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第33讲 发酵工程
2025生物一轮复习
发酵工程：
是指利用微生物的特定功能，通过现代工程技术，规模化生产对人类有用的产品。它涉及菌种的选育和培养、产物的分离和提纯等方面。
科学家发现了酶在酵母菌发酵中的作用，之后微生物的分离和纯化技术得到了应用。
1897年
用微生物生产谷氨酸获得成功，酶制剂、多糖、维生素发酵工业兴起。
1957年
科学家开始运用数学、动力学、化学工程原理以及计算机技术对发酵过程进行综合研究。
20世纪80年代以后
法国微生物学家巴斯德通过实验证明酒精发酵是由活的酵母菌引起的，从而将酵母菌与发酵联系起来。
1857年
利用发酵工程大规模生产青霉素，随着链霉素、金霉素和土霉素等抗生素的发现及生产，抗生素发酵工业兴起。
20世纪40年代
基因工程。细胞工程等发展，人胰岛素和干扰素大量生产。
20世纪70年代以后
1900
1940
1960
1850
1980
1970
约9000年前
我们祖先就会利用微生物将谷物、水果发酵为含酒精的饮料。
科技探索之路(教材P2-3)
发酵与传统发酵技术
发酵与传统发酵技术
腐乳的制作
泡菜的制作
果酒和果醋的制作
9000年前，我们的祖先就会利用微生物将谷物，水果等发酵成含酒精的饮料。
1857年，法国微生物学家巴斯德通过实验证明，酒精发酵是由活的酵母菌引起的。
一、发酵与传统发酵技术(教材P4)
人们利用微生物，在适宜的条件下，将原料通过微生物的代谢转化为人类所需要的产物的过程。
是指直接利用原材料中天然存在的微生物，或利用前一次发酵保存下来的面团、卤汁等发酵物中的微生物进行发酵、制作食品的技术。
传统发酵技术的特点：
以混合菌种的固体发酵及半固体发酵为主，通常是家庭式或作坊式的。
食品：腐乳，酱油，酱，醋，泡菜和豆豉等。
一、发酵与传统发酵技术
发酵：
传统发酵技术：
原理：
不同的微生物具有产生不同代谢物的能力，因此利用它们就可以生产出人们所需要的多种产物。
需氧发酵
厌氧发酵
如：醋酸发酵、谷氨酸发酵
如：酒精发酵、乳酸发酵
类型：
1．下列关于传统发酵技术的相关叙述错误的是(　　)
A．传统发酵技术以固体发酵和半固体发酵为主
B．我国具有悠久的酿酒文化，是因为我们的祖先发现酵母菌可以应用于酿酒，并一直延续至今
C．9000年前，我们的祖先就会利用微生物将谷物制成含酒精的饮料
D．早在公元5世纪的北魏古籍中，就有关于腐乳生产工艺的记载，腐乳也是经微生物发酵而成的食品
考点题型突破
B
2、微生物的作用原理：　
蛋白质
小分子肽+氨基酸
蛋白酶
脂 肪
甘油+脂肪酸
脂肪酶
1、应用的微生物：酵母、曲霉、毛霉等，起主要作用的是毛霉。
毛霉是一种丝状真菌，其生殖方式为孢子生殖，代谢类型是异养需氧型。
二、腐乳的制作
3、 腐乳的特点：味道鲜美，易于吸收，本身又便于保存
二、腐乳的制作
4. 方法步骤
豆腐切块，接种毛霉，发酵
加卤汤
装瓶
密封腌制
腐乳
加盐腌制
含水量70%为宜。
含水量过高不易成形；
过低不利于毛霉生长。
析出豆腐中的水，使豆腐变硬；抑制微生物生长，避免腐败变质。
过高：影响风味
过低：易腐败
由酒及各种香辛料配制而成防腐杀菌，增加口味。
含酒量：12%。
过高：时间延长；
过低：易腐败。
5. 缺点：生产条件不易控制，容易受杂菌污染；生产效率较低，产物不单一
（1）分类：
（2）来源：
（3）代谢类型：
（4）生殖方式：
乳酸杆菌（制作酸奶）
乳酸链球菌（制作泡菜）
三、泡菜的制作（教材P5、P6）
1.菌种：乳酸菌（原核生物）
乳酸菌种类很多，常见的有乳酸杆菌和乳酸链球菌。
乳酸菌在自然界中分布广泛，空气、土壤、植物体表、人或动物的肠道内都有分布。制作传统泡菜是利用植物体表面天然的乳酸菌来进行发酵的。
异养厌氧型
二分裂
2 .泡菜发酵的原理　
C6H12O6
2C3H6O3（乳酸）
酶
+能量
3 .泡菜制作过程　
（1）泡菜制作原理
植物体表面的天然的乳酸菌来进行发酵，在无氧的条件下，乳酸菌将糖分解为乳酸。发酵期间，乳酸不断积累，当它的质量分数为0.4%—0.8%时，泡菜的口味和品质最佳。
三、泡菜的制作（教材P5、P6）
（2）材料用具
食盐、清水、新鲜蔬菜、蒜瓣、生姜及其它香辛料；
泡菜坛或其它密封性良好的罐子等。
三、泡菜的制作（教材P5、P6）
（3）方法步骤
配制盐水
用清水和食盐配制质量分数为5%-20%的盐水，并将盐水煮沸，冷却待用；
蔬菜处理、装坛
将新鲜蔬菜洗净，切成块状或条状，混合均匀，晾干后装入泡菜坛内；装至半坛时，加入蒜瓣、生姜及其他香辛料，继续装至八成满；
加盐水
将冷却好的盐水缓缓倒入坛中，使盐水没过全部菜料，盖好坛盖；
封坛发酵
向坛盖边缘的水槽中注满水，并在发酵过程中注意经常向水槽中补充水；根据室内温度控制发酵时间。
三、泡菜的制作（教材P5、P6）
1.配制盐水时以下物质或操作的作用或目的：
①盐的作用：
调味、抑制其他微生物生长
②盐水浓度要适宜的目的：
过高，乳酸发酵受抑制，泡菜风味差；
③煮沸的目的：
杀菌除氧
④冷却的目的：
为了不影响乳酸菌的生命活动
过低，杂菌易繁殖，导致泡菜变质
思考：
三、泡菜的制作（教材P5、P6）
3.用水密封泡菜坛的目的是什么？这说明泡菜制作需要什么条件？
给泡菜坛内创造无氧环境
无氧条件
2.为什么泡菜坛只能装八成满？
① 发酵初期，酵母菌等较为活跃，发酵产物中有较多的CO2，防止发酵液溢出坛外；
② 防止因装太满使盐水未完全淹没菜料而导致菜料变质腐烂；
③留有一定空间，更方便拿取泡菜。
思考：
如何判断你腌制的泡菜是否成功？色泽如何？口味如何？
泡菜质量可以根据泡菜的色泽和风味进行初步的评定；
一般来说，腌制成功的泡菜汤清亮，无梅花浮膜，菜质脆嫩度适口，酸甜咸味适宜，具有一定的香气，咀嚼后无渣等。
根据亚硝酸盐的含量来评定；
根据不同时期泡菜坛中乳酸菌的数量来评定。
可以通过在显微镜下观察乳酸菌的形态；
泡菜虽好吃，但不宜多吃，泡菜中的亚硝酸盐会危及人体健康。
三、泡菜的制作（教材P5、P6）
思考：
(1)亚硝酸盐为白色粉末，外观与食盐相似，有咸味，易溶于水，可作食品添加剂。
(2)亚硝酸盐分布广泛，蔬菜、咸菜、豆粉中均含有。
(3)膳食中的亚硝酸盐一般不会危害人体健康，绝大部分亚硝酸盐只是“过客”，随尿排出。
(4)当人体摄入的亚硝酸盐总量达到0.3g～0.5g时，会引起中毒，当摄入总量达到3g时，会引起死亡。
蔬菜水果
亚硝酸盐
pH、温度
微生物
亚硝胺
硝酸盐
硝酸盐还原菌
维生素C、E
和酚类物质
注意：发酵温度高；食盐用量过低；发酵时间短容易导致硝酸还原菌大量增殖，产生较多的亚硝酸盐
人类的某些癌症与亚硝胺(化学致癌因子)有关
拓展：亚硝酸盐
发酵时期 乳酸菌 乳酸 亚硝酸盐
发酵初期
发酵中期
发酵后期
变化曲线
少（O2抑制乳酸菌活动）
少
增加（硝酸盐还原菌的作用）
最多（乳酸积累，抑制其他菌活动）
增多
达到最多后开始下降（硝酸盐还原菌受抑制，部分亚硝酸盐被分解）
减少（乳酸积累，pH下降，抑制乳酸菌活动）
继续增多，最后保持稳定
下降至保持相对稳定（硝酸盐还原菌被完全抑制）
拓展：乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐含量的变化情况分析
1.误认为只有乳酸菌发酵：前期主要是有氧发酵消耗氧气，形成无氧环境，后期主要是乳酸发酵。
2.误认为泡菜制作全过程都是无氧发酵，蔬菜装坛能装满：装八成满，防止早期发酵产生的CO2使发酵液溢出。
误区警示和注意事项
误区警示
注意事项
1、为什么含有抗生素的牛奶不能发酵为酸奶？
牛奶发酵为酸奶主要依靠乳酸菌的发酵作用，而抗生素能够杀死或抑制乳酸菌。
2、为什么要多吃新鲜蔬菜，不吃存放时间过长、变质的蔬菜？
有些蔬菜，如小白菜和萝卜等含有丰富的硝酸盐。当这些蔬菜放置过久时发生变质（发黄、腐烂）或者煮熟后存放太久时，蔬菜中的硝酸盐会被微生物还原成亚硝酸盐，危害人体健康。
联系生活
联系生活
某同学在制作泡菜前，查阅资料得知，可以向泡菜坛中加些“陈泡菜水”，在用5﹪的食盐水制作泡菜时，他在不同时间测定了泡菜中亚硝酸盐的含量，结果见右栏
曲线图，请你帮他分析问题。
1、据图分析，从亚硝酸盐含量来看，你认为该泡菜在什么时间食用比较合适？为什么？
2、他第一次制作出的泡菜“咸而不酸”，造成这个结果最可能的原因是什么？
3、加入“陈泡菜水”的目的是什么？
在发酵10天后食用比较合适，因为此时亚硝酸盐含量已经降到较低水平。
可能是食盐浓度过高、发酵温度过低等原因导致泡菜未能正常发酵。
“陈泡菜水”中含有纯度较高的乳酸菌，加入“陈泡菜水”相当于接种乳酸菌，可快速发酵产生乳酸。
拓展应用：教材P8
4．酸豆角以其色泽金黄、咸酸适宜、鲜香嫩脆的特有品质深受人们的喜爱。下列有关酸豆角制作工艺及特有品质的叙述，错误的是(　　)
A．酸豆角色泽金黄的原因可能是原豆角中的叶绿素被乳酸破坏
B．食盐的用量不仅影响酸豆角的口感，还会影响其中亚硝酸盐的含量
C．酸豆角腌制过程中，仅有厌氧的乳酸菌活动，故发酵时需营造严格的无氧环境
D．在发酵过程中，豆角的细胞壁受到的损伤比较小，故酸豆角能保持嫩脆的口感
考点题型突破：讲义P129
C
1.果酒制作的原理
（1）所需菌种：_____________，属于真核生物，其代谢类型为_____________ 。
最适生长温度约为 ___________。
（2）菌种的生活特点:
①在有氧条件下，进行有氧呼吸，大量繁殖。
反应式：_ __________________________________________。
②在无氧条件下，进行___________。
反应式：___________________________________________。
（3）生产应用:
异养兼性厌氧型
C6H12O6＋6O2＋6H2O→6CO2＋12H2O＋能量
酒精发酵
C6H12O6→2C2H5OH＋2CO2＋能量
28℃
酶
酶
四、果酒和果醋的制作(教材P6—7)
酵母菌
可用于酿酒、制作馒头和面包等
2.果醋制作的原理
(1)所需菌种：醋酸菌，属于原核生物，其代谢类型为___________，最适生长温度为______________。
(2)菌种的生活特点
①当氧气、________都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸。
反应式： ___________________________________________________。
②当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为________，再将乙醛变为醋酸。
反应式：___________________________________________。
糖源
乙醛
异养需氧型
30 ℃～35 ℃
C6H12O6＋2O2→2CH3COOH＋2H2O＋2CO2＋能量
酶
C2H5OH＋O2→CH3COOH＋H2O＋能量
酶
四、果酒和果醋的制作
3. 果酒和果醋的制作　
（1）制作原理
（2）材料用具
葡萄的果皮表面附着有大量的不同种类的野生酵母菌。在这些酵母菌的作用下，水果可以发酵成果酒。在有氧的条件下，果酒经醋酸菌的作用还可以进一步发酵成果醋。
新鲜的葡萄、洗洁精、70%的酒精、发酵瓶、纱布和榨汁机等。
四、果酒和果醋的制作
清洗葡萄
榨汁装瓶
将发酵瓶、榨汁机等器具用洗洁精清洗干净，并用体积分数为70%的酒精消毒，晾干备用。
取新鲜葡萄，用清水冲洗1~2次，再去除枝梗和腐烂的籽粒，沥干。
用榨汁机榨取葡萄汁，将葡萄汁装入发酵瓶中（注意：要留有大约1/3的空间），盖好瓶盖。
清洗器具
果醋发酵
酒精发酵
将温度控制在18~30℃进行发酵。在发酵过程中，每隔12h左右将瓶盖拧松一次（注意：不是打开瓶盖），此后载拧紧瓶盖。发酵时间为10~12d。可通过从发酵瓶口取样来对发酵的情况进行监测。
当葡萄酒制作完成后，打开瓶盖，盖上一层纱布，进行葡萄醋的发酵。发酵温度为30~35℃，时间为7~8d。
（3）制作步骤
四、果酒和果醋的制作
四、果酒和果醋的制作
4. 结果鉴定　
通过嗅闻、观察和品尝初步鉴定(可能的结果如下)
项目 酒精发酵 乙酸发酵
气味和味道 酒味 酸味
气泡和泡沫 有气泡和泡沫 无气泡和泡沫
发酵液状态 混浊 混浊，液面形成白色菌膜
酒精发酵的结果检测：
乙酸发酵的结果检测：
酸性的重铬酸钾（橙色变为灰绿色）
可通过检测和比较乙酸发酵前后的pH作进一步的鉴定。
3.发酵瓶中留有大约1/3的空间：先让酵母菌进行有氧呼吸快速繁殖，耗尽氧气后再进行酒精发酵；其次，防止发酵过程中产生CO2造成瓶内压力增大，导致发酵液的溢出。
4.将瓶盖拧松：防止空气中其他杂菌污染，释放瓶内的CO2
注意事项
1.冲洗葡萄后去枝梗：以避免除去枝梗时引起葡萄破损，增加被杂菌污染的机会
2.冲洗葡萄的次数不能过多：以防将葡萄皮上的野生型酵母菌冲洗掉
（1）在制作果酒和果醋的过程中，发酵液分别有哪些变化？其中最明显的变化发生在发酵后多少天？引起变化的原因是什么？
四、果酒和果醋的制作
5. 结果分析和评价　
a.在葡萄酒的制作过程中，发酵液会产生气泡，这是因为酵母菌发酵产生了CO2；
b.开始发酵后，CO2产生越来越多，会使发酵液出现“沸腾”现象，在发酵的10天后，这种现象最明显；
c.发酵过程产热，会使发酵液温度上升，应注意控温；
d.发酵过程中，由果皮进入发酵液的花青素会越来越多，因而发酵液的颜色会逐渐加深变成深红色；
e.果醋发酵完成后，发酵液的液面上会出现一层菌膜，即醋酸菌膜；
（2）在制作果酒的过程中，除了酵母菌, 是否还有其他微生物生长？它们会对果酒发酵产生影响吗？如果有，如何避免这种影响？
四、果酒和果醋的制作
5. 结果分析和评价　
可以通过调节发酵的温度、果酒的pH等来控制乳酸菌的含量。果汁中的糖也是醋酸菌重要的碳源和能源。在有氧的情况下，醋酸菌能把糖分解成醋酸；在缺少糖源的情况下，乙醇便是醋酸菌的碳源和能源，它将乙醇转化为乙醛，再将乙醛变为醋酸。
由于醋酸菌在有氧的条件下才能进行旺盛的代谢活动，因此在制作果酒的过程中尽量减少O2含量，可以抑制醋酸菌的生长繁殖。此外，通过调节发酵的温度、果酒的pH等同样可以控制醋酸菌的含量。
果酒中除了酵母菌,还有乳酸菌、醋酸菌等微生物。乳酸菌可能分解果酒中的糖、甘油、酒石酸等，从而使果酒变质。
（3）在制作果醋的过程中，酵母菌是否还会继续发酵？醋酸菌从何而来？采用什么措施可以加快果醋的制作？
四、果酒和果醋的制作
5. 结果分析和评价　
随着醋酸发酵的进行，发酵液的pH、发酵温度等均不利于酵母菌的生长繁殖，因此酵母菌活性很低。
在我们的实验条件下，当打开瓶盖后，空气中的醋酸菌会进入发酵液中大量繁殖，其他的菌因不适应环境条件而不能繁殖。
在工业上,后期醋的发酵需要人工接种醋酸菌。我们制作果醋时，可以先买一瓶醋，将其打开暴露于空气中,一段时间后在醋的表面会有一层薄膜(实际上是醋酸菌)，用这层薄膜进行接种可以明显缩短制作果醋的时间。
（4）你制作的果酒和果醋的口味如何？如果你对结果不满意，应该如何改进？
制作成功的葡萄酒爽口，柔和，有浓郁的果香味；
制作成功的果醋有特有的果香，酸味柔和，稍有甜味，不涩。
如果对制作结果不满意，应从制作过程全面考虑改进措施，如严格控制发酵条件，发酵所用装置要进行清洗、晾干、消毒等。
四、果酒和果醋的制作
5. 结果分析和评价　
（5）在果酒和果醋制作中，哪些做法可防止发酵液被污染？
a.发酵瓶、榨汁机等器具用洗洁精清洗干净，并用体积分数为70%的酒精消毒，晾干备用；
b.处理葡萄时应先冲洗再去除枝梗；
c.排气时只需拧松瓶盖，不要打开瓶盖
思考：有3位同学分别采用了3种不同的发酵装置来制作果醋。A同学用的是带盖的塑料瓶；B同学用的是没有盖的塑料瓶，在发酵过程中无盖的瓶口一直由捆绑在瓶口的8层纱布覆盖；C同学则设计了如右图所示的发酵装置。结合果醋的制作原理，你认为哪一种发酵装置更适合制作果醋？你还能继续改进这种装置吗？
C同学的装置更适合制作果醋。
6. 设计果酒果醋发酵装置（教材P8）
四、果酒和果醋的制作
下图为果酒、果醋的简易发酵装置，在果酒和果醋的发酵过程中，充气口、排气孔各有什么作用？应该如何控制？出料口的作用又是什么？排气口为什么做成长而弯曲的形状？如何对该装置做进一步改进？
排出CO2
防止空气中微生物的污染
便于取样检测
改进：可在充气口填充棉花或者安装其他过滤装置，以防止充入的气体携带外来杂菌污染发酵液等
充气口
排气口
出料口
长而弯曲的胶管
制作果醋时连接充气泵，通入无菌空气（氧气）；
制作果酒时关闭充气口
6. 设计果酒果醋发酵装置
四、果酒和果醋的制作
√
挑选葡萄
冲洗
榨汁
葡萄汁装瓶
酒精发酵
先冲洗后去枝梗
先去枝梗后冲洗
控制条件
反复冲洗可能会洗去葡萄皮上的酵母菌
留大约1/3的空间
温度：18~25℃
时间：10~12天
气体：先通气，后密闭
四、果酒和果醋的制作
项目 果酒制作 果醋制作
发酵菌种
菌种来源
菌种代谢类型
菌种细胞类型
发酵原理 在有氧条件下： 在无氧条件下： 氧气、糖源都充足时：
缺少糖源时：
发酵 条件 温度
时间
氧气
酵母菌
醋酸菌
主要是附着在葡萄皮上的野生型酵母菌
异养兼性厌氧型
异养需氧型
真核细胞
原核细胞
C6H12O6+6H2O+6O2 6CO2+12H2O+能量
酶
C6H12O6 2C2H5OH+2CO2+能量
酶
空气中的野生型醋酸菌
C6H12O6+2O2 2CH3COOH+2H2O+2CO2+能量
酶
C2H5OH+O2 CH3COOH+H2O+能量
酶
28℃
30-35℃
10-12d
7-8d
初期需氧，后期不需氧
需要氧气
总结：果酒制作与果醋制作的比较
5．据《史记·大宛列传》记载，张骞奉汉武帝之命出使西域，看到“宛左右以蒲陶(即葡萄)为酒，富人藏酒至万馀石。久者数十岁不败”。下列关于家庭制作果酒、果醋的叙述，正确的是(　　)
A．果酒制作过程中为防止杂菌污染，不能拧松发酵瓶盖
B．若最终获得的果酒偏酸，可能的原因是醋酸菌无氧发酵产生了乙酸
C．果酒制成后只需要将装置移至温度略高的环境中就能酿成果醋
D．“久者数十岁不败”的原因是酸性、缺氧及含酒精的酒液中，微生物的繁殖受到抑制
考点题型突破
D
微生物的基本培养技术
培养基的配置
无菌技术
微生物的纯培养
微生物（教材P9）
种类
经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的细菌，在经过发酵就可以制成酸奶，由于制作工艺并不复杂，一些人会在家里自制酸奶，自制酸奶虽然方便，但是食用自制酸奶导致肠胃不适的事件屡见不鲜。
从社会中来
无菌技术
微生物的纯培养
培养基的配制
①为人们需要的微生物提供合适的营养和环境条件；
②确保其他微生物无法混入，并将需要的微生物分离出来。
在制作过程中有杂菌混入
②容器和原料灭菌
①接种纯的菌种
思考1：失败的原因是什么？
思考2：怎样才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物中呢？
实验室培养微生物的要求
【自主探究】请结合教材P9-10面，思考这些问题的答案。
1.培养基的用途有哪些？
2.培养基的必备营养成分有哪些？
3.配制培养基时，如何满足不同微生物的特殊需求？举例说明。
4.培养基的种类有哪些？
一、培养基的配制
一、培养基的配制
1、培养基概念：
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
3、培养基类型：
固体
培养基
液体
培养基
有无凝固剂
例：琼脂
分离、
计数、
鉴定等
扩大培养、
工业生产
2、培养基作用：
用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
长有酵母菌菌落
盛有液体培养基
（ ①提供微生物繁殖所需各种营养， ②异养微生物的能源）
划分标准 培养基种类 特点 用途
物理性质
化学成分
用途
不加凝固剂
加凝固剂，如琼脂
工业生产
观察微生物的运动、
分类鉴定
微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种
含化学成分不明确的天然物质
工业生产
培养基成分明确
分类、鉴定
在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长
培养、分离出特定微生物
在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物
鉴别不同种类微生物
选择培养基
液体培养基
半固体培养基
固体培养基
天然培养基
合成培养基
鉴别培养基
一、培养基的配制
3、培养基类型：
4、营养成分:
（1）基本成分：
碳源、氮源、无机盐、水
①碳源：
无机碳源：
CO2、CO32-、HCO3-
有机碳源：
葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等
自养微生物
异养微生物
②氮源：
无机氮源：
NH4＋、NO3-、NH3等
有机氮源：
牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等
注：含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源
③无机盐：
Ca、K 、Mg为大量元素
Zn、Cu、Mn、Co、Mo等微量元素
一、培养基的配制
功能： ①提供无机营养
②调剂PH
③维持渗透压
功能： ①良好的溶剂
②维持生物大分子结构的稳定
又叫生长因子：微生物正常生长代谢所必需的，且不能用碳源、氮源自行合成的有机物，如维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶、碱基等。
举例说明：
培养乳酸菌需要添加维生素
培养霉菌时需将PH调至酸性，培养细菌时将PH调至中性或微碱性
培养厌氧微生物时需要提供无氧条件
目的要明确；
营养要协调；
pH要 适宜。
培养基的配制原则
一、培养基的配制
（2）还需满足微生物对 pH、特殊营养物质、氧气的需求
4、营养成分:
编号 成分 含量
① 粉状硫 10g
② （NH4）2SO4 0.4g
③ K2HPO4 4.0g
④ MgSO4 9.25g
⑤ FeSO4 0.5g
⑥ CaCl2 0.5g
⑦ H2O 100ml
（1）表中培养基可培养的微生物类型是 。
（2）若不慎将过量NaCl加入培养基中。如不想浪费此培养基，可再加入 。
自养型微生物
含碳有机物
下表是某微生物培养基成分，请据此回答：
（3）若除去成分②，加入（CH2O），该培养基可用于培养 。
固氮微生物
练习
1．关于培养基的配制说法不正确的是(　　)
A．在配制培养乳酸杆菌的培养基时，需加入维生素
B．微生物的适应性强，配制培养基时可以不考虑pH
C．虽然各种培养基的具体配方不同，但一般都含有碳源、氮源、水和无机盐
D．配制培养基时要注意各种养分的浓度和比例
B
考点题型突破
【自主探究】请结合教材P10-11面，思考下列问题：
1.获得纯净培养物的关键是什么？
2.消毒和灭菌的区别是什么？
3.为了防止杂菌污染，具体措施有哪些？
4.如何针对不同的作用对象选择合适的消毒/灭菌方法？
二、无菌技术（教材P10-11）
1. 获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染
二、无菌技术
比较项目 理化性质的作用强度 能否杀死所有微生物 能否杀死芽孢和孢子
消毒
灭菌
较为温和
比较强烈
能
能
否
否
2.消毒和灭菌的区别
芽孢：某些细菌生长到一定阶段，在细胞内形成的休眠体
孢子：某些生物的繁殖体
芽孢和孢子具有高度的耐热性，可抗化学药物和抗辐射
3.处理对象：在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行灭菌；操作者的双手需要进行清洗和消毒
生物消毒法
指利用微生物或其代谢物除去环境中的部分微生物的方法。
例如，有的微生物能够寄生于多种细菌体内，使细菌裂解，因此可以用它们来净化污水、污泥。
①煮沸消毒法： 100℃煮沸5-6min。
②巴氏消毒法： 62-65℃下煮30min 或 80-90℃下煮30s-1min。
③化学药剂消毒法：用70%酒精擦拭双手；氯气消毒水源。
④紫外线消毒法：用紫外灯照射接种室、接种箱、超净工作台。
常用的消毒方法：
二、无菌技术
①灼烧灭菌
2
3
接种环的灼烧灭菌
1
接种工具
涂布器
接种环
接种针
其他金属用具
直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧
接种过程中
试管口
瓶口
通过酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧
迅速彻底灭菌
二、无菌技术
常用的灭菌方法
二、无菌技术
常用的灭菌方法
②湿热灭菌
高压蒸汽灭菌锅
加热
进行灭菌（培养基等）
效果最好
高压蒸汽
100kPa
121℃
15~30min
沸水
流通蒸汽
高压蒸汽
原理：高温蒸汽破坏蛋白质、核酸等结构使其变性
优点：操作简便，效果可靠，可以杀灭所有的生物。基本保持培养基的营养成分不被破坏。
注意：
①使用前必须先将锅内冷空气排尽，才能达到预设的压力和温度。
②灭菌完成时，待锅内压力自然降到０时，再打开气阀。
二、无菌技术
常用的灭菌方法
③干热灭菌
干热灭菌箱
灭菌物品
干热灭菌箱
耐高温和需要
保持干燥的物品
玻璃器皿
金属用具
吸管
培养皿
160~170℃
2~3h
灭菌
原理：使微生物细胞膜破坏、蛋白质变性和原生质干燥等
总结：常用的灭菌、消毒方法比较（教材P11）
类型 适用范围 操作方法
消毒
灭菌
煮沸消毒法
日常生活
100 ℃煮沸5～6 min
巴氏消毒法
不耐高温的液体
62～65 ℃煮30 min或80-90 ℃煮30s-1 min
化学药剂
生物活体、水源等
擦拭等,如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源
紫外线
紫外线照射30 min
灼烧灭菌
接种的金属工具、接种时用的试管口或瓶口等
直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧
干热灭菌
耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等
物品放入干热灭菌箱,160～170 ℃加热2～3h
湿热灭菌
培养基等,生产和实验室常用
高压蒸汽灭菌锅内,100 kPa,温度121 ℃,15～30 min
接种室、接种箱，超净工作台
较为温和理化方法，杀死部分微生物
强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子）
3．在科研和生产上，研究和应用微生物的前提是防止杂菌污染，获得纯净的微生物培养物，无菌操作是防止杂菌污染的关键，下列相关叙述，错误的是(　　)
A．煮沸消毒可以杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
B．巴氏消毒法消毒牛奶，基本不破坏其中的营养物质
C．耐高温的、需要保持干燥的物品，可用干热灭菌法进行灭菌
D．紫外线消毒前，适量喷洒消毒液可以加强消毒效果
考点题型突破
A
三、微生物的纯培养(教材P11)
1、相关概念
培养物：
纯培养物：
纯培养：
微生物学中，接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体
由单一个体繁殖所获得的微生物群体
获得纯培养物的过程。
2、微生物的纯培养
配制培养基
灭菌
接种
分离
培养
计算 称量 溶化 灭菌 倒平板
(1)常用方法：平板划线法和稀释涂布平板法
(2)过程：
探究·实践：酵母菌的纯培养（教材P12）
方法步骤
①配制培养基
称取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖、15-20g琼脂，用蒸馏水定容至1000ml.
②灭菌
将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15-30min.将5-8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160-170℃灭菌2h.
包器材
1、制备培养基
探究·实践：酵母菌的纯培养
方法步骤
倒平板的具体操作：
③倒平板
——待培养基冷却至50°C左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。
灭菌后的培养基在无菌操作台上倒入4个培养皿中，倒后立即置于水平位置上，轻轻晃动，使培养基铺满平皿底部，待凝，使之形成平面。
倒平板注意事项：
①温度：50℃左右
②操作：在酒精灯火焰附近
③冷凝后平板倒置
1、制备培养基
1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？
可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉温度下降到刚刚不烫手即可。
2.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
最好不要用这个平板培养微生物。防止空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
将所倒平板放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底。
4.怎么确定所倒平板未被杂菌污染或灭菌彻底？
3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
将平板倒置，既可以避免培养基中的水分过快蒸发又可防止皿盖上的冷凝水落入培养基，造成污染。
探究·实践：酵母菌的纯培养
探究·实践：酵母菌的纯培养
方法步骤
2、接种和分离酵母菌
通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经过数次划线后培养可以分离得到单菌落。
①原理：
单个细胞
微生物群
单个菌落
连续划线
分散或稀释
生长繁殖
探究·实践：酵母菌的纯培养
菌落
单个或少数同种菌体在固体培养基上大量繁殖，形成肉眼可见的子细胞群体。
定义：
特征：
大小、形状、颜色、光泽度、透明度、隆起程度等。
功能：
不同菌落所具有的特征不同，菌是鉴定菌种的重要依据。
探究·实践：酵母菌的纯培养
方法步骤
②“平板划线”实验操作
2、接种和分离酵母菌
①将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环的金属丝烧红。
②在火焰旁冷却接种环，并拔出装有酵母菌培养液的试管的棉塞
③将试管口通过火焰
④将已冷却的接种环伸入菌液中，蘸取一环菌液
⑤将试管口通过火焰，并塞上棉塞
⑥在火焰附近将皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基
⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。注意不要将最后一次的划线与第一次划线相连。
探究·实践：酵母菌的纯培养
方法步骤
分区划线法
②“平板划线”实验操作
①接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次
②划线首尾不能相接
③每次划线前接种环进行灭菌
④划线后,培养皿倒置培养
平板划线法注意事项:
2、接种和分离酵母菌
探究·实践：酵母菌的纯培养
1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，
仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
灼烧时期 目的
取菌种前
每次划线前
接种结束后
杀死接种环上原有微生物。
杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端
杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
2.在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线的原因？
以免接种环温度太高，杀死菌种。
3.在作第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线的原因？
使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，以便获得单个菌落。
探究·实践：酵母菌的纯培养
4.为什么划线时要注意不能划破培养基？
①一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；
②存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落
探究·实践：酵母菌的纯培养
方法步骤
3、培养酵母菌
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右（培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异）的恒温培养箱中培养24-48h
避免杂菌污染
2.为什么倒平板和接种整个过程要在酒精灯火焰旁进行？
1.未接种的培养基直接培养起什么作用？
做空白对照，若培养后培养基表面无菌落，则说明培养基没有污染。
思考：
探究·实践：酵母菌的纯培养
方法步骤
4、结果分析与评价
1.培养基的制作是否合格？
如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。
2.接种操作是否符合无菌要求？
如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合酵母菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。
3.是否进行了及时细致的观察与记录？
培养12 h与24 h后的酵母菌菌落的大小会有明显不同。
（培养时间越长，菌落越大、颜色越深）
6．(2021·辽宁丹东开学考试)如图为实验室培养和纯化酵母菌过程中的部分操作步骤，下列说法不正确的是(　　)
A．①步骤使用的培养基是已经调节过pH并灭菌的培养基
B．①②③步骤操作时需要在酒精灯火焰旁进行
C．③到④的过程中，接种环共灼烧了5次
D．④步骤操作时，不能将第1区和第5区的划线相连
考点题型突破
C
所谓“酵素”，就是“酶”的另一种说法。“酵素”制作就是利用微生物进行无氧呼吸的原理，进行像制作泡菜一样的发酵。这样制作的“酵素”中可能有糖类(包括一些简单的糖和膳食纤维等)、蛋白质(包括多种酶)、有机酸等成分，不存在它独有的、特殊的营养物质，其中甚至可能含有微生物发酵产生的有毒物质,食用后可能会危害人体健康。因此,“吃水果‘酵素’可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力”的论点值得怀疑。
评估“水果酵素”的功效是否真实？
思维训练：教材P14
微生物的选择培养和计数
选择培养基
微生物的选择培养
微生物的数量测定
自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。
稀释涂布平板法呈现的杂菌群
该怎么办呢？
选择培养基应运而生。
从社会中来
1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌，进而从这种菌中提取出耐高温的DNA聚合酶。
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外扩增DNA片段的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。
寻找耐高温的DNA聚合酶
筛选原因：水生栖热菌能在70-80℃高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
一、选择培养基
实例
根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
筛选原则
耐寒微生物
石油分解菌
被石油污染的土壤
冰川冻土层
实验室筛选微生物原理：
人为提供_____________________的条件（包括_______、_______和_______等），同时_________________________________
有利于目的菌生长
抑制或阻止其他微生物的生长
营养
温度
pH
一、选择培养基
允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
1.概念：
2.方法：
分离得到酵母菌、霉菌等
分离固氮菌
分离自养型微生物
不加含碳有机物的无碳培养基
不加氮源的无氮培养基
加入青霉素的培养基
（1）在培养基中加入某种化学物质。
分离得到金黄色葡萄球菌
加入高浓度食盐的培养基
（2）改变培养基中的营养成分。
（3）改变微生物的培养条件。
耐高温微生物
高温环境下培养
厌氧型微生物
兼性厌氧型
无氧环境下培养
一、选择培养基
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可以作为细菌生长的氮源。
讨论：
1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
在选择培养基中，以尿素作为唯一氮源，
只有能合成脲酶的细菌才能生长发育繁殖。
除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同。
思考·讨论：选择培养基配方的设计
进一步思考：
怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？
应该设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数菌多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可以作为细菌生长的氮源。
思考·讨论：选择培养基配方的设计
据培养基的配方表，回答下列问题：
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
琼脂 20.0g
蒸馏水 定容到1000ml
KH2PO4 1.4g
NaH2PO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素CO(NH2)2 1.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 定容到1000ml
培养基一
培养基二
1.从物理性质看，两种培养基属于哪类？依据是什么？培养基的主要用途是什么？
固体培养基的主要用途：分离、鉴定、计数。
2.从用途上来讲，哪个属于选择培养基？将得到何种细菌？
可获得能分解尿素的微生物。
3.两种培养基中共有哪些成分？
碳源、氮源、水、无机盐
培养基二的碳源为_________，氮源为_________。
葡萄糖
尿素
都属于固体培养基。
依据是添加了凝固剂——琼脂，且比例为1.5%-2%。
培养基二
练习
项目 选择培养基 鉴别培养基
原理
用途
举例
图示
尿素分解菌
大肠杆菌
二、比较选择培养基与鉴别培养基
加入不影响甚至促进目标微生物生长，而抑制或阻止其他种类微生物生长的化学物质
加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应
培养、分离出目标微生物
鉴别目标微生物
培养酵母菌和霉菌时，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌的生长；利用以尿素为唯一氮源的培养基来培养可分解尿素的细菌
可用伊红美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否含有大肠杆菌(若有，则菌落呈黑紫色，且带有金属光泽)
7．选择培养基是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或一些物理、化学抗性而设计的培养基。利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。为选择酵母菌和硝化细菌，应选用的培养基分别为(　　)
A．伊红美蓝培养基、含青霉素的培养基
B．含青霉素的培养基、含氨的无机培养基
C．含氨的无机培养基、含青霉素的培养基
D．含青霉素的培养基、伊红美蓝培养基
考点题型突破
B
二、微生物的选择培养
1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？
分离：获得分解尿素的细菌的纯培养物
计数：测定分解尿素的细菌的数量
稀释涂布平板法——将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养。
注意：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
稀释涂布平板法
系列梯度稀释
涂布平板
稀释涂布平板法的操作过程：
二、微生物的选择培养
1.梯度稀释
①铲取土样，将样品装入纸袋中
1ⅹ10
1ⅹ107
1ⅹ106
1ⅹ103
1ⅹ102
1ⅹ104
1mL
1mL
1mL
1mL
1mL
1ⅹ105
注意：取土样用的小铁铲和盛土样的纸袋在使用前都要灭菌
②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。
③取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
90mL
无菌水
9mL无菌水
1mL
微量
移液器
④取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
⑤将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
⑥将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
⑦用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，培养。
稀释涂布平板法的操作过程：
二、微生物的选择培养
2.涂布平板
恒温培养箱
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
空白对照
细菌一般选用104、105、106 稀释倍数的菌液进行涂布培养。
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30-37℃的恒温培养箱中，培养1-2d。
菌落培养
二、微生物的选择培养
[特别提醒]
1.10g土样加入盛有90mL无菌水中后，已稀释10倍，再计算时，不要忽略；
2.由于使用的是选择培养基，所以一般情况下，获得的单菌落即目的菌，但因为有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖，所以还需要进一步验证；
3.过程中所有操作都应在酒精灯火焰旁进行；
4.将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
二、微生物的选择培养
②显微镜直接计数法
血细胞/细菌计数板
——间接计数法
——直接计数法
三、微生物的数量测定
①稀释涂布平板法
（1）原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
选择30-300个菌落的平板进行计数；
每个稀释度至少取3个平板取其平均值；
统计的菌落往往比活菌的实际数目低；
统计的结果一般用菌落数而不是活菌数来表示；
恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。
（2）计数原则:
因为当两个或多个细胞连在一起时，繁殖后形成的还是一个菌落
1.间接计数法 — 稀释涂布平板法
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
空白对照
三、微生物的数量测定
M代表稀释倍数；
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)
例1：某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) ( )
A. 2.34×108 B. 2.34×109 C. 234 D. 23.4
B
（3）计算公式:
1.间接计数法 — 稀释涂布平板法
三、微生物的数量测定
每g样品中的菌落数＝(C÷V)×M
不能区分死菌与活菌；
（2）缺点：
（1）原理:
1.直接计数法 — 显微镜直接计数法
三、微生物的数量测定
利用细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。
统计的数目往往比活菌的实际数目高
血细胞计数板：
细菌计数板：
常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数
对细菌等较小的细胞进行观察和计数；
个体小的细菌在显微镜下难以观察；
1.实验目的：
（1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌
（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌
2.实验原理：
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000ml
探究·实践：土壤中微生物分解尿素的细菌的分离和计数
KH2PO4和Na2HPO4的作用是：
①提供无机盐；
②调节pH。
CO(NH2)2+H2O
脲酶
2NH3+CO2
（1）土壤取样
（2）配制培养基
取样地点要求：酸碱度接近中性的潮湿土壤
取样过程：铲去表土（一般3cm左右）
注意事项：铁铲和取样袋在使用前都要灭菌；事毕洗手。
选择培养基
完全培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）
探究·实践：土壤中微生物分解尿素的细菌的分离和计数
作为对照，来判断选择培养基是否具有选择作用
以尿素为唯一氮源
3.操作步骤：
选择培养基
（平行重复）
牛肉膏蛋白胨培养基(作为对照)
（3）样品的稀释与涂布平板
探究·实践：土壤中微生物分解尿素的细菌的分离和计数
3.操作步骤：
①培养条件：
②观察：
（4）微生物的培养与观察
3.操作步骤：
探究·实践：土壤中微生物分解尿素的细菌的分离和计数
不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。
细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d
每隔24h统计一次菌落数目，选取数目稳定时的记录作为结果。
防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目
③一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。
操作提示
1.将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
2.要按照前面学习过的无菌操作的方法，进行规范操作。取土样时用的铁铲和取样纸袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
3.本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。
4.本实验耗时较长，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。
探究·实践：土壤中微生物分解尿素的细菌的分离和计数
内　容 现　　象 结　论
有无污染的判断　 对照的培养基中无菌落生长
培养物中菌落数偏高
菌落形态多样,菌落数偏高
选择培养基的筛选作用 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目
样品的稀释操作 得到2个或2个以上菌落数目为30~300的平板
重复组的结果 若选取同一种土样,统计结果应接近
探究·实践：土壤中微生物分解尿素的细菌的分离和计数
4.结果分析及评价
未被杂菌污染
培养物中混入其他氮源
被杂菌污染
选择培养基有筛选作用
操作成功
1.结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。
2.你是否获得了某一稀释度下菌落数为30-300的平板？在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近？
3.你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学统计的结果接近吗？如果差异很大,可能是什么原因引起的？
如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。如果接种后的完全培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。
如果得到了两个或多个菌落数为30～300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。
如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。
4.结果评价及分析：
探究·实践：土壤中微生物分解尿素的细菌的分离和计数
拓展：分解尿素细菌的进一步鉴定
1.原理
2.方法
*液体培养基可以直接看液体的变色情况；
*固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带；
*红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强
细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌；
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红
课堂小结
微生物的数量测定
选择培养基的作用
微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法
微
生
物
的
选
择
培
养
和
计
数
选择培养基
微生物的选择培养
科学实例
筛选原则
选择培养基的概念及举例
稀释涂布平板法的操作过程
间接计数法 — 稀释涂布平板法
直接计数 —计数板计数法
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
培养基的制备
实验设计
（1）土壤取样
（2）样品的稀释
（3）稀释涂布平板法接种
（4）微生物的培养与观察
结果分析评价
平板划线法 稀释涂布平板法
纯化原理
接种工具
单菌落的获得
用途
接种效果图
相同点
通过连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散
将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释程度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养，以得到单菌落
接种环
涂布器
从最后划线的区域挑取
稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落
分离纯化菌种，获得单菌落
①分离纯化菌种，获得单菌落
②用于计数
①都能分离纯化菌种
②都是在固体培养基上进行的
总结：比较平板划线法和稀释涂布平板法
2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中 40%-60% 能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用精杆等生产酒精，用纤维索酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合
物；而当纤维索被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌
为中心的透明圈(如下图所示)。请回答下列问题。
（1）现在要从土壤中分离纤堆素分解菌,请你给出详细的实验方案。
（2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？
（3）有同学说,可以把滤纸埋在土壤中,经过一段时间后,再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。
用“纤维素为唯一碳源”的选择培养基进行培养，并在培养基加入刚果红进行鉴别。
纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等
这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境,腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。
拓展应用：教材P20
菌落数 细菌 霉菌 放线菌
实验室
无菌空气
活菌计数技术广泛应用于食品卫生、水源污染度的检验和土壤含菌量的测定等方面。如果你感兴趣，可以从下列项目中选做一个，并走访相关部门或企业，了解他们是如何进行检测的。
1.空气中微生物总数的检测
沉淀法（1）将肉膏琼脂培养基、麦芽汁培养基、高氏培养基融化后，各倒4个平板。（2）分別取两个上述三种培养基平板，在空气中暴露5min，另外2个平板用于检查无菌空气管道排气口的无菌情况。（3）将上述平板置28℃培养48h后计算其菌落数，并观察菌落形态、颜色，将结果列表
2.水中细菌总数的检测
(1)取样；(2)样品稀释；(3)微生物培养与观察；(4)菌落计数；(5)实验报告。
3.牛奶中细菌的分离与计数
(1)取牛奶样液；(2)稀释（根据牛奶中菌长得多少而定）；(3)涂布平板；
(4)菌落计数；(5)实验报告。
将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红-美蓝 培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记算得出水样中大肠杆菌的数量。
到社会中去
8．解脂菌能利用分泌的脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸并吸收利用。脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色。将不能直接吸收脂肪的甲、乙两种菌分别等量接种在醇溶青琼脂平板上培养。甲菌菌落周围呈现深蓝色，乙菌菌落周围不变色。下列说法错误的是(　　)
A．甲菌属于解脂菌
B．实验中所用培养基以脂肪为唯一碳源
C．可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比
D．该平板可用来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力
考点题型突破
B
发酵工程及其应用
发酵工程的基本环节
发酵工程的应用
青霉素是世界上第一个应用于临床的抗生素。早期科学家只能从青霉菌中提取少量，价格贵如金。
随着高产菌种的选育、发酵技术的发展等，青霉素步入了产业化生产的道路。如今，一瓶规格160万单位青霉素注射剂的价格只要1元左右。
在工业上，青霉素是怎样生产的？
从社会中来：教材P22
一、发酵工程的基本环节
随着人们对发酵原理的认识，微生物纯培养技术的建立，以及密闭式发酵罐的设计成功，人们能够在严格控制的环境条件下，大规模生产发酵产品，发酵工程逐步形成。
一般包括：菌种的选育，
扩大培养，
培养基的配制、灭菌，
接种、发酵，
产品的分离、提纯等方面。
1.选育菌种
一、发酵工程的基本环节
（1）目的：
获得性状优良的菌种
（2）菌种来源：
从自然界中筛选、诱变育种或基因工程育种。
（3）实例：
筛选产酸量高的黑曲霉用来生产柠檬酸；
使用基因工程改造的啤酒酵母，加速发酵、缩短生产周期。
思考讨论：某镇特产一种美酒 ，以下是对该镇环境的描述：
四面环山，地势低洼，气候炎热，具有独特的微生物种群，因为与外界的空气对流循环较缓慢，所以微生物种群较稳定。这对你理解发酵工程中菌种选育的重要性有什么启示？
优良的菌种不仅具有健壮，不易退化，其发酵产品的产量高、质量稳定等优点，它往往还会赋予发酵产品独特的风味，因此菌种选育环节在很大程度上决定了生物发酵产物的成败。
2.扩大培养
一、发酵工程的基本环节
目的：
原因：
获得更多的菌种
工业发酵罐的体积一般为几十到几百立方米，接入的菌种总体积需要几立方米到几十立方米。所以，在发酵之前还需要对菌种进行扩大培养。
3.配制培养基
在菌种确定之后，要选择原料制备培养基。
在生产实践中，培养基的配方要经过反复试验才能确定。
一、发酵工程的基本环节
4.灭菌
（1）灭菌原因：
发酵工程中所用的菌种大多是单一菌种，一旦有杂菌污染，可能导致产量大大降低。
（2）培养基和发酵设备都必须经过严格的灭菌。
例如，在青霉素生产过程中如果污染了杂菌，某些杂菌会分泌青霉素酶将青霉素分解掉。
5.接种
将扩大培养后的菌种投放到发酵罐中。
一、发酵工程的基本环节
6.发酵罐内发酵
发酵罐
电动机D1
排气管C3
pH计B3
冷却水排出口C2
冷却夹层
发酵液
搅拌叶轮D2
生物传感器装置B4
空气入口A4
放料管A2
A3 阀门
A1培养物或营养物质的加入口
B1观察孔
B2取样管
B5温度传感器和控制装置
C1冷却水进入口
装置编号 主要用途
A1-A3
A4
B1-B5
C1、C2
C3
D1、D2
控制培养物以一定速度进入、流出发酵罐，实现连续培养
控制溶解氧
通过肉眼观察、仪器检测等监控发酵条件以及发酵过程，B2处抽取样品进一步检测。
通过控制冷水流速调节罐温
调节罐压
电机带动叶轮转动进行搅拌，使微生物与发酵液混合均匀，加快氧气溶解以及散热。
中心环节
一、发酵工程的基本环节
6.发酵罐内发酵
要求∶
①随时检测;
随时检测微生物数量和产物浓度
②及时添加营养、严格控制发酵条件；
严格控制温度、pH、溶解氧……条件
及时添加碳源、氮源、水、无机盐！
一、发酵工程的基本环节
6.发酵罐内发酵
思考：为什么要严格控制发酵条件的原因？举例说明。
①环境条件会影响微生物的生长繁殖和微生物代谢物的形成；
②有利于使发酵全过程处于最佳状态。
例如谷氨酸发酵：
①在中性和弱碱性条件下会积累谷氨酸;
②在酸性条件下则容易生成谷氨酰胺和N-乙酰谷胺酰胺；
一、发酵工程的基本环节
（7）分离、提纯产物
（8）获得产品
如果发酵产品是微生物细胞本身，可在发酵结束之后，采用过滤、沉淀等方法将菌体分离和干燥，即可得到产品。
如果产品是代谢物，可根据产物的性质采取适当的提取、分离和纯化措施来获得产品。
啤酒
味精
一、发酵工程的基本环节
选育菌种
扩大培养
配制培养基
灭菌
接种
发酵罐内发酵
分离提纯产物
获得产品
①从自然界筛选
②通过诱变育种或基因工程育种获得
工业发酵罐接种量大，发酵之前需要对菌种进行扩大培养.
确定菌种后，选择原料制备培养基，培养基配方常需要反复实验才能确定。
发酵工程中所用的菌种大多是单一菌种。培养基和发酵设备都必须严格灭菌
这是发酵工程的中心环节。
①了解发酵进程：随时检测培养液中的微生物数量、产物浓度等。
②及时添加必需的营养组分。
③严格控制温度、pH和溶解氧等发酵条件。
现代发酵工程使用的发酵罐均有计算机控制系统，能对发酵过程进行检测和控制；还可以进行反馈控制，使发酵全过程处于最佳状态。
①产品是微生物细胞：采用过滤、沉淀等方法将菌体分离和干燥即可
②产品是代谢物：根据产物的性质采取释放的提取、分离和纯化措施获得产品
思考·讨论：发酵工程的基本环节分析
1、微生物菌种资源丰富，选择发酵工程用的菌种时需要考虑哪些因素？
需要考虑的因素包括:在低成本的培养基上能迅速生长繁殖;
生产所需代谢物的产量高;
发酵条件容易控制;菌种不易变异、退化等。
2、怎样对发酵条件进行调控以满足微生物的生长需要？
（1）要对温度、pH、溶解氧等发酵条件进行严格控制，使其最适合微生物的生长繁殖
（2）及时添加必要的营养组分。
（3）对培养基和发酵设备进行严格的灭菌。
思考·讨论：发酵工程的基本环节分析
3、在产物分离和提纯方面，发酵工程与传统发酵技术相比有哪些改进之处？
传统发酵技术获得的产物一般不是单一的组分， 而是成分复杂的混合物，再对产物进行分离和提纯处理，或者仅采用简单的沉淀、过滤等方法来分离和提纯产物。
4、进行发酵生产时，排出的气体和废弃培养液能直接排放到外界环境中吗？为什么？
不能。因为在进行发酵生产时，微生物及其代谢物中都可能含有危害环境的物质。为了减少或避免污染物的产生和排放，实现清洁生产，应该对排出的气体和废弃培养液进行二次清洁或灭菌处理
在发酵工程中使用的分离和提纯产物的方法较多。在产物的初分离阶段，常采用沉淀、萃取、膜分离、吸附和离子交换等方法;在进一步纯化阶段， 会采用液相层析法、结晶法等方法。发酵工程产物无论是代谢物还是菌体本身，都需要进行质量检查，合格后才能成为正式产品。
下列关于发酵过程的说法,错误的是(　　 )
A.培养基灭菌是发酵生产中的一个很重要的环节
B.随时监测影响发酵过程的各种环境条件,并予以控制,才能保证发酵的正常进行
C.在发酵过程中,要严格控制温度、pH、溶解氧、通气量与转速等发酵条件,否则会影响菌种代谢物的形成
D.发酵产品的分离方法是共同的
练习
D
一、发酵工程的基本环节
1．发酵工程的特点
2．发酵工程的应用
（1）生产条件温和 （2）原料来源丰富且价格低廉
（3）产物专一 （4）废弃物对环境的污染小以及容易处理
（1）在食品工业上的应用 （2）在医药工业上的应用
（3）在农牧业上的应用 （4）在其他方面的应用
二、发酵工程的应用
大豆中蛋白
小分子肽和氨基酸
酱油
黑曲霉
淋洗、调制
各种谷物、水果
酿酒酵母
各种酒类
1.在食品工业上的应用
（1）生产传统的发酵产品
利用黑曲霉发酵生产柠檬酸
利用谷氨酸棒状杆菌发酵生产谷氨酸，经处理制成味精。
（2）生产各种各样的食品添加剂
表1-2 常用的几种食品添加剂
添加剂类型 举例
酸度调节剂 L-苹果酸、柠檬酸、乳酸
增味剂 5‵-肌苷酸二钠、谷氨酸钠
着色剂 β-胡萝卜素、红曲黄色素
增稠剂 黄原胶、β-环状糊精、结冷胶
防腐剂 乳酸链球菌素、溶菌酶
（3）生产酶制剂
思考·讨论：啤酒的工业化生产流程
思考·讨论：啤酒的工业化生产流程
过程概述：
1.啤酒的发酵过程分为_________和_________两个阶段；
2.主发酵阶段完成__________________________________________________；
3.后发酵的条件____________________________________；
4.焙烤的目的：_______________________________________；
5.蒸煮的目的：______________________________________________________；
主发酵
后发酵
酵母菌的繁殖、大部分糖的分解和代谢物的生成
低温、密闭的环境下储存一段时间
加热杀死种子胚但不使淀粉酶失活
产生风味组分，终止酶的进一步作用，并对糖浆灭菌
发酵的温度和发酵的时间随啤酒品种和口味要求不同有所差异。
思考·讨论：啤酒的工业化生产流程
1.发芽
大麦种子发芽，
释放淀粉酶
2.焙烤
加热杀死胚，
淀粉酶不失活
3.碾磨
将干燥的麦芽
碾磨成麦芽粉
4.糖化
淀粉分解
形成糖浆
6.发酵
酵母菌将糖转化
为酒精和CO2
5.蒸煮
产生风味组分，终止酶的进
一步作用，并对糖浆灭菌
7.消毒
杀死啤酒中大多数微生
物，延长它的保存期。
8.终止
过滤、调节、分装啤酒进行销售
1.酵母菌酒精发酵过程中为什么要“先通气后密封”？
2.啤酒生产中，发酵是重要环节，发酵后期，如果密封不严，会使啤酒变酸，你知道这是发生了什么变化吗？
“通气”的目的是使酵母菌进行有氧呼吸大量繁殖；
“密封”的目的是使酵母菌进行酒精发酵产生酒精。
酒精在醋酸菌的作用下被氧化产生乙醛，最后变为醋酸。
思考·讨论：啤酒的工业化生产流程
思考·讨论：啤酒的工业化生产流程
1. 与传统的手工发酵相比，在下面啤酒的发酵生产过程中，哪些工程手段使啤酒的产量和质量明显提高？
菌种的选育、对原材料的处理、发酵过程的控制、产品的消毒等，都有助于提高啤酒的产量和品质。
2. 现在市面上流行一种“精酿”啤酒，它的制作工艺与普通啤酒有所不同，如一般不添加食品添加剂、不进行过滤和消毒处理等。有人认为饮用“精酿”啤酒比饮用“工业”啤酒更健康，你怎么看待这个问题？“精酿” 啤酒是小规模酿造产品，发酵时间长、产量低和价格高，却依然有着市场需求，我们如何辩证地看待大规模生产与小规模制作？
应该辩证地看待这一产品。一方面，这类产品具有多样化的特点，能够满足一些人对独特口感的需求，或者满足一些人的时尚追求。另一方面，这类产品是手工作坊式生产的，存在啤酒品质不稳定、价格昂贵的问题。
二、发酵工程的应用
2.医药工业上的应用
（1）采用基因工程的方法，将植物或动物的基因转移到微生物中，获得具有某种药物生产能力的微生物
1.利用经过基因改造的微生物生产生长激素释放抑制激素；
2.利用基因工程改造的微生物生产疫苗。将病原体的某个或某几个抗原基因转入适当的微生物细胞，获得的表达产物就可以作为疫苗使用。如乙肝疫苗的生产。
（2）直接对菌种进行改造，再通过发酵技术大量生产所需要的产品
实例：青霉素高产菌株的培育
3.利用微生物生产过去只能从植物中分离提取的紫杉醇、青蒿素前体等化合物；
二、发酵工程的应用
3.在农牧业上的应用
（1）生产微生物肥料
微生物肥料利用了微生物在代谢过程中产生的有机酸、生物活性物质等来增进土壤肥力，改良土壤结构，促进植株生长。
种类：利用根瘤菌和固氮菌生产的根瘤菌肥、固氮菌肥。
有的微生物肥料可以抑制土壤中病原微生物的生长，从而减少病害的发生。
二、发酵工程的应用
3.在农牧业上的应用
（2）生产微生物农药
①微生物农药的作用机理：
②实例：
③防治类型：
生物防治
微生物或代谢产物 防治病虫害种类
苏云金杆菌 80多种农林害虫
白僵菌 玉米螟、松毛虫
井冈霉素 一种放线菌产生的抗生素 水稻枯纹病
利用微生物或其代谢物来防治病虫害
二、发酵工程的应用
3.在农牧业上的应用
（3）生产微生物饲料
①原理：微生物含有丰富的蛋白质，且繁殖速度快
②实例——单细胞蛋白
单细胞蛋白=微生物菌体
单细胞蛋白成分：不仅含有丰富的蛋白质，还含有糖类、脂质和维生素等物质
单细胞蛋白应用：食品添加剂、微生物饲料；
③实例——乳酸菌
在青贮饲料中添加乳酸菌，可以提高饲料的品质，使饲料保鲜，动物食用后还能提高免疫力。
二、发酵工程的应用
4.在其他方面的应用
（2）将极端微生物应用于生产实践
①极端微生物：自然界中还存在着一定数量的极端微生物，它们能在极端恶劣的环境（高温、高压、高盐和低温等环境）中正常生活。
②举例：
嗜热菌、嗜盐菌可以用来生产洗涤剂；
嗜低温菌有助于提高热敏性产品的产量。
（1）解决资源短缺与环境污染问题
随着对纤维素水解研究的不断深入，利用纤维废料发酵生产酒精、乙烯等能源物质已取得成功。
2．下列叙述中，错误的是(　　)
A．利用纤维废料发酵生产酒精、乙烯等能源物质，这种发酵原料的改变对解决资源短缺与环境污染问题具有重要意义
B．科学家们利用一些寄生性的细菌和病毒来治疗疾病或防治农林害虫，如苏云金杆菌可寄生在某些害虫体内，对害虫有较强的致病力
C．青霉素由细菌中的青霉菌产生，属抗生素类药物
D．科学家通过基因工程用微生物可以生产治疗糖尿病的药物——胰岛素
考点题型突破
C
课堂小结

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