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3.2基因工程的基本操作程序——高二生物学人教版（2019）选择性必修三同步课时作业
一、单选题
1．人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因的主要作用是( )
A.便于与外源基因连接
B.增加质粒分子的分子量
C.提高受体细胞在自然环境中的耐药性
D.有利于对目的基因是否导入进行检测
2．下列不宜作为基因工程中标记基因的是( )
A.核糖体蛋白基因 B.荧光蛋白基因
C.产物具有颜色反应的基因 D.抗性基因
3．将含目的基因的表达载体导入棉花细胞，我国科学家独创的方法是( )
A.电融合法 B.花粉管通道法 C.农杆菌转化法 D.显微注射法
4．我国考古学家利用现代人的DNA序列设计并合成了一种类似磁铁的“引子”，成功将极其微量的古人类DNA从提取自土壤沉积物中的多种生物的DNA中识别并分离出来，用于研究人类起源及进化。下列说法正确的是( )
A.“引子”的彻底水解产物有两种
B.设计“引子”的DNA序列信息只能来自核DNA
C.设计“引子”前不需要知道古人类的DNA序列
D.土壤沉积物中的古人类双链DNA可直接与“引子”结合从而被识别
5．当前，肺结核（由结核杆菌引起）仍然是严重危害人类健康的重大传染病。取患者的痰进行结核杆菌培养是诊断肺结核的国际标准，但此方法检测周期较长，而其他检测方法存在诊断率过低的情况。cfDNA是由某些细胞裂解后释放在体液中的一种胞外DNA片段，cfDNA在产前诊断、肿瘤诊断和监测中具有广泛应用。为开展cfDNA检测对肺结核病诊断价值的研究，下列属于必要研究步骤的有( )
①以结核杆菌的多个特异性基因为基础设计PCR引物；②研究cfDNA的基本化学组成成分；③取肺结核患者和非肺结核肺病患者的痰进行培养；④检测数名肺结核患者的cfDNA水平；⑤检测数名非肺结核肺病患者的cfDNA水平
A.①②③④ B.①②④⑤ C.②③④⑤ D.①③④⑤
6．下列关于DNA粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定的原理的叙述不正确的是( )
A.利用蛋白质不溶于酒精，但DNA溶于酒精的原理，可分离DNA与蛋白质
B.利用在沸水浴下DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色的原理对粗提取的DNA进行鉴定
C.PCR技术利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA氢键解聚与结合
D.电泳鉴定DNA利用了DNA在电场中会向着它所带电荷相反的电极移动的原理
7．我国科学家钱嘉韵发现并分离了耐高温的DNA聚合酶，将PCR变成了真正成熟的技术。下列关于PCR技术正确的是( )
A.两种引物在DNA聚合酶的作用下与两条单链DNA结合
B.除了耐高温的DNA聚合酶外，PCR还需要用到解旋酶
C.PCR技术是依据细胞内基因表达的原理进行研发的
D.在基因工程中，PCR技术可以用于目的基因的检测
8．利用PCR获得目的基因后，用限制酶EcoRⅠ同时处理目的基因与质粒，拼接后可得到重组基因表达载体，其部分DNA片段如下图所示。下列有关引物的分析正确的是( )
A.通过PCR获取目的基因时，所选的引物可为引物2和引物3
B.检测目的基因是否插入质粒且方向是否正确时，应选用引物1和引物4进行PCR
C.若设计的引物与模板不完全配对，可适当提高PCR复性的温度
D.DNA聚合酶能与引物结合，并从引物的5'端连接脱氧核苷酸
9．利用PCR技术将某小段DNA分子扩增n代，需( )
A.测定DNA片段的核苷酸序列，以便设计引物对
B.2n﹣1对引物参与子代DNA分子的合成
C.向反应体系中加入解旋酶、DNA聚合酶等
D.保持反应体系温度恒定，确保扩增的正常进行
10．科学家将抵御干旱胁迫反应中具有调控作用的AhCMO基因转入棉花细胞中，培育出了转基因抗旱棉花。下列相关叙述错误的是( )
A.将AhCMO基因导入棉花细胞可用农杆菌转化法
B.构建基因表达载体是培育转基因抗旱棉花的核心工作
C.AhCMO基因成功插入棉花细胞染色体上也未必能正常表达
D.PCR扩增AhCMO基因时需要设计两种碱基互补的引物
11．下列关于基因工程的叙述，正确的是( )
A.抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株，其DNA检测均含目的基因，抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂。表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者目的基因没有表达
B.基因工程导入受体细胞，若是微生物用显微注射法
C.质粒可以作为基因的载体使用，通常采用抗生素合成基因作为标记基因
D.目的基因在供体细胞与受体细胞中的表达产物可能不同
12．苏云金杆菌通过合成苏云金杆菌伴孢晶体蛋白（Bt抗虫蛋白）破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家将该细菌的Bt抗虫蛋白基因通过基因工程转移到棉花细胞里，让棉花也能产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。该过程的核心步骤是( )
A.获取Bt抗虫蛋白基因 B.将Bt抗虫蛋白基因导入棉花细胞
C.构建Bt抗虫蛋白基因表达载体 D.Bt抗虫蛋白的检测和鉴定
13．荧光蛋白的发现可以说是革新了生物学研究，下列叙述错误的是( )
A.荧光蛋白中一定含有C、H、O、N四种元素
B.荧光蛋白可作为标记蛋白，用于研究癌细胞的转移
C.利用PCR技术准确扩增出荧光蛋白基因的关键是引物的正确设计
D.为了确保荧光蛋白基因在受体细胞中表达，应在荧光蛋白基因的下游添加启动子
14．某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是( )
A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E. coli DNA连接酶连接
B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E. coli DNA连接酶连接
15．由于PCR扩增出的目的基因末端为平末端，且无合适的限制酶识别序列，需借助中间载体P将目的基因接入载体E。下图为两种载体的结构和相关限制酶的识别序列，下列叙述正确的是( )
A.构建重组载体P时，应选择EcoRV进行酶切，再用T4DNA连接酶连接
B.为了便于该目的基因接入载体E，可用限制酶EcoRV或SmaI切割载体P
C.载体P不能作为基因表达载体，是因为它不含起始密码子和终止密码子
D.若受体细胞表现出抗性基因的相应性状，表明重组载体成功导入受体细胞
二、多选题
16．蜘蛛丝（丝蛋白）被称为“生物钢”，有着超强的抗张强度，下图为蛛丝蛋白基因对应的DNA片段结构示意图，其中1~4表示DNA上引物可能结合的位置，目前利用现代生物技术生产蜘蛛丝已取得成功。下列有关叙述正确的是( )
A.若从该DNA片段中直接获取蛛丝蛋白基因，会破坏4个磷酸二酯键
B.若用PCR技术获取目的基因，则图中的2、3分别是2种引物结合的位置
C.若受体细胞为大肠杆菌，则蛛丝蛋白的加工需要细胞中内质网和高尔基体的参与
D.在PCR仪中根据选定的引物至少需经过6次循环才可获得32个符合要求的目的基因
17．下列关于DNA片段的电泳鉴定实验的说法，错误的是( )
A.等琼脂糖凝固后插入梳子，形成加样孔
B.用微量移液器吸取不同的DNA样品时，需要更换枪头
C.电泳结束后，需用显微镜观察形成的电泳条带
D.电泳过程中既要使用核酸染色剂，也要使用电泳指示剂，它们的观察方法、作用一致
三、读图填空题
18．β—丙氨酸不仅是一种医药中间体，还可以作为食品添加剂，改善食物味道，提高产品质量。可运用构建L—天冬氨酸α—脱羧酶大肠杆菌的方式生产该氨基酸，制备工程菌的示意图如下，回答下列问题：
(1)构建工程菌主要需要四个步骤：______→基因表达载体的构建→______→目的基因的检测与鉴定。
(2)构建成功的C除含有目的基因外，还应含有______(答出三点即可)。该过程分别对质粒和含目的基因的片段进行双酶切，双酶切的优点是______。
(3)为了确定工程菌中的L—天冬氨酸α—脱羧酶基因是否转录，可用同位素或荧光标记的______作探针进行分子杂交检测。
(4)若要通过基因工程的方法探究L—天冬氨酸α—脱羧酶基因能否在酵母菌中表达，实验思路是______。
19．人体内的t-PA蛋白能高效降解血栓，是心梗和脑血栓的急救药。然而，为心梗患者注射大剂量的t-PA蛋白会诱发颅内出血。研究证实，将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血副作用。据此，先对天然的t-PA基因进行序列改造，然后再采取传统的基因工程方法表达该改良基因，可制造出性能优异的t-PA改良蛋白。下图是通过两次PCR操作，运用大引物进行定点突变获取t-PA改良基因和利用质粒pCLYⅡ构建含t-PA改良基因的重组质粒示意图。（注：一次PCR操作可进行多次循环）
（1）PCR扩增的第一步是使双链模板DNA变性。DNA中G+C的含量与变性要求的温度有关，DNA中G-C的含量越多，要求的变性温度越高。其原因是_____________。
（2）在PCR反应中，引物的作用是________________。
（3）如果要利用微生物进一步克隆PCR定点诱变产物，其步骤包括：_______、______、微生物的筛选和培养，从菌群中获取更多目的基因。为实现质粒和t-PA改良基因的高效连接，选用限制酶XmaⅠ而不选用限制酶SmaⅠ的原因是____________。为将t-PA改良基因连接在质粒上，还需要______________等酶。
20．为提高大豆对磷元素的吸收能力，研究人员利用基因工程将水稻的耐低磷基因OSPTF 转移到大豆植株中，部分实验过程如图所示。回答下列问题：
（1）基因工程的核心步骤是_____________________，用于基因工程的质粒除了需要图中所示结构外，还需要有_______________，目的基因插入质粒的位置是______________。
（2）将①导入大豆植株体细胞通常需要借助农杆菌，利用了农杆菌__________的特点，荧光蛋白基因的作用是______________________。
（3）研究人员欲对转基因大豆在低磷条件下对磷元素吸收能力进行检测，实验思路为：_________________________________。
参考答案
1．答案：D
解析：A、是否便于与外源基因连接，与限制酶切点的个数有关，限制酶切点个数越多，质粒越容易与外源基因连接，与抗性基因无关，A错误；
B、目的基因片段长度增加会加大克隆的难度，抗性基因客观上可能增加了质粒的分子量，但就其发挥的作用来讲，增加分子量并不是主要作用，抗性基因的主要作用是供重组DNA的鉴定和选择，更容易判断出目的基因是否导入，B错误；
C、提高受体细胞在自然环境中的耐药性不是质粒中抗性基因的作用，质粒作为载体，与受体细胞“和平相处”，不会改变受体细胞的耐药性，C错误；
D、质粒DNA分子上有特殊的标记基因，如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等标记基因，供重组DNA的鉴定和选择，更容易判断出目的基因是否导入，D正确。
故选D。
2．答案：A
解析：A、核糖体蛋白所有细胞中都含有，不易检测，不宜作为基因工程中标记基因，A符合题意；
B、发光基因如绿色荧光蛋白基因可以用作基因工程的标记基因，B不符合题意；
C、产物具有颜色反应的基因可根据颜色反应是否发生筛选重组质粒，可以用作基因工程的标记基因，C不符合题意；
D、抗性基因可作为基因工程的标记基因，筛选重组质粒，D不符合题意。
故选A。
3．答案：B
解析：A、电融合法可用于将含目的基因的表达载体导入棉花细胞，但是不是我国独创的，A不符合题意;B、花粉管通道法是我国科学家独创的一种方法，是一种十分简便经济的方法，我国的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的，B符合题意;C、农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞常用的方法，约80%的转基因植物都是用这种方法获得的，但是不是我国独创的，C不符合题意;D、显微注射技术是将目的基因导入动物细胞的常用方法，D不符合题意。故选B。
4．答案：C
解析：A、根据分析“引子”是一段DNA序列，彻底水解产物有磷酸、脱氧核糖和四种含氮碱基，共6种产物，A错误；B、由于线粒体中也含有DNA，因此设计“引子”的DNA序列信息还可以来自线粒体DNA，B错误；C、根据题干信息“利用现代人的DNA序列设计并合成了引子”，说明设计“引子”前不需要知道古人类的DNA序列，C正确；D、土壤沉积物中的古人类双链DNA需要经过提取，且在体外经过加热解旋后，才能与“引子”结合，而不能直接与引子结合，D错误。故选C。
5．答案：D
解析：①④⑤为开展cfDNA检测对肺结核病的诊断价值研究，需要以结核杆菌的多个特异性基因为基础设计PCR引物，检测数名肺结核患者和非肺结核肺病患者的cfDNA水平，检测是否含有结核杆菌的多个特异性基因，①④⑤正确；②cfDNA的基本化学组成成分脱氧核糖核苷酸，不需要研究，②错误；③同时还需要取肺结核患者和非肺结核肺病患者的痰进行结核杆菌培养，将cfDNA诊断结果与痰培养诊断结果比较，分析cfDNA检测的灵敏度，③正确。D符合题意。故选D。
6．答案：A
解析：A、DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步的分离，A错误；B、在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此可利用沸水浴下DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色的原理对粗提取的DNA进行鉴定，B正确；C、PCR技术利用了DNA的热变性原理，当温度超过90℃DNA分子解旋打开双链，当温度降至到50℃左右时碱基互补配对形成氢键，引物与模板链特异性结合，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，C正确；D、电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程，由于同性相斥、异性相吸，带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动，D正确。故选A。
7．答案：D
解析：A、两种引物与两条单链DNA结合依据碱基互补配对原则自动形成氢键，不需要DNA聚合酶的作用，A错误；B、PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开，B错误；C、PCR技术是依据细胞内DNA半保留复制的原理进行研发的，C错误；D、目的基因的检测与鉴定有分子水平上的检测与鉴定和个体水平上的鉴定，其中分子水平上的检测与鉴定可以利用PCR技术，D正确。故选D。
8．答案：A
解析：A、引物结合在模板链的3'端，通过PCR获取目的基因时，所选的引物可为引物2和引物3，A正确；
B、引物结合在模板链的3'端，检测目的基因是否插入质粒且方向是否正确时，应选用引物2和引物4进行PCR，B错误；
C、若设计的引物与模板不完全配对，可适当降低PCR复性的温度，以便引物与模板链结合，C错误；
D、DNA聚合酶能与引物结合，并从引物的3'端连接脱氧核苷酸，D错误。
故选A。
9．答案：A
解析：A、利用PCR技术扩增DNA时需要引物的参与，因此需要测定DNA分子两端的核苷酸序列，以便设计引物对，A正确；B、依据题意，将某小段DNA分子扩增n代，子代DNA分子总数为2n，其中除了两条最初的模板链不含引物外，其他的链均含有引物，因此需要2n－1对引物参与子代DNA分子的合成，B错误；C、PCR技术中双链DNA解开不需要解旋酶，且PCR扩增DNA分子是在较高温度下进行的，因此需要热稳定DNA聚合酶，C错误；D、PCR扩增的过程为高温变性、低温复性、中温延伸，可见整个过程中并不要保持恒温，D错误。故选A。
10．答案：D
解析：A、将AhCMO基因导入棉花细胞可用农杆菌转化法，因为农杆菌中的Ti质粒能将目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上，A正确；B、构建基因表达载体是培育转基因抗旱棉花的核心工作，即基因表达载体的构建是基因工程的核心，B正确；C、AhCMO基因成功插入棉花细胞染色体上也未必能正常表达，因为基因的表达包括转录和翻译两个步骤，因此还需要对转基因棉花进行进一步的检测和鉴定，C正确；D、PCR扩增AhCMO基因时需要设计两种引物，这两种引物之间不能发生碱基互补配对，否则无法实现DNA体外扩增，D错误。故选D。
11．答案：D
解析：A、抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株，但不抗除草剂，也可能是翻译后的肽链未能正确折叠形成特定的空间结构，A错误；B、基因工程导入受体细胞时，动物细胞才可以采用显微注射法，B错误；C、质粒中的抗生素抗性基因通常作为标记基因，C错误；D、原核细胞中表达的真核细胞基因，由于原核细胞没有内质网、高尔基体等细胞器，表达产物与真核细胞中可能不同，D正确。故选D。
12．答案：C
解析：基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，因此，构建B抗虫蛋白基因表达载体是该过程的核心步骤，C正确。故选C。
13．答案：D
解析：A、蛋白质的元素组成主要是C、H、O、N，荧光蛋白中一定含有C、H、O、N四种元素，A正确;B、荧光蛋白在一定条件下能发荧光，故可作为标记蛋白，用于研究瘟细胞的转移，B正确;C、利用PCR技术准确扩增出荧光蛋白基因的关键是引物的正确设计，设计引物序列的主要依据是目的基因两端的部分核苷酸序列，C正确;D、启动子可用于驱动基因的转录，为了确保荧光蛋白基因在受体细胞中表达，应在启动子下游添加荧光蛋白基因，D错误。故选D。
14．答案：C
解析：只用一种限制酶切割质粒和目的基因，会使质粒和目的基因发生自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，A错误；用酶1切割目的基因，产生的是黏性末端，用酶3切割质粒，产生的是平末端，无法连接，B错误；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后，可使用T4 DNA连接酶连接，使目的基因定向插到质粒中，C正确；酶2和酶4切割后产生的黏性末端相同，易导致目的基因和质粒自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，并且用酶4切割会破坏标记基因，D错误。
15．答案：A
解析：AB、由于载体E只有产生黏性末端的酶切位点，要使中间载体P接入载体E，同时防止载体E自身环化，需要用两种限制酶分别切割载体E和中间载体P，据图可知，中间载体P和载体E均含有XhoI和PstI酶识别序列，故可选用XhoI和PstI酶进行酶切，载体P的这两种酶识别序列中含有EcoRV识别位点，并且其切割的为平末端，可以用于连接目的基因，SmaI酶虽然也能切割得到平末端，但是其识别位点没有位于XhoI和PstI酶识别位点之间，故不能选择其对中间载体P进行切割，连接平末端只能用T4DNA连接酶，A正确，B错误；C、由图可知，不直接选择P构建表达载体是因为它不含启动子与终止子，C错误；D、受体细胞表现出抗性基因的相应性状，可能是导入了重组质粒，也可能只导入了空质粒（不含目的基因的质粒），D错误。故选A。
16．答案：ABD
解析：A、若从该DNA片段中直接获取蛛丝蛋白基因,DNA每条链上会破坏2个磷酸二酯键,共会破坏4个磷酸二酯键,A正确;
B、由于DNA聚合酶只能从5′→3′延伸子链,图中的磷酸基团为5'端,羟基为3′端,由引物3′端延伸子链,子链和模板链反向平行,因此根据引物的延伸方向可知图中与引物结合的部位是2、3,B正确;
D、如图所示,设X基因为目的基因。经过第一轮复制以亲代DNA的两条链做模板,可以得到①和②两种DNA;经过第二轮复制可以得到①和③、②和④;经过第三轮复制可以得到①和③、③和⑤、②和④、④和⑤;第四轮复制得到16个DNA分子,即①和③、2个③和2个⑤、②和④、2个④和2个⑤、第三轮的2个⑤得到4个⑤(统计为①、②、3个③、3个④、8个⑤);第五轮复制得到32个DNA分子,即①和③、②和④、3个③和3个⑤、3个④和3个⑤、第四轮的8个⑤得16个⑤(统计为①、②、4个③、4个④、22个⑤;⑤为目的基因即还未获得32个目的基因),第六轮复制得64个DNA分子,即①和③、②和④、4个③和4个⑤、4个④和4个⑤、第五轮的22个⑤得44个⑤(统计为①、②、5个③、5个④、52个⑤;⑤为目的基因,即此时获得32以上符合条件的目的基因),综上所述,需要至少6次循环可获得32个符合要求的目的基因,D正确。
故选:B。
17．答案：ACD
解析：进行琼脂糖凝胶电泳时，应将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔，等凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，A错误；为保证实验结果的准确性，用微量移液器吸取不同的DNA样品时，需要更换枪头，B正确；电泳结束后，需将凝胶置于紫外灯下进行观察，C错误；电泳过程中既要使用核酸染色剂，也要使用电泳指示剂，它们的观察方法、作用不同，凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长300nm的紫外灯下被检测出来，D错误。
18．答案：(1)目的基因的获取；将目的基因导入受体细胞；
(2)启动子、终止子、标记基因；防止质粒和目的基因的自身环化及反向连接；
(3)L—天冬氨酸α—脱羧酶基因单链；
(4)将L—天冬氨酸α—脱羧酶基因转入酵母菌，检测酵母菌中β—丙氨酸的含量。
解析：(1)构建工程菌主要需要四个步骤:目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定。
(2)C为重组质粒(基因表达载体),除含有目的基因外,还应含有启动子、终止子、标记基因等;该过程分别对质粒和含目的基因的片段进行双酶切,双酶切的优点是防止质粒和目的基因的自身环化及反向连接。
(3)为了确定受体细胞中L一天冬氨酸a一脱羧酶基因是否转录,可用标记的L一天冬氨酸a-脱羧酶基因单链作探针进行分子杂交检测,观察是否出现杂交带。
(4)若要通过基因工程的方法探究L-天冬氨酸a-脱羧酶基因能否在酵母菌中表达,应将L-天冬氨酸a-脱羧酶基因转入酵母菌,检测酵母菌中β-丙氨酸的含量。
19．答案：（1）DNA中G+C含量越多，其氢键越多，结构越稳定，变性时所需温度越高
（2）使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸
（3）基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；限制酶SmaⅠ切割产生的末端为平末端，无法与t-PA改良基因上的黏性末端连接；BglⅡ、DNA连接酶
解析：（1）DNA分子的热稳定性与碱基对中的氢键数量有关，DNA中G和C之间有三个氢键，A和T之间只有两个氢键，G+C含量越多，其氢键越多，结构越稳定，变性时所需温度越高。
（2）在PCR反应中，引物引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物长度通常为20 30个核苷酸，作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。
（3）如果要利用微生物进一步克隆PCR定点诱变产物，其步骤包括：基因表达载体的构建（这是基因工程的核心步骤）、将目的基因导入受体细胞、微生物的筛选和培养，从菌群中获取更多目的基因。为实现质粒和t-PA改良基因的高效连接，选用限制酶XmaⅠ而不选用限制酶SmaⅠ的原因是：限制酶SmaⅠ切割产生的末端为平末端，限制酶XmaⅠ产生的是黏性末端，t-PA改良基因为黏性末端，限制酶SmaⅠ切割产生的平末端无法与t-PA改良基因上的黏性末端连接。为将t-PA改良基因连接在质粒上，还需要BglⅡ、DNA连接酶等酶。
20．答案：（1）基因表达载体的构建；启动子、终止子、复制原点；启动子和终止子之间
（2）能将Ti质粒上的T-DNA转移被侵染的细胞，并将其整合到该细胞的染色体DNA上；便于重组DNA分子的筛选
（3）将生理状态相似的野生大豆植株与转基因大豆植株分别置于低磷溶液中进行培养，一段时间后检测培养液中磷元素含量
解析：（1）基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建。用于基因工程的质粒除了需要图中所示结构外，还需要有启动子、终止子、复制原点。为了保证目的基因的正常表达，目的基因插入质粒的位置是启动子和终止子之间。
（2）由于农杆菌能将Ti质粒上的T-DNA转移被侵染的细胞，并将其整合到该细胞的染色体DNA上，因此将①导入大豆植株体细胞通常需要借助农杆菌。含有重组DNA分子的农杆菌含有荧光，不含重组DNA分子的农杆菌不发荧光，因此荧光蛋白基因的作用是便于重组DNA分子的筛选。
（3）实验目的是探究转基因大豆在低磷条件下对磷元素吸收能力，自变量是大豆植株种类（野生大豆植株与转基因大豆植株），检测指标是培养液中磷元素含量，因此实验思路是将若生理状态相似的野生大豆植株与转基因大豆植株分别置于低磷溶液中进行培养，一段时间后检测培养液中磷元素含量。

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