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人教版 选择性必修3
第1章 发酵工程
第2节 微生物的培养技术及应用
（二） 微生物的选择培养与计数
自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合的菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。该怎么办呢？
引 言
1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？
分离：获得分解尿素的细菌的纯培养物
计数：测定分解尿素的细菌的数量
怎么分离？
如何计数？
土壤菌液（牛肉膏蛋白胨培养基）
01. 选择培养基
科学实例：寻找耐高温的DNA聚合酶
聚合酶链式反应(PCR)是一种在体外扩增DNA片段的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。
到哪里去寻找这种酶？
耐高温的酶
耐高温生物体
高温环境（热泉、火山口）
寻找
寻找
思路：
科学实例：寻找耐高温的DNA聚合酶
美国黄石公园
1973年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的水生栖热菌，并从这种菌种提取出耐高温的DNA聚合酶。
因为水生栖热菌能在 70-80 ℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
为什么水生栖热菌能从热泉中被筛选出来？
01. 选择培养基
启示：根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
耐寒微生物
耐热微生物
石油分解菌
纤维素分解菌
你还知道哪些条件能影响微生物的生存和繁殖？
特殊营养物质、pH、O2等。
这对在实验室中选择培养特定的微生物有什么启示？
01. 选择培养基
启示：根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
耐寒微生物
耐热微生物
石油分解菌
纤维素分解菌
人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度和pH）等，同时抑制或阻止其他微生物生长。
实验室中微生物筛选的原理
选择培养基
01. 选择培养基
1.概念
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。
01. 选择培养基
回忆必修二开展的“探究抗生素对细菌的选择作用”
一般情况下，一定浓度的抗生素会杀死细菌，但变异的细菌可能产生耐药性。在实验室连续培养细菌时，如果向培养基中添加抗生素，耐药菌有可能存活下来。
通过观察细菌在含有抗生素的培养基上的生长状况，探究抗生素对细菌的选择作用。
1.概念
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。
01. 选择培养基
基础培养基
选择培养基
+某种抗生素
接种培养
培养结果
上述过程能否充分说明该选择培养基具有选择性？
1.概念
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。
01. 选择培养基
设置基础培养基或完全培养基作为对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数菌多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。
怎么证明一个选择培养基具有选择性？
基础培养基
选择培养基
01. 选择培养基
2.选择培养基的配方设计
常见的分解尿素的微生物：芽孢杆菌、小球菌、棒状杆菌等细菌。
CO(NH2)2+H2O CO2+2NH3
脲酶
01. 选择培养基
2.选择培养基的配方设计
如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
琼脂 20.0g
蒸馏水 定容到1000ml
培养基一
KH2PO4 1.4g
NaH2PO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 定容到1000ml
培养基二
选择哪种培养基更合适？

可作为完全培养基
（起对照作用）
01. 选择培养基
2.选择培养基的配方设计
以尿素作为唯一氮源设计选择培养基，可以将分解尿素的细菌分离出来。
1. 如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，
培养基的配方该如何设计？
讨论
这种培养基与普通培养基相比，只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。
2. 该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
3.选择培养基的类型
类型 条件 分离得到的菌种
改变培养条件 高温环境 水生栖热菌等
高盐环境 金黄色葡萄球菌等耐盐菌
添加某种化学物质 加入青霉素 酵母菌、霉菌等真菌
特殊碳源、氮源 尿素是唯一氮源 能分解尿素的微生物
石油是唯一碳源 能消除石油污染的微生物
营养缺陷 不加碳源 自养型微生物
不加氮源 固氮菌
01. 选择培养基
02. 微生物的选择培养
选择培养基平板准备好，还需要准备什么？
土壤微生物
细菌宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大部分分布在距地表3~8cm的土壤层。铲去表层土3cm左右，取样，将样品装入事先准备好的信封中。
02. 微生物的选择培养
土壤收集后能不能直接倒入平板内培养？应该怎么操作？
将土样加入盛有无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，取菌液加入平板内培养。
图1 完全培养基
图2 选择培养基
配制菌液土样时取多少？无菌水加多少？培养时取多少液体？
土壤细菌的数量庞大，要想得到特定微生物的纯培养物，需要对土壤进行充分稀释，然后再将菌液涂布到制备好的选择培养基上。
02. 微生物的选择培养
怎么确定稀释度是合适的？
将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基表面的方法。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落。
稀释涂布平板法
A.梯度稀释菌液 B.涂布平板
主要操作:
02. 微生物的选择培养
A.梯度稀释菌液
主要操作:
1×10
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1×102
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
9 mL 无菌水
90mL无菌水
10g
②在火焰旁将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
①铲取土样，将样品装入纸袋中。
02. 微生物的选择培养
②涂布平板
主要过程:
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
微量移液器（枪）：
可精准吸取少量液体，有不同量程，配合对应规格的一次性灭菌枪头使用
02. 微生物的选择培养
①按照无菌操作的方法，进行规范操作：取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌；稀释涂布全过程在超净工作台、酒精灯火焰附近操作，涂布器要灼烧灭菌等。操作完成后，一定要洗手。
【注意事项】
②将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上灼烧。不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精。
③本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。
02. 微生物的选择培养
恒温培养箱
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30-37℃的恒温培养箱中，培养1-2d。
与平板划线一样，完成涂布后，应将一个未接种的培养基和已接种的培养基放在一起培养，目的是：
检测培养基是否被污染。
在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落。
同样是分离得到单菌落，平板划线法和稀释涂布平板法有何不同？
微生物的分离方法
比较 平板划线法 稀释涂布平板法
工具 接种环 涂布器
原理 通过接种环在琼脂固体培养基的表面连续划线操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。（不能计数） 将菌液进行一系列的梯度稀释，稀释度足够高时，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞。（可计数）
特点 方法简单，但不适宜计数 可计数，但操作复杂
平板 示图
共同点 使培养基上形成由单个细菌细胞繁殖而来的子细胞群体——菌落
03. 微生物的数量测定
①原理：
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
菌落数 活菌数
不是。样品的稀释倍数将直接影响平板上的菌落数。在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养和计数。
是否每个稀释倍数的样品液都可以进行计数？
1.间接计数 — 稀释涂布平板法
03. 微生物的数量测定
①原理：
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物宜采用不同的稀释度计数。
测细菌数：一般用104、105、106稀释液
测放线菌：一般用103、104、105稀释液
测真菌数：一般用102、103、104稀释液
②计数原则：
一定稀释范围：保证获得菌落数为30~300、适宜计数的平板。
初次实验可以将稀释的范围放宽一点
菌落数 活菌数
1.间接计数 — 稀释涂布平板法
03. 微生物的数量测定
①原理：
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
菌落数 活菌数
②计数原则：
一定稀释范围：保证获得菌落数为30~300、适宜计数的平板。
在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。
以测定分解尿素的细菌为例，需要准备多少个平板？（注意对照组的设置）
1.间接计数 — 稀释涂布平板法
03. 微生物的数量测定
1.间接计数 — 稀释涂布平板法
103
104
105
106
107
不同稀释倍数的已接种的选择培养基，每种稀释倍数至少3个
减少实验误差，保证实验结果更准确
不同稀释倍数的已接种的牛肉膏蛋白胨培养基各1个
充分说明选择培养基具有选择性
103
104
105
106
107
接种
不接种
未接种的牛肉膏蛋白胨培养基1个
未接种的选择培养基1个
检验选择培养基和完全培养基是否污染
03. 微生物的数量测定
组 具体组别 具体操作 作用
接种组 实验组1 选择培养基 三次重复排除偶然因素对实验结果的影响，用以分离并计数能分解尿素的细菌。
实验组2 选择培养基
实验组3 选择培养基
实验组4 牛肉膏蛋白胨培养基 实验组4与实验组1 、2、3组对比用以验证选择培养基是否具有选择作用。
不接种组 对照组1 选择培养基 对照组1与实验组1 、2、3组对比用以验证选择培养基中是否含有杂菌。
对照组2 牛肉膏蛋白胨培养基 对照组2与实验组4 对比用以验证牛肉膏蛋白胨培养基中是否含有杂菌。
结果 实验组1、2、3分离得到尿素分解菌的单菌落； 实验4组得到多种菌落；对照组1、2组正常情况下无菌落。
03. 微生物的数量测定
1.间接计数 — 稀释涂布平板法
每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
一般来说，在相同培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征。请仔细观察所分离到的菌落，最好以表格的形式将不同菌落的特征（如形状、大小和颜色等）记录下来。
03. 微生物的数量测定
1.间接计数 — 稀释涂布平板法
③结果计算：
4号试管的结果表明：
每克土壤中的活菌数约为 个。
1.1×108
通过稀释涂布平板法统计的细菌的数目与它的实际数目相同吗？
统计的细菌数往往比实际数目低。因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。统计的结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。
④结果分析：
03. 微生物的数量测定
2.直接计数——显微镜直接计数法
①原理：
利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。
血细胞计数板常用对相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等；
细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数。
②优缺点：
优点：计数方便、操作简单，快速、直观
缺点：统计结果一般是菌数和死菌数的总和，不能区分死菌与活菌，计数节结果比实际值大；个体小的细菌在显微镜下难以观察；不适于对运动细菌的计数。
微生物的计数方法
内容 直接计数法 间接计数法
主要用具 显微镜、细菌计数板或血细胞计数板 涂布器
计数依据 细菌个数 培养基上菌落数
优点 计数方便、操作简单 计数的是活菌
缺点 不能区分死菌与活菌 当两个或多个菌体连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落
计算公式 每毫升原液含菌株数＝每小格平均菌株数×400×1 0000×稀释倍数 每克样品中的菌株数：(C ÷ V）× M
C：某稀释度下平板上生长的平均菌落数；V：涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)；M：稀释倍数
结果 比实际值偏大 比实际值偏小
03. 微生物的数量测定
实验流程：
样品稀释涂布平板
微生物的培养与观察
菌落计数
土壤取样
制备培养基
①结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。
②你是否获得了某一稀释度下菌落数为30～300的平板 在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近
③你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少 与其他同学统计的结果接近吗 如果差异很大，可能是什么原因引起的
如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。如果接种后的完全培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。
如果得到了两个或多个菌落数为30～300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。
如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。
03. 微生物的数量测定
04. 土壤中分解尿素的细菌的鉴定
在以尿素作为唯一氮源的培养基中分离出的微生物都是能分解尿素的吗？
因为有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物进行生长繁殖。
不一定。
对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。
CO(NH2)2
脲酶
+ H2O
+ CO2
2NH3
原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→ 酚红变红→脲酶阳性
操作：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。
①液体培养基可以直接看液体的变色情况；
②固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。
微生物的数量测定
选择培养基的作用
微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法
微
生
物
的
选
择
培
养
和
计
数
选择培养基
微生物的选择培养
科学实例
筛选原则
选择培养基的概念及举例
稀释涂布平板法的操作过程
间接计数法 — 稀释涂布平板法
直接计数 —计数板计数法
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
培养基的制备
实验设计
（1）土壤取样
（2）样品的稀释
（3）稀释涂布平板法接种
（4）微生物的培养与观察
实验结果
练习与应用
一、概念检测
1. 研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌，判断下列相关表述是否正确。
（1）这种培养基是一种选择培养基。（ ）
（2）利用这种石油降解菌可以降解石油，修复土壤。（ ）
（3）相对于未被污染的土壤，从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。（ ）
2. 用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，原因是（ ）
A. 菌落中的细菌数目是固定的
B. 平板上的一个菌落就是一个细菌
C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同
D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
√
√
√
D
练习与应用
二、拓展应用
1.反刍（chú）动物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。
由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基，还应该参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。
练习与应用
二、拓展应用
2. 地球上的植物每年产生的纤维素超过70 亿吨，其中40%～ 60%能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用秸秆等生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈（如下图所示）。
练习与应用
二、拓展应用
(1)现在要从土壤中分离纤维素分解菌，请你给出详细的实验方案。
(2)你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？
可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。
(3)有同学说，可以把滤纸埋在土壤中，经过一段时间后，再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。
可行，这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境,腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。

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