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3.2.2DNA片段的扩增及电泳鉴定
【学习目标】　
1.了解PCR和电泳鉴定的基本原理。 2.尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。
【自主预习】
一、实验原理
1．DNA片段的扩增
PCR利用了 原理，通过 来控制DNA双链的 。
2．琼脂糖凝胶电泳
(1)带电粒子：DNA分子具有 ，在一定的pH下，这些基团可以带上 。
(2)迁移动力与方向：在 的作用下，带电分子会向着与它所带电荷 的电极移动，这个过程就是电泳。
(3)迁移速率：在凝胶中DNA分子的迁移速率与 、 有关。
(4)检测：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为 下被检测出来。
二、方法步骤
1．移液：用 按照配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入 。
2． ：待所有的组分都加入后，盖严离心管的盖子。
3．离心：将微量离心管放在离心机上，离心约 ，使反应液集中在管的 。
4．反应：将装有反应液的微量离心管放入 中，设置程序进行反应。
5．根据待分离的DNA片段的大小，用 配制琼脂糖溶液，一般配制质量分数为 的琼脂糖溶液，并加入 混匀。
6．将扩增得到的PCR产物与 (内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。
7．接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为 。待指示剂前沿迁移接近 时，停止电泳。
8．电泳结束后，取出凝胶置于 下观察和照相。
三、操作提示
1．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行 处理。
2．缓冲液和酶应分装成小份，并在 储存。使用前将所需试剂从冰箱拿出，放在 融化。
3．在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的 。
4．在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
【合作探究】
1.电泳是什么？DNA分子在凝胶中的迁移速率受到什么因素的影响？
2.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
3.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
什么是引物？1个目的基因在第3次扩增时，需要几种引物？需要几个引物？
【任务探究】
任务一：通过填空简单回顾基因工程的基本操作程序知识框架，找出哪些地方需要PCR技术的应用。
任务二：阐明PCR的概念、原理及作用
一、什么是PCR？（概念）
问题1.PCR的全称是什么？PCR的原理是什么？
问题2.PCR的优点是什么？
二、PCR的实验过程
问题1.PCR的离心管里要放入哪些组分？这些组分分别有哪些功能？（重点：引物的作用）
问题2.PCR的过程分为几个步骤？每个步骤的条件和作用分别是什么？
任务三：找不同，罗列DNA与PCR的技术区别
完成下表，体内DNA复制与PCR的技术区别
项目 体内复制 PCR技术
解旋
引物
能量
酶
温度
复制特点
复制方向
任务四：PCR知识延伸
分组讨论，展示并讲解问题1和问题2
问题1. PCR技术中的数量关系：
物质(复制) 1次 2次 3次 n次
DNA分子数
含引物的DNA分子数
含引物A(或B)的DNA分子数
同时含引物A、B的DNA分子数
共消耗的引物(A和B)数量
问题2.一般情况下，一个DNA在PCR仪器中循环几次之后才能合成出两条脱氧核苷酸链等长的子代DNA？PCR循环n此后，共产生等长的子代DNA多少个？
问题3.情境思考
资料：右图为疫情三年每位同学都经历的咽拭子核酸检测，
从咽部获取的新冠病毒RNA的量太少一般无法直接检测
出来，需要扩增后检测。
问题：PCR可以扩增mRNA吗？
【知识结构化】
【迁移应用】
1.DNA的复制需要引物，主要原因是(　　)
A．可加快DNA的复制速度 B．引物可与DNA母链通过碱基互补配对结合
C．引物的5′端有助于DNA聚合酶的延伸DNA链 D．DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链
2.下列关于PCR技术的叙述，正确的是(　　)
A．该技术应用体内DNA双链复制原理，也需要模板、原料、能量、酶等条件
B．PCR技术建立在对扩增的目的基因序列完全已知的基础上
C．该技术需要一对特异性的引物，要求一对引物的序列是互补的
D．该技术需要解旋酶和热稳定的DNA聚合酶
3.目前广泛应用的新型冠状病毒检测方法是实时荧光RT-PCR技术。RT—PCR是将RNA逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增反应相结合的技术，具体过程如图所示，下列说法不正确的是
A.引物A与引物B应该具有不同的碱基序列 B.过程Ⅱ通过控制温度的变化实现目标序列的循环扩增
C.该反应体系中应加入缓冲液、引物、四种核糖核苷酸、逆转录酶、Taq酶等物质
D.该检测方法的应用依赖于新型冠状病毒特异性序列的确定
4.如图为PCR技术扩增图解，请回答下列问题：
(1)在PCR技术扩增目的基因时 （需要/不需要）解旋酶，原因是 。
(2)利用PCR技术扩增目的基因前，需根据目的基因的核苷酸序列设计 种引物，进行PCR时需加热至90-95度然后冷却至55-60度，此操作的目的是 。
（3）利用PCR技术扩增目的基因时，需要加入两种引物，原因是
，在DNA聚合酶的作用下，两条子链的延伸方向都是 。DNA聚合酶只能特异地复制处于　　 之间的DNA序列，若这个过程中消耗了引物62个,则进行了 轮的DNA复制。
(4)目的基因能被准确扩增的原因是 。
(5)PCR技术的必需条件，除了模板、原料、酶之外，至少还有三个条件，即液体环境、适宜的__________和_________，前者由________自动调控，后者则靠___________来维持。
（6）从理论上讲，在PCR技术中，循环4次产生的DNA分子中，第四次循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为 。
（7）假设DNA片段有150个脱氧核苷酸对，若DNA分子中胞嘧啶脱氧核苷酸有70个，则5次循环，需要胸腺嘧啶脱氧核苷酸 个（不考虑引物所对应的片段）

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