞的染色体DNA上→目的基因表达 经济、有效，适用于双子叶植物和裸子植物，尤其适用于双子叶植物，但单子叶植物也获得了成功
花粉管通道法 用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊 简便、经济，我国科学家独创的一种方法
动物细胞 显微注射技术 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→注射了目的基因的受精卵，经胚胎早期培养后，移植到雌性动物的输卵管或子宫内→获得具有新性状的动物 将目的基因导入动物细胞最为有效的方法
微生物细胞 Ca2＋处理法 Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入 简便、经济、有效
[教材深挖]
(选择性必修3 P81资料卡)在用土壤农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，为什么一定要将目的基因插入到Ti质粒的T－DNA上？
提示：Ti质粒上的T－DNA也称为可转移的DNA，可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体DNA上。
4．目的基因的检测与鉴定
检测水平 检测目的 检测方法
分子水平 目的基因是否插入到转基因生物染色体DNA上 PCR
目的基因是否转录出了mRNA
目的基因是否翻译出蛋白质 抗原—抗体杂交
个体生物学水平 转基因生物是否表现出相应的特性 如抗虫、抗病的接种实验
[易错辨析]
1．目的基因就是指编码蛋白质的基因。(×)
2．用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。(√)
3．基因工程的核心步骤是目的基因的获取。(×)
4．基因表达载体中含有启动子和密码子。(×)
5．抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体DNA上也未必能正常表达。(√)
6．从大肠杆菌细胞中获得人胰岛素基因的mRNA，说明目的基因完成了表达。(×)
1．图解PCR的扩增过程
(1)在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。
(2)引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段。
(3)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。
(4)PCR的扩增结果：DNA分子以指数形式扩增(约为2n，其中n为扩增循环次数)。
提醒：(1)PCR中的复性不一定均为引物与DNA模板结合。复性时，引物与DNA模板的结合是随机的，也存在DNA解开的两条链的结合。
(2)PCR反应的结果不都是所需的DNA片段。因为第一次循环得到的DNA片段只有一种引物，比所需的DNA片段要长，从第三次循环才出现所需的DNA片段，这样的片段存在两种引物。
2．筛选出含有目的基因的受体细胞
(1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。
(2)被转化的细菌有三种：含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含质粒的细菌。
(3)筛选方法：将细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。
命题点1　围绕PCR技术考查生命观念及科学探究
1．(2022·绥中县模拟)农杆菌Ti质粒上的T－DNA可以转移并随机插入到被侵染植物的染色体DNA中。研究者将图中被侵染植物的DNA片段连接成环，并以此环为模板进行PCR，扩增出T－DNA插入位置两侧的未知序列，以此可确定T－DNA插入的具体位置。下列说法不正确的是(　　)
注：子链从引物的3′端开始延伸。
A．PCR扩增依据的是DNA分子双链复制的原理
B．进行PCR扩增需要耐高温的DNA聚合酶
C．利用图中的引物②、③组合可扩增出两侧的未知序列
D．通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定T－DNA的插入位置
解析：选C。PCR扩增依据的是DNA分子双链复制的原理，是体外扩增DNA的一种方式，A正确；PCR技术需要在高温条件下进行变性，故进行PCR扩增需要耐高温的DNA聚合酶，B正确；由于DNA的两条链反向平行，且子链从引物的3′端开始延伸，故利用图中的引物①、④组合可扩增出两侧的未知序列，C错误；通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定T－DNA的插入位置，D正确。
2．(2022·石家庄模拟)锦鲤疱疹病毒是一种双链DNA病毒。如图为TaqMan荧光探针技术的原理示意图，探针完整时，报告荧光基团发射的荧光信号被淬灭荧光基团吸收；PCR扩增时该探针被Taq酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增1个DNA分子，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。下列有关叙述不正确的是(　　)
A．在基因工程中，目前获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取、PCR技术扩增等
B．引物的化学本质是DNA单链
C．引物中的GC含量比探针中的略高，这有利于保证复性时引物先与模板DNA结合
D．若最初该反应体系中只有一个病毒DNA分子，经n次循环后，需要消耗TaqMan荧光探针2n－1个
解析：选C。在基因工程中，目前获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取、PCR技术扩增、利用化学方法人工合成等，A正确；引物是根据目的基因合成的，一般是一段短的DNA单链，B正确；GC之间形成3个氢键，GC含量高的DNA更稳定，更难变性，但是对复性过程影响不大，C错误；由于每扩增1个DNA分子，就有一个荧光分子形成，经n次循环后共有2n个DNA，跟初始相比，新增2n－1个DNA，所以需要TaqMan荧光探针2n－1个，D正确。
命题点2　围绕基因工程的基本操作程序考查科学思维及社会责任
3．下列关于目的基因导入受体细胞的叙述，不正确的是(　　)
A．花粉管通道法的操作之一是用微量注射器将含有目的基因的溶液直接注入子房中
B．显微注射是转基因动物中采用最多的方法
C．大肠杆菌最常用的转化方法是：用钙离子处理细胞，使细胞的生理状态发生改变
D．农杆菌转化法是我国科学家独创的一种方法
解析：选D。花粉管通道法的操作之一是用微量注射器将含有目的基因的溶液直接注入子房中，A正确；目的基因导入动物细胞常用的方法是显微注射，B正确；大肠杆菌细胞最常用的转化方法是用钙离子处理细胞，使细胞的生理状态发生改变，从而完成转化过程，C正确；我国科学家独创的方法是花粉管通道法，D错误。
4．(2022·全国乙卷)新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题：
(1)新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA(核酸检测)可以采用RT-PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是________，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。
(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的________________来进行。PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是_____________________________。
(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测(检测体内是否有新冠病毒抗体)，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明__________(答出1种情况即可)；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明___________________。
(4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S(具有抗原性)的编码序列(目的基因)。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是________________。
解析：(1)以RNA为模板合成cDNA的过程需要逆转录酶起催化作用。(2)在设计PCR引物时，为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，应依据新冠病毒RNA中一段特有的核苷酸序列来进行。PCR过程每次循环分为3步，变性(温度为90 ℃以上)、复性(温度为50 ℃左右)、延伸(温度为72 ℃左右)，故其中温度最低的一步是复性。(3)在对某人同时进行核酸检测和抗体检测时，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明该人近期可能感染过新冠病毒，经自身免疫系统的作用，体内病毒被消灭，但体内产生的抗体尚未消失。若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明该人感染了新冠病毒，且机体免疫系统产生了相应抗体，但还未将病毒完全消灭。(4)基因工程的基本流程是：目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定。
答案：(1)逆转录酶　(2)一段特有的核苷酸序列　复性　(3)该人近期可能感染过新冠病毒，经自身免疫系统的作用，体内病毒被消灭，但体内产生的抗体尚未消失　该人感染了新冠病毒，且机体免疫系统产生了相应抗体，但还未将病毒完全消灭　(4)目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
考点三　基因工程的应用和蛋白质工程
1．基因工程的应用
[教材深挖]
(选择性必修3 P91正文)利用基因工程技术对猪的器官进行改造，采用的方法是在器官供体的基因组中导入某种调节因子，以抑制抗原决定基因的表达，或设法除去抗原决定基因，然后再结合克隆技术，培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。
2．蛋白质工程的原理和应用
(1)蛋白质工程的概念
(2)蛋白质工程的基本原理
(3)蛋白质工程的应用
①医药工业方面：研发药物，如延长干扰素的保存时间；降低小鼠单克隆抗体诱发免疫反应的强度。
②其他工业方面：改进酶的性能或开发新的工业用酶。
③农业方面：通过改造某些参与调控光合作用的酶，增加粮食产量；改造微生物蛋白质的结构，设计优良微生物农药，防治病虫害。
[教材深挖]
(选择性必修3 P94思考·讨论，节选)确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因？
提示：确定目的基因的碱基序列后，可以人工合成目的基因或从基因文库中获取目的基因。对基因的改造经常会用到基因定点突变技术来进行碱基的替换、增添等。
[易错辨析]
1．来自苏云金杆菌的Bt抗虫蛋白基因只能应用于棉花。(×)
2．“转基因抗虫植物”也可以用于抵抗各种植物疾病。(×)
3．干扰素是我国批准生产的第一个基因工程药物。(√)
4．用基因工程的方法，使得外源基因得到高效表达的菌类一般称为基因工程菌。(√)
5．对蛋白质的改造是通过直接改造相应的mRNA来实现的。(×)
1．乳腺生物反应器与工程菌生产药物的区别
比较内容 乳腺生物反应器 工程菌
含义 指让外源基因在哺乳动物的乳腺中特异表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白 指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类
基因表达 合成的药物蛋白与天然蛋白质相同 细菌合成的药物蛋白可能没有活性
受体细胞 动物受精卵 微生物细胞
目的基因导入方式 显微注射法 Ca2＋处理法
生产条件 不需严格灭菌；温度等外界条件对其影响不大 需严格灭菌，严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件
药物提取 从动物乳汁中提取 从微生物细胞或其培养液中提取
2．蛋白质工程与基因工程的区别和联系
命题点1　围绕基因工程的应用考查科学思维及社会责任
1．(2022·山东卷)某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。
(1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是________________________，为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的__________(填“3′端”或“5′端”)。
(2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是___________________________________________。
修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是_________________________________________________。
图甲
(3)融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是____________；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是______________________________。
图乙
图丙
(4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是____________。
解析：(1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核苷酸，因此设计扩增P基因的引物，需要两种引物分别与两条模板链3′端的碱基序列互补。耐高温的DNA聚合酶延伸时，是将脱氧核苷酸加到引物的3′端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5′端。(2)融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同，说明P基因翻译时出错。由图可看出，在转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变，可通过在EcoRⅠ识别序列3′端添加1个碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数，这样能保证P基因转录出的mRNA上的读码框不改变，能够正常翻译。(3)①组仅添加UBC，处理后，用UBC抗体检测，不出现杂交带；②组添加UBC和FLAG-P，出现杂交带；③组添加UBC、药物A和FLAG-P，杂交带更加明显，说明药物A的作用是促进UBC与FLAG-P的结合。②④组或③⑤组的差异在于②③组使用FLAG-P，出现杂交带；④⑤组使用FLAG-P△，不出现杂交带，据此推测P△中缺失的特定序列是与UBC结合的关键序列。(4)根据(3)的分析推测，药物A促进UBC与FLAG-P的结合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到治疗的目的。
答案：(1)能与P基因母链的一段碱基序列互补配对、短单链核酸　5′端　(2)P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取　在引物中的EcoRⅠ识别序列3′端添加1个碱基　(3)增强FLAG-P与UBC的结合　参与P与UBC的结合　(4)药物A通过增强P与UBC结合促进P降解
命题点2　围绕蛋白质工程考查生命观念、社会责任及科学探究
2．(2022·湖南卷)水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题：
(1)蛋白质工程流程如图所示，物质a是______________________，物质b是____________。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是_____________________________。
(2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有______________________________、________________________和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是___________________________。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的______________(填“种类”或“含量”)有关，导致其活性不同的原因是____________________________________________。
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路_________________________。
解析：(1)据分析可知，物质a是具有特定氨基酸序列的多肽链，物质b是mRNA。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是密码子的简并性，即一种氨基酸可能有几个密码子。(2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取目的基因、通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是DNA半保留复制。(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，据图可知，水解产物中的肽含量随着酶解时间的延长均上升，且差别不大；而水解产物中抗凝血活性有差异，经酶甲处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后相对稳定，经酶乙处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后下降，且酶甲处理后的酶解产物的抗凝血活性最终高于经酶乙处理后的酶解产物的抗凝血活性，差异明显，据此推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关，导致其活性不同的原因是提取的水蛭蛋白的酶解时间和酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏。(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，实验设计思路为：取3支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一种动物(如家兔)血液，立即将等量的血液加入1、2、3号三支试管中，静置相同时间，统计三支试管中血液凝固时间。
答案：(1)具有特定氨基酸序列的多肽链　mRNA　密码子的简并性　(2)从基因文库中获取　通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成　DNA半保留复制　(3)种类　提取的水蛭蛋白的酶解时间和酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏　(4)取3支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一种动物(如家兔)血液，立即将等量的血液加入1、2、3号三支试管中，静置相同时间，统计三支试管中血液凝固时间
考点四　(实验)DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定
1．DNA的粗提取与鉴定
(1)实验原理
(2)实验步骤
2．DNA片段的扩增及电泳鉴定
(1)实验原理
①PCR原理：利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
②电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
③PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
(2)PCR实验操作步骤
(3)DNA的测定：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300_nm的紫外灯下被检测出来。
(4)结果分析与评价
①成功扩增出DNA片段的判断依据是可以在紫外灯下直接观察到DNA条带。
②进行电泳鉴定的结果应该是一条条带。如图所示，该片段大小约为750 bp。
1．DNA的粗提取与鉴定的注意事项
(1)加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
(2)本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作为材料。
(3)鉴定DNA时，一支试管为对照组，另一支试管为实验组。两支试管中都先加物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液；在实验组试管中加DNA丝状物，对照组不加；加入二苯胺试剂后沸水浴加热。结果可以看到加DNA丝状物的试管呈现蓝色，对照组无色。如果实验组蓝色较浅，说明提取出的DNA量太少。
2．DNA片段的扩增及电泳鉴定
(1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
(2)该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
(3)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，避免试剂的污染。
(4)在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
(5)观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。
命题点1　围绕DNA的粗提取与鉴定考查科学探究
1．(2022·山东卷)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是(　　)
A．过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质
解析：选B。低温时DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确；离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确；细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，可能有蛋白质不溶于酒精，在95%的冷酒精中与DNA一块儿析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白质，D正确。
命题点2　围绕DNA片段的扩增及电泳鉴定考查科学探究
2．人体内一些正常或异常细胞脱落破碎后，其DNA会以游离的形式存在于血液中，称为cfDNA。近几年，结合PCR及电泳鉴定、DNA测序等技术，cfDNA在临床上得到了广泛应用。下列相关说法不正确的是(　　)
A．PCR反应中设置不同的温度是为了使DNA聚合酶催化不同的反应
B．在琼脂糖凝胶中，cfDNA的迁移速率与cfDNA分子的大小、构象等有关
C．在进行电泳时，要预留一个加样孔，加入指示分子大小的标准参照物
D．对cfDNA进行检测，可以用于肿瘤的早期筛查
解析：选A。PCR反应中温度的周期性改变是为了解旋变性、复性、延伸，A错误；分子的大小、构象、凝胶的种类、浓度、电泳的电压大小等都会影响分子迁移速率，B正确；在进行电泳时，要预留一个加样孔，加入指示分子大小的标准参照物，C正确；cfDNA是人体内一些正常或异常细胞脱落破碎后形成的游离DNA，所以可通过检测cfDNA中的相关基因，判断其来自正常或异常细胞，并进行癌症的筛查，D正确。
[真题演练]
1．(2021·湖北卷)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中有效的是(　　)
A．增加模板DNA的量 B．延长热变性的时间
C．延长延伸的时间 D．提高复性的温度
解析：选D。增加模板DNA的量可以提高反应速度，但不能有效减少非特异性条带，A不符合题意；延长热变性的时间和延长延伸的时间会影响变性和延伸过程，但对于延伸中的配对影响不大，故不能有效减少反应非特异性条带，B、C不符合题意；非特异性产物增加的原因可能是复性温度过低造成引物与模板的结合位点增加，故可通过提高复性的温度来减少反应非特异性条带的产生，D符合题意。
2．(2021·江苏卷)如图是剔除转基因植物中标记基因的一种策略，下列相关叙述错误的是(　　)
A．分别带有目的基因和标记基因的两个质粒，都带有T－DNA序列
B．该方法建立在高转化频率基础上，标记基因和目的基因须转到不同染色体上
C．若要获得剔除标记基因的植株，转化植株必须经过有性繁殖阶段遗传重组
D．获得的无筛选标记转基因植株发生了染色体结构变异
解析：选D。农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，故分别带有目的基因和标记基因的两个质粒，都带有T－DNA序列，进而成功整合到受体细胞染色体上，A正确；该方法需要利用农杆菌转化法，在高转化频率的基础上，将目的基因和标记基因整合到染色体上，由图可知，标记基因和目的基因位于细胞中不同的染色体上，B正确；由图可知，若要获得剔除标记基因的植株，转化植株必须经过有性繁殖阶段遗传重组，C正确；获得的无筛选标记转基因植株发生了基因重组，D错误。
3．(2021·辽宁卷)腈水合酶(N0)广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域，但不耐高温。利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)。下列有关叙述错误的是(　　)
A．N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一
B．加入连接肽需要通过改造基因实现
C．获得N1的过程需要进行转录和翻译
D．检测N1的活性时先将N1与底物充分混合，再置于高温环境
解析：选D。在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)，则N1与N0氨基酸序列有所不同，这可能是影响其热稳定性的原因之一，A正确；蛋白质工程的作用对象是基因，即加入连接肽需要通过改造基因实现，B正确；N1为蛋白质，蛋白质的合成需要经过转录和翻译两个过程，C正确；酶具有高效性，检测N1的活性需先将其置于高温环境，再与底物充分混合，D错误。
4．(2021·福建卷)微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将枣树的MT基因导入大肠杆菌构建工程菌。回答下列问题：
(1)根据枣树的MTcDNA的核苷酸序列设计了相应的引物(图1甲)，通过PCR扩增MT基因。已知A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。选用的引物组合应为____________。
图1
(2)本实验中，PCR所用的DNA聚合酶扩增出的MT基因的末端为平末端。由于载体E只有能产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将MT基因接入载体E。载体P和载体E的酶切位点及相应的酶切序列如图1乙所示。
①选用____________________酶将载体P切开，再用________________(填“T4 DNA”或“E.coli DNA”)连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。
②载体P′不具有表达MT基因的____________和______________。选用________________酶组合对载体P′和载体E进行酶切，将切下的MT基因和载体E用DNA连接酶进行连接，将得到的混合物导入到用________离子处理的大肠杆菌，筛出MT工程菌。
(3)MT基因在工程菌的表达量如图2所示。结果仍无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌，理由是_____________________。
图2
解析：(1)密码子位于mRNA上，是决定氨基酸的三个相邻碱基，起始密码子和终止密码子分别控制翻译的开始和结束，故为保证基因的正常表达，一对引物应分别位于位点A和位点B的两侧，故选择引物1和引物4。(2)①为得到平末端，可用EcoRⅤ酶将载体P切开；由于E.coli DNA连接酶只能连接黏性末端，而T4 DNA连接酶可以连接平末端和黏性末端，结合题意可知，MT基因的末端为平末端，故需要用T4 DNA连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。②载体P′是重组质粒，故不含有表达MT基因的启动子和终止子；为避免自身环化和反向连接，可选用两种酶切割两种载体，据图可知，载体P′和载体E均含有XhoⅠ和PstⅠ酶，故可选用XhoⅠ和PstⅠ酶进行酶切；将目的基因导入大肠杆菌的方法是钙离子处理法。(3)由于尚未在个体生物学水平上对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定，故即使MT工程菌的MT蛋白相对含量较高，也无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌。
答案：(1)引物1和引物4　(2)①EcoRⅤ　T4DNA　②启动子　终止子　XhoⅠ和PstⅠ　钙　(3)尚未在个体生物学水平上对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定
[长句特训]
新冠病毒是一种单链RNA病毒，常用“荧光RT—PCR技术”进行检测，方法是取检测者的mRNA逆转录出cDNA，并大量扩增时，用荧光标记的新冠病毒核酸探针来检测PCR产物中是否含有新冠病毒的cDNA，请回答下列问题：
设问形式1　必备知识及其应用类命题
(1)“荧光RT—PCR技术”所用的试剂盒中通常都应该含有：___________、______________、荧光标记的核酸探针、引物、dNTP、缓冲体系。
设问形式2　信息推断类命题
(2)如果要同时扩增两种基因，则试剂盒中的引物应该有____________种。如图为新冠病毒的“ORFlab基因”对应的cDNA片段结构示意图，则与之对应的引物结合的部位应该是图中的____________(子链延伸方向为其自身的5′→3′，用图中数字作答)。若已知该基因的引物Ⅰ，能否依据其碱基序列设计出另一种引物Ⅱ？
____________，理由是_______________________。
设问形式3　实验结果分析类命题
(3)在检测过程中，随着PCR的进行，反应产物不断累积，“杂交双链”荧光信号的强度也等比例增加。可通过荧光强度的变化监测产物量的变化从而得到一条荧光扩增曲线图(如图)。
①“平台期”出现的最可能的原因是_________________________。
②理论上，在检测过程中，有荧光标记的“杂交双链”出现，则说明检测结果呈__________(填“阴”或“阳”)性，但为了保证检测结果的准确性，一般要达到或超过阈值时才确诊。现有两个待检样本，检测时都出现了上述形态的曲线，但甲的a点比乙的a点明显左移。请给这种结果作出科学合理的解释(试剂盒合格且正常，操作过程规范且准确)：___________________________________。
解析：(1)根据题目信息可知，荧光PCR法基本原理是：将新冠病毒RNA逆转录为cDNA，通过采用荧光RT—PCR技术，因此荧光PCR法所用的试剂盒中通常都应该含有：逆转录酶、耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)、荧光标记的核酸探针、引物、dNTP、缓冲体系。(2)根据PCR技术的原理，在扩增DNA分子时每一条链均需与相应的引物结合才能进行扩增，因此如果要成功将上述两个独立基因分别扩增出来，则在试剂盒中的引物应该有4种；在利用PCR技术扩增DNA分子过程中，耐高温的DNA聚合酶只能从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，又由于DNA的两条链是反向平行的，所以引物与DNA分子单链的3′端(—OH)相结合即图示中的1和4所示部位。由于两段引物的碱基序列没有相关性，既不相同，也不互补，因此不能根据该基因的引物Ⅰ的碱基序列设计出另一种引物Ⅱ。(3)①分析荧光扩增曲线图，图中曲线通过荧光强度变化反映产物量的变化，因此曲线中“平台期”出现的最可能原因是试剂盒中的原料和探针数量一定，超出一定的循环数后，荧光标记的杂交双链不再增加。②理论上，在检测过程中，有荧光标记的“杂交双链”出现，则说明检测结果呈阳性，为了保证检测结果的准确性，一般要达到或超过阈值时才确诊。现检测结果甲的a点比乙的a点明显左移，说明甲样本中的新冠病毒含量更高，达到阈值所需的循环数更少。
答案：(1)逆转录酶　耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)　(2)4　4、1　不能　两段引物的碱基序列没有相关性(既不相同，也不互补)　(3)①试剂盒中的原料、引物和探针数量一定，超出一定的循环数后，荧光标记的“杂交双链”不再增加　②阳　甲样本中的新冠病毒含量更高，达到阈值所需的循环数更少
第5课　基因工程
[基础练透]
1．如图是3种限制性内切核酸酶对DNA分子的识别序列和剪切位点图(箭头表示切点，切出的断面为黏性末端)。下列叙述错误的是(　　)
A．不同的限制酶有不同的识别序列和切割位点，体现了酶的专一性
B．限制酶2和3识别的序列都包含6个核苷酸
C．限制酶1和3剪出的黏性末端相同
D．能够识别和切割RNA分子内一小段核苷酸序列的酶只有限制酶2
解析：选D。不同的限制酶有不同的识别序列和切割位点，体现了酶具有专一性，A正确；据图可知，限制酶2和3识别的序列分别是CCGCGG和GGATCC，均为6个核苷酸，B正确；限制酶1和3剪出的黏性末端相同，均为GATC，C正确；限制酶只能识别特定的DNA序列，因此三种限制酶均不能识别和切割RNA中核糖核苷酸序列，D错误。
2．(2022·北京房山区二模)大肠杆菌的质粒——环状DNA是基因工程的常用载体，结构如图。下列叙述正确的是(　　)
A．①②③共同组成核糖核苷酸
B．质粒中的碱基遵循碱基互补配对原则
C．DNA连接酶会使化学键④重新连接
D．若某种限制酶在质粒上只有一个酶切位点，则质粒被切为两个片段
解析：选B。①②③共同组成DNA的基本单位——脱氧核苷酸，A错误；质粒中的碱基遵循碱基互补配对原则，A与T配对，G与C配对，B正确；DNA连接酶使DNA片段重新连接，该过程形成磷酸二酯键，磷酸二酯键是由磷酸基团与3号碳原子相连，图中的④不属于磷酸二酯键，C错误；限制酶识别特定序列并在特定位点切割，环状质粒上若只有一个限制酶切位点，则质粒被切割为1个完整的DNA链状片段，D错误。
3．某研究所的研究人员拟将生长激素基因通过质粒介导进入大肠杆菌细胞内，已知质粒中存在两个抗性基因：A是抗链霉素基因，B是抗氨苄青霉素基因，目的基因要插入到基因B中，且大肠杆菌本身不带有任何抗性基因。下列叙述正确的是(　　)
A．导入大肠杆菌的质粒一定为重组质粒
B．抗生素抗性基因是目的基因表达的必要条件
C．成功导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基上生长
D．能在含链霉素的培养基中生长的大肠杆菌不一定符合生产要求
解析：选D。导入大肠杆菌的质粒可能为重组质粒，也可能为普通质粒，A错误；抗生素抗性基因是标记基因，是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，与目的基因表达无关，B错误；由于目的基因要插入到基因B中，即抗氨苄青霉素基因被破坏，即工程菌不能抗氨苄青霉素，因此成功导入重组质粒的大肠杆菌不能在含氨苄青霉素的培养基上生长，C错误；能在含链霉素的培养基中生长的大肠杆菌可能含有重组质粒或普通质粒，因此不一定符合生产要求，D正确。
4．菊花是一种双子叶植物，易感桃蚜。桃蚜不但直接影响植物生长，还是多种植物病毒的传播媒介。雪花莲凝集素基因GNA的表达产物能有效抑制桃蚜生长，某科研团队运用农杆菌转化法获得了转GNA基因菊花。下列有关叙述不正确的是(　　)
A．受体细胞可以选择菊花叶片细胞或桃蚜细胞
B．将目的基因GNA插入到Ti质粒的T－DNA上构建表达载体
C．可以将菊花叶片取下与农杆菌共同培养，然后筛选转化细胞
D．应用抗虫接种实验，检测转基因菊花对桃蚜的抗性及抗性的程度
解析：选A。要获得转基因菊花，可以选择菊花叶片细胞作为受体细胞，但不能选择桃蚜细胞作为受体细胞，A错误；Ti质粒的T－DNA可以转移到受体细胞中，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，根据这一特点，构建表达载体时，应将目的基因GNA插入到Ti质粒的T－DNA上，B正确；可以将菊花叶片取下与农杆菌共同培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株，C正确；已知雪花莲凝集素基因GNA的表达产物能有效抑制桃蚜生长，故应用抗虫接种实验，检测转基因菊花对桃蚜的抗性及抗性的程度，D正确。
5．科学家培养的转基因奶牛的乳腺细胞能够合成并分泌人凝血因子，这是动物乳腺生物反应器研究的重大进展。下列叙述正确的是(　　)
A．在该转基因牛中，人凝血因子基因只存在于乳腺细胞，而不存在于其他体细胞中
B．“提高基因表达水平”是指设法使牛的乳腺细胞中含有更多的人凝血因子基因
C．人凝血因子基因开始转录后，DNA聚合酶以DNA分子的一条链为模板合成mRNA
D．转基因奶牛需要进入泌乳期才能批量生产人凝血因子
解析：选D。根据题意，在该转基因工程中，人凝血因子基因导入的受体细胞是牛的受精卵，由该受精卵发育形成的个体的各种体细胞中都存在人凝血因子基因，A错误；“提高基因表达水平”是指设法使牛的乳腺细胞合成更多的人凝血因子，B错误；人凝血因子基因开始转录后，RNA聚合酶以DNA分子的一条链为模板合成mRNA，C错误；转基因奶牛需要进入泌乳期才能批量生产人凝血因子，D正确。
6．(2022·青岛市一模)亚洲棉的突变型光籽和野生型毛籽是一对相对性状，研究发现，亚洲棉某突变体的光籽表型与8号染色体的～880 kb至～903 kb区间相关，研究人员根据野生型毛籽棉的该区间设计连续的重叠引物进行PCR，产物扩增结果如图所示，下列说法错误的是(　　)
A．应提取该突变体和野生型亚洲棉的全部染色体DNA进行PCR
B．题图中PCR产物的鉴定是通过琼脂糖凝胶电泳来进行的
C．据图分析可知，分子量较大的扩增产物与点样处的距离较小
D．该突变体出现的根本原因是第6对引物对应区间发生了基因突变
解析：选A。由于8号染色体的～880 kb至～903 kb区间与突变体的光籽表型相关，故应该提取突变体和野生型的8号染色体上的DNA进行扩增，A错误；题图中PCR产物的鉴定是通过琼脂糖凝胶电泳来进行的，主要依据分子量不同，采用外加电场使其分开，B正确；由图可知，分子量较大的扩增产物迁移速率慢，与点样处的距离较小，C正确；根据野生型和突变体经引物6扩增的产物不同可知，8号染色体上的第6对引物对应的区间基因突变是光籽性状出现的根本原因，D正确。
7．(多选)科研人员通过PCR技术获得白蛋白启动子，将该启动子与Cre重组酶基因结合构建基因表达载体，培育出在肝细胞中特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠。下列相关叙述正确的是(　　)
A．将基因表达载体导入肝细胞经培育获得转基因小鼠
B．利用PCR技术获得白蛋白启动子需要两种引物
C．通过抗原—抗体杂交技术可检测Cre基因是否完成表达
D．将发育到原肠胚时期的重构胚向受体进行移植
解析：选BC。将该基因表达载体导入受精卵以获得转基因小鼠，A错误；DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端(子链的5′端)开始延伸DNA，因此PCR过程中需要添加引物才能完成复制过程，要合成两条子链，需要两种引物，B正确；Cre基因完成表达的产物是蛋白质，故可用抗原—抗体杂交技术进行检测，C正确；胚胎移植需要胚胎发育至桑葚胚或囊胚阶段，D错误。
8．(2022·山东模考)大刍草具有较强的耐盐碱能力，该性状与基因D有关。研究人员从大刍草细胞中获得D后导入小麦中培育出转基因小麦，该育种过程的操作流程如图，图中AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，TetR表示四环素抗性基因，BclⅠ、Hind Ⅲ和BamHⅠ为限制酶。回答下列问题：
(1)将目的基因D和Ti质粒连接构建重组质粒时，为保证目的基因正确连接，切割Ti质粒选用的限制酶是______________，原因是___________________。
(2)在对导入重组质粒的农杆菌进行筛选时，首先将处理的农杆菌接种到含________________的培养基上进行筛选，但得到的农杆菌不完全含有重组质粒，原因是________________________________；再用另一种培养基进一步筛选，在此培养基上含重组质粒的农杆菌______________(填“能”或“不能”)存活。
(3)增强子是可增强基因转录的一小段特殊DNA序列，将其插入目的基因D的启动子中可提高基因D的表达量。但有人认为这样会引起基因突变，导致基因D表达的蛋白质氨基酸序列改变，你是否认同这种观点，理由是_____________。
解析：(1)为了保证目的基因能够插入到T－DNA上，所以不选BclⅠ，由于双酶切可产生不同的黏性末端，能防止自身环化和连接，并保证目的基因准确插入到T－DNA内部，故选择限制酶为HindⅢ和BamHⅠ。(2)将处理的农杆菌接种到含氨苄青霉素的培养基上培养，以达到筛选的目的；但得到的农杆菌不完全含有重组质粒，原因是含有Ti质粒的农杆菌也存在AmpR，也能正常存活。再用含四环素的培养基培养，含重组质粒的农杆菌不能存活，因为重组质粒的四环素抗性基因酶切时被破坏。(3)不认同，插入位点在启动子，而翻译是从起始密码子开始的，启动子属于非编码区，不编码氨基酸，未能打乱起始密码子后的碱基序列，从而不会造成氨基酸序列改变。
答案：(1)Hind Ⅲ和BamHⅠ　双酶切产生不同的黏性末端，防止自身环化和连接，保证了目的基因准确插入到T－DNA内部　(2)氨苄青霉素　含有Ti质粒的农杆菌也存在AmpR，能正常存活　不能　(3)不认同，启动子属于非编码区，不编码氨基酸，不影响蛋白质的氨基酸序列
[能力提升]
9．(2022·辽宁一轮联考)TALEN是一种靶向基因操作技术，该技术利用了TAL靶向识别单元对靶向基因的识别作用和FokⅠ蛋白对靶向基因的切割作用，实现了对特定靶向基因的敲除。TAL靶向识别单元为间隔32个氨基酸的双连氨基酸(即两个相连的氨基酸)序列。不同的双连氨基酸分别与靶向基因中的A、T、C、G有恒定的对应关系，根据靶向基因的碱基序列可以设计出双连氨基酸序列。下列说法错误的是(　　)
A．该技术应该先推测出信使RNA序列，再推测出目的基因的核苷酸序列
B．在构建的基因表达载体中，启动子应位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位
C．TALEN是一种靶向基因操作技术，其中FokⅠ蛋白实质上是一种限制酶
D．双连氨基酸能够与含氮碱基A、T、C、G之间发生碱基互补配对
解析：选D。已知TAL靶向识别单元中双连氨基酸序列和FokⅠ蛋白的氨基酸序列，可先推测出信使RNA序列，再推测出目的基因的核苷酸序列，利用化学法以单个核苷酸为原料的步骤最终合成目的基因，再通过PCR技术进行扩增，A正确；在构建的基因表达载体中，有启动子、终止子、目的基因、标记基因等，其中启动子位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，B正确；TALEN是一种靶向基因操作技术，该技术利用了TAL靶向识别单元对靶向基因的识别作用和FokⅠ蛋白对靶向基因的切割作用，实现了对特定靶向基因的敲除，可见FokⅠ蛋白实质上是一种限制酶，C正确；只有含氮碱基之间能发生碱基互补配对，而双连氨基酸不含有含氮碱基，D错误。
10．(2022·滨州一模)构建基因表达载体时，可利用碱性磷酸单酯酶催化载体的5′－P变成5′－OH，如图所示。将经过该酶处理的载体与外源DNA连接时，由于5′－OH与3′－OH不能连接而形成切口(nick)。下列说法错误的是(　　)
A．经碱性磷酸单酯酶处理的载体不会发生自身环化
B．外源DNA也必需用碱性磷酸单酯酶处理
C．T4 DNA连接酶可连接黏性末端和平末端
D．重组DNA经过2次复制可得到不含nick的子代DNA
解析：选B。将经过该酶处理的载体与外源DNA连接时，由于5′－OH与 3′－OH不能连接而形成切口(nick)，因此经碱性磷酸单酯酶处理的载体不会发生自身环化，A正确；外源DNA不能用碱性磷酸单酯酶处理，如用碱性磷酸单酯酶处理，载体与外源DNA将不能连接形成重组DNA，B错误；T4 DNA连接酶可连接黏性末端和平末端，C正确；DNA是半保留复制，重组DNA经过2次复制，可得到2个不含nick的子代DNA，D正确。
11．(多选)小鼠肿瘤转移抑制基因(kissl基因)仅在特定组织中表达。在雌激素诱导下，细胞内信号转导系统可以与kissl基因启动子的特定区域结合，激活kissl基因的转录。研究者扩增了kissl基因启动子不同长度的片段P1、P2、P3和P4，分别构建这些片段与绿色荧光蛋白基因(G)融合的载体，转入体外培养的特定细胞中，在培养液中添加雌激素，以确定不同片段的转录活性。下列叙述正确的是(　　)
A．PCR获取不同长度片段时每组所用的引物有一个是统一的
B．应选择有kissl基因且能表达的小鼠细胞作为转化的受体细胞
C．在细胞中表达出绿色荧光强度弱的片段具有较高的转录活性
D．该启动子能响应外源激素信号可在基因工程中发挥重要作用
解析：选ABD。结合图示可知，不同长度的片段P1、P2、P3和P4，分别构建这些片段与绿色荧光蛋白基因(G)融合的载体，因此与G融合的那段是一样的，即下游引物是一样的，A正确；实验探究不同片段的转录活性，应选择有kissl基因且能表达的小鼠细胞作为转化的受体细胞，B正确；若某片段被转录，则荧光基因也被表达，在细胞中表达出绿色荧光强度强的片段具有较高的转录活性，C错误；在雌激素诱导下，细胞内信号转导系统可以与kissl基因启动子的特定区域结合，该启动子能响应外源激素信号可在基因工程中发挥重要作用，D正确。
12．(2022·济南一模)研究发现，酵母细胞基因转录需要转录因子，转录因子是组件式蛋白质，包括DNA结合功能域(DNA-BD)和转录激活结构域(DNA-AD)，两结合域分开时具有功能，但不能激活转录，如果将待测蛋白质X与DNA-BD融合，蛋白质Y与DNA-AD融合，蛋白质X和Y有相互作用时，两结构域能重新呈现完整转录因子活性，并可激活报告基因启动子，过程如图1所示。科研人员为了验证蛋白质X和Y是否具有相互作用及作用位置是位于蛋白质的氨基端还是羧基端，分别PCR扩增蛋白质X和Y的全长基因序列、编码氨基端603个氨基酸片段的基因序列、编码羧基端539个氨基酸片段的基因序列，分别构建不同的酵母表达载体(如图2和图3所示)，其中AmpR为氨苄青霉素抗性基因，HIS3和TRPI分别为控制组氨酸和色氨酸合成的基因。空白载体或单独一种载体均不能激活报告基因，载体对酵母菌无毒害作用。回答下列问题：
(1)为了将pLexA-JL和pB42AD载体分别与蛋白质X和Y的三种基因序列连接，需要先进行PCR扩增蛋白质X基因和蛋白质Y基因的6种序列，共需要设计___________种引物；扩增后再用限制酶__________和_________分别切割蛋白质X基因的3种序列和Y基因的3种序列。构建好pLexA-JL和pB42AD基因表达载体后，为确定是否成功，需要酶切两种载体后，根据__________结果观察是否出现预期大小的目标条带。
(2)色氨酸和亮氨酸合成缺陷型酵母菌菌株是实验室常用的营养缺陷型菌株，将成功构建的上述基因表达载体通过__________________法导入到处于感受态的色氨酸和亮氨酸合成缺陷型酵母菌中，在培养基中需添加____________________用于筛选成功导入基因表达载体的酵母菌。
(3)两种载体成功导入酵母菌并表达，结果为蛋白质X和蛋白质Y、蛋白质X羧基端和蛋白质Y、蛋白质X和蛋白质Y羧基端、蛋白质X羧基端和蛋白质Y羧基端之间有相互作用。据此可推测的结论是______________________。不同蛋白质之间相互作用是通过检测________________________________得到的。
解析：(1)扩增蛋白质X基因和蛋白质Y基因全序列分别需要2种引物，共需4种；单独扩增蛋白质X的氨基端基因序列需要额外1种引物(其中一种引物与扩增蛋白质X基因全序列时相同)，同理单独扩增蛋白质X羧基端基因、蛋白质Y氨基端基因、蛋白质Y羧基端基因各额外需要1种引物，共4种；故使用PCR扩增技术对蛋白质X基因和蛋白质Y基因的6种序列进行扩增，需8种引物。在构建基因表达载体时，需使用同种限制酶切割目的基因与载体，使其形成相同末端以便使用DNA连接酶进行连接。观察可知pLexA-JL载体的目的基因插入位点含有的酶切位点对应限制酶分别为EcoRⅠ和BamHⅠ，pB42AD载体的目的基因插入位点含有的酶切位点对应的限制酶分别为EcoRⅠ和XhoⅠ。构建好基因表达载体后，可以使用DNA电泳，观察电泳结果是否出现预期大小的目标条带，来确定表达载体构建是否成功。(2)将目的基因导入微生物细胞常用的方法为Ca2＋处理法。表达载体上所含有的标记基因为AmpR基因，即氨苄青霉素抗性基因。可通过向培养基中加入氨苄青霉素，观察细胞的存活状态来确定转化是否成功，能在添加了氨苄青霉素的培养基上存活的微生物即为已完成转化的酵母菌。(3)蛋白质X和蛋白质Y均具有氨基端和羧基端，能观察到蛋白质X和蛋白质Y结合的结果，说明蛋白质X和蛋白质Y之间有相互作用；同时能观察到蛋白质X羧基端和蛋白质Y、蛋白质X和蛋白质Y羧基端、蛋白质X羧基端和蛋白质Y羧基端的作用结果，说明蛋白质X和蛋白质Y的作用位置分别在两种蛋白质的羧基端。由于只有当蛋白质X和蛋白质Y相互作用时，转录因子的DNA结合功能域(DNA-BD)和转录激活结构域(DNA-AD)才能发挥作用，进而激活报告基因的启动子，从而驱动对报告基因(LacZ基因)的转录，进而得以表达。因此，可以通过检测报告基因(LacZ基因)的表达情况来确定不同蛋白质之间是否发生作用。
答案：(1)8　EcoRⅠ、BamHⅠ　EcoRⅠ、XhoⅠ 　电泳　(2)Ca2＋处理　氨苄青霉素　(3)蛋白质X和Y之间具有相互作用，X蛋白和Y蛋白作用位置在羧基端　报告基因的表达(或LacZ的表达)

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