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难点突破练75　基因工程的综合考查
一、选择题
1．(2023·深圳市高级中学高三模拟)红细胞生成素(EPO)是人体内促进红细胞生成的一种糖蛋白，可用于治疗肾衰性贫血等疾病。由于天然 EPO来源极为有限，某科研团队采用基因工程培育转基因羊作为乳腺生物反应器，使其能合成EPO。下列有关叙述错误的是(　　)
A．构建表达载体时需将EPO基因插入乳腺蛋白基因的启动子的上游
B．一般情况下，该转基因羊中的EPO基因只在羊的乳腺细胞中表达
C．可用显微注射技术将含有EPO基因的表达载体导入羊的受精卵中
D．用PCR扩增人EPO基因，需要一段已知的EPO基因核苷酸序列
2．为提高红豆杉细胞培养物中紫杉醇的产量，研究人员构建紫杉醇合成关键酶基因(Bapt)的超表达载体，并将其导入红豆杉细胞，具体流程如图。下列相关说法不正确的是(　　)
A．p1301载体上应含有增强Bapt基因表达的序列
B．超表达载体中应含有潮霉素抗性基因作为标记基因
C．可使用Bapt基因制成的探针检测过程⑤是否成功
D．工厂化生产紫杉醇需将改造后的红豆杉细胞培养至愈伤组织
3．(2023·通州高三三模)为增加油菜种子含油量，科研人员尝试将酶D基因与叶绿体转运肽(引导合成的蛋白质进入叶绿体)基因连接(图甲)，导入Ti质粒(图乙)，最终获得转基因油菜品种，下列叙述错误的是(　　)
A．用Cla Ⅰ切割酶D基因和转运肽基因，再利用DNA连接酶连接获得目的基因
B．用Xba Ⅰ和Sac Ⅰ同时切割目的基因和载体片段，连接后获得重组Ti质粒
C．相对于将酶D基因插入受体细胞染色体DNA中，将其插入叶绿体DNA中可防止基因污染
D．转基因油菜的酶D基因只表达于含叶绿体的细胞，并在叶绿体内转录、翻译
4．(2024·锦州高三质检)实时荧光RT－PCR可用于RNA病毒的核酸检测，其原理：在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，新链延伸过程中，DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用RT－PCR进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法不正确的是(　　)
A．做RT－PCR之前，需要先根据cDNA的核苷酸序列合成引物和探针
B．RNA不能作为PCR扩增的模板，故需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增
C．若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者没有感染病毒
D．病毒的检测还可以检测病毒表面的物质或病毒引发产生的抗体，其原理都是抗原—抗体杂交
5．研究表明，服用α—干扰素在慢性乙肝、丙肝及部分肿瘤的治疗中有一定疗效。人参是一种名贵药材，具有较好的滋补作用。如图为科研人员制备能合成干扰素的人参愈伤组织细胞的流程，①～④表示相关的操作。若限制酶EcoRⅠ识别序列为G↓AATTC，BamHⅠ识别序列为G↓GATCC。下列选项不正确的是(　　)
A．步骤①中，利用 PCR 技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是干扰素基因两端的部分核苷酸序列
B．在过程③中T—DNA 整合到受体细胞的染色体 DNA 上
C．科研人员在两种引物的一端分别加上了 GAATTC 和 GGATCC 序列，目的是方便后续的剪切和连接
D．过程④中，科研人员最终未能检测出干扰素基因，其原因可能是干扰素基因未能导入人参愈伤组织细胞
6．(2023·长沙高三二模)载体是基因工程中携带外源DNA片段(目的基因)进入受体细胞的重要运载工具，常见的载体类型主要有基因克隆载体和基因表达载体。如图是利用细菌生产人胰岛素的基本流程示意图，下列相关叙述正确的是(　　)
A．重组载体a、重组载体b分别是基因表达载体和基因克隆载体
B．载体a和载体b都必须含有限制酶切割位点、复制原点和标记基因
C．必须把目的基因插入重组载体a的启动子和终止子之间
D．培养细菌a和细菌b的培养基在营养成分和功能上没有明显差异
7．(2024·成都高三检测)研究人员利用绿色荧光蛋白基因(sGFP)转染大丽轮枝菌，培育表达绿色荧光蛋白的转基因菌株，主要过程如图所示(图中a链和b链分别是相应基因转录的模板链)。下列说法正确的是(　　)
A．利用PCR扩增sGFP时需解旋酶打开DNA双链，b链的黏性末端碱基序列(5′→3′)为AGCT
B．应将目的基因插入到复制原点，以保证sGFP基因可以在大丽轮枝菌细胞中表达
C．先将目的基因导入农杆菌，再将转化后的农杆菌放置于含有潮霉素的培养基上，筛选出含有目的基因的农杆菌
D．最终通过抗原－抗体杂交技术检测绿色荧光以筛选出绿色荧光蛋白旺盛表达的大丽轮枝菌
8．(2023·韶关高三联考)真菌AFPs基因表达的蛋白质能提高细胞的抗冻能力，将AFPs基因导入番茄中培育抗冻番茄品种，延长番茄果实的储存期。AFPs基因及基因表达载体的元件组成情况如图所示，图中的EcoR Ⅰ、HindⅢ、BamHⅠ、SmaⅠ均表示限制性内切核酸酶，相关酶的切割位点分布如图所示，基因经所有酶切割后均会产生不同的黏性末端。下列分析正确的是(　　)
A．用限制性内切核酸酶可从真菌细胞内获取大量的AFPs基因
B．构建基因表达载体宜选择BamHⅠ、HindⅢ与E.coli DNA连接酶
C．需用显微注射技术将重组质粒注入番茄胚细胞中获得转基因植株
D．含有重组质粒的受体细胞不能在含四环素的培养基上正常生长
9．如图为质粒pUC18，为生产出满足需求的质粒载体，利用定点诱变技术，通过设计具有诱变位点的引物P1和引物P2进行PCR，来实现目标载体的单碱基突变，目的是使质粒pUC18不能被限制酶Eam1105Ⅰ识别，但依然具有氨苄青霉素抗性。下列相关叙述错误的是(　　)
A．诱变位点位于限制酶Eam1105Ⅰ识别序列中
B．PCR反应体系由P1、P2两种引物、脱氧核苷酸、TaqDNA聚合酶及含Mg2＋的缓冲液组成
C．诱变成功的质粒依然具有氨苄青霉素抗性，利用了密码子具有简并性的原理
D．诱变成功的质粒pUC18经过EcoRⅠ、Eam1105Ⅰ双酶切后进行电泳，只能产生1条条带
10．(2024·丹东第二中学高三期末)为提高大豆对磷元素的吸收能力，研究人员利用农杆菌转化法将水稻的耐低磷基因OsPTF转移到大豆植株中，如图为重组Ti质粒上T－DNA的序列结构示意图。下列相关叙述错误的是(　　)
A．以水稻RNA为模板通过逆转录及PCR扩增可获得大量OsPTF基因
B．RNA聚合酶与启动子1识别并结合后，启动抗除草剂基因的转录
C．可通过含除草剂的选择培养基筛选含有目的基因的大豆愈伤组织
D．用EcoRⅠ、BamHⅠ酶同时切割重组Ti质粒后，经电泳分离至少得到两个不同长度的条带
二、非选择题
11．(2024·珠海实验中学高三月考)土壤盐渍化影响水稻生长发育。科研人员将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88中，培育出了耐盐碱水稻新品种。其操作流程及可能用到的限制酶如图所示，图中Bar为抗除草剂基因，AmpR为氨苄青霉素抗性基因，TetR为四环素抗性基因。请分析回答：
限制酶 识别序列和切割位点
Sac Ⅰ －GAGCT↓C－
Sma Ⅰ －CCC↓GGG－
BamH Ⅰ －G↓GATCC－
Bcl Ⅰ －T↓GATCA－
(1)过程①利用PCR技术扩增并改造OsMYB56基因需要添加引物，为了构建基因表达载体时用相同限制酶切割后的质粒和OsMYB56基因能正确连接，应选用的引物组合为______________。
A．5′－CCCGGG…－3′和5′－GGATCC…－3′
B．5′－GAGCTC…－3′和5′－GGATCC…－3′
C．5′－GAGCTC…－3′和5′－TGATCA…－3′
D．5′－CCCGGG…－3′和5′－TGATCA…－3′
(2)根据基因表达载体的结构组成分析，Ti质粒中的CaMV 53S是__________。
(3)为筛选出含重组T－DNA的水稻愈伤组织细胞，应在添加__________的选择培养基上培养。诱导水稻愈伤组织细胞再分化发育成植株的培养过程中，__________(填“需要”或“不需要”)给予光照。
(4)为确定转基因耐盐碱水稻是否培育成功，可用________________方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐碱性。经检测，科研人员发现部分获得耐盐碱基因OsMYB56的水稻幼苗不具有耐盐碱能力，原因可能是_________________________________________________________
_______________________________________________________________________________。
12．(2024·黄冈高三统考)CRISPR/Cas9基因编辑技术的原理如下：一条单链向导RNA(sgRNA)引导核酸酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割，如图1所示。研究发现恶性肿瘤的发生与TDO2基因编码的色氨酸2,3－双加氧酶(TDO2)有关，某研究所采用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除TDO2基因的部分外显子，从而构建TDO2基因敲除(TDO2－KO)纯合模型小鼠(2n)，以期进一步探究TDO2基因的调控作用，相关过程如图2所示。
(1)为获取TDO2－KO小鼠，研究者利用显微注射技术将Cas9蛋白、sgRNA等混合液注入小鼠受精卵，其中sgRNA是以TDO2基因第______号外显子的部分碱基序列进行设计，Cas9蛋白可催化________键水解。
(2)通过基因编辑及相关技术获得4只小鼠，标记为1～4号，1、2为雌鼠，3、4为雄鼠。利用PCR等技术检测小鼠TDO2基因敲除情况。
①分别提取野生型和4只小鼠体细胞的________作为PCR模板，进行PCR时应选择图中引物__________，鉴定时才能区分各小鼠TDO2基因的敲除情况。
②PCR产物常采用________________(填技术)鉴定，鉴定结果如图3。据图判断，4号小鼠有____个TDO2基因被敲除，判断依据是_____________________________________________
______________________________________________________________________________。
(3)利用已有小鼠设计杂交实验，选择并获得TDO2－KO纯合小鼠，请写出实验思路。
难点突破练75　基因工程的综合考查（解析版）
一、选择题
1．(2023·深圳市高级中学高三模拟)红细胞生成素(EPO)是人体内促进红细胞生成的一种糖蛋白，可用于治疗肾衰性贫血等疾病。由于天然 EPO来源极为有限，某科研团队采用基因工程培育转基因羊作为乳腺生物反应器，使其能合成EPO。下列有关叙述错误的是(　　)
A．构建表达载体时需将EPO基因插入乳腺蛋白基因的启动子的上游
B．一般情况下，该转基因羊中的EPO基因只在羊的乳腺细胞中表达
C．可用显微注射技术将含有EPO基因的表达载体导入羊的受精卵中
D．用PCR扩增人EPO基因，需要一段已知的EPO基因核苷酸序列
答案　A
解析　启动子是一段具有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，故构建表达载体时需将EPO基因(目的基因)插入乳腺蛋白基因的启动子的下游，A错误。
2．为提高红豆杉细胞培养物中紫杉醇的产量，研究人员构建紫杉醇合成关键酶基因(Bapt)的超表达载体，并将其导入红豆杉细胞，具体流程如图。下列相关说法不正确的是(　　)
A．p1301载体上应含有增强Bapt基因表达的序列
B．超表达载体中应含有潮霉素抗性基因作为标记基因
C．可使用Bapt基因制成的探针检测过程⑤是否成功
D．工厂化生产紫杉醇需将改造后的红豆杉细胞培养至愈伤组织
答案　C
解析　超表达载体中应含有潮霉素抗性基因作为标记基因，在含有潮霉素的培养基上，超表达载体能够存活，从而起到筛选作用，B正确；由于红豆杉细胞中本身存在Bapt基因，无论超表达载体是否成功导入，都能与Bapt基因探针形成杂交分子，因此不能通过Bapt基因探针来检测步骤⑤是否成功，C错误；工厂化生产紫杉醇属于细胞产物的获得，只需要培养到愈伤组织阶段即可，D正确。
3．(2023·通州高三三模)为增加油菜种子含油量，科研人员尝试将酶D基因与叶绿体转运肽(引导合成的蛋白质进入叶绿体)基因连接(图甲)，导入Ti质粒(图乙)，最终获得转基因油菜品种，下列叙述错误的是(　　)
A．用Cla Ⅰ切割酶D基因和转运肽基因，再利用DNA连接酶连接获得目的基因
B．用Xba Ⅰ和Sac Ⅰ同时切割目的基因和载体片段，连接后获得重组Ti质粒
C．相对于将酶D基因插入受体细胞染色体DNA中，将其插入叶绿体DNA中可防止基因污染
D．转基因油菜的酶D基因只表达于含叶绿体的细胞，并在叶绿体内转录、翻译
答案　D
解析　酶D基因和转运肽基因上都有限制酶Cla Ⅰ切割位点，用Cla Ⅰ切割酶D基因和转运肽基因，会产生相同的黏性末端，再利用DNA连接酶连接获得重组目的基因，A正确；获得的重组目的基因上，含有Xba Ⅰ和Sac Ⅰ两种限制酶的切割位点，结合图乙，目的基因必须插在启动子和终止子之间，用Xba Ⅰ和Sac Ⅰ同时切割目的基因和载体片段，连接后可获得重组Ti质粒，B正确；叶绿体转运肽引导合成的蛋白质进入叶绿体，由于酶D基因与叶绿体转运肽基因重组形成新的目的基因，转基因油菜的酶D基因可以在其他细胞中表达，叶绿体转运肽会引导合成的蛋白质进入叶绿体，D错误。
4．(2024·锦州高三质检)实时荧光RT－PCR可用于RNA病毒的核酸检测，其原理：在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，新链延伸过程中，DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用RT－PCR进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法不正确的是(　　)
A．做RT－PCR之前，需要先根据cDNA的核苷酸序列合成引物和探针
B．RNA不能作为PCR扩增的模板，故需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增
C．若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者没有感染病毒
D．病毒的检测还可以检测病毒表面的物质或病毒引发产生的抗体，其原理都是抗原—抗体杂交
答案　C
解析　PCR扩增必须以DNA为模板，RNA不能作为PCR扩增的模板，所以需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增，B正确；若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者极有可能感染了病毒，C错误。
5．研究表明，服用α—干扰素在慢性乙肝、丙肝及部分肿瘤的治疗中有一定疗效。人参是一种名贵药材，具有较好的滋补作用。如图为科研人员制备能合成干扰素的人参愈伤组织细胞的流程，①～④表示相关的操作。若限制酶EcoRⅠ识别序列为G↓AATTC，BamHⅠ识别序列为G↓GATCC。下列选项不正确的是(　　)
A．步骤①中，利用 PCR 技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是干扰素基因两端的部分核苷酸序列
B．在过程③中T—DNA 整合到受体细胞的染色体 DNA 上
C．科研人员在两种引物的一端分别加上了 GAATTC 和 GGATCC 序列，目的是方便后续的剪切和连接
D．过程④中，科研人员最终未能检测出干扰素基因，其原因可能是干扰素基因未能导入人参愈伤组织细胞
答案　B
解析　在过程③将重组质粒导入根瘤农杆菌，而在侵染人参愈伤组织细胞时，T－DNA才被整合到受体细胞的染色体DNA上，B错误；由于需要用EcoRⅠ、BamHⅠ两种限制酶切割目的基因和质粒，因此科研人员还在两种引物的一端分别加上了GAATTC和GGATCC序列，以便于后续的剪切和连接，C正确；干扰素基因未能导入人参愈伤组织细胞或导入人参愈伤组织细胞的干扰素基因未能转录，都会导致通过该方法不能检测出干扰素基因，D正确。
6．(2023·长沙高三二模)载体是基因工程中携带外源DNA片段(目的基因)进入受体细胞的重要运载工具，常见的载体类型主要有基因克隆载体和基因表达载体。如图是利用细菌生产人胰岛素的基本流程示意图，下列相关叙述正确的是(　　)
A．重组载体a、重组载体b分别是基因表达载体和基因克隆载体
B．载体a和载体b都必须含有限制酶切割位点、复制原点和标记基因
C．必须把目的基因插入重组载体a的启动子和终止子之间
D．培养细菌a和细菌b的培养基在营养成分和功能上没有明显差异
答案　B
解析　重组载体a导入受体菌后随着受体菌的繁殖而扩增，因此是基因克隆载体，而重组载体b导入受体菌后，表达产生胰岛素，因此是基因表达载体，A错误；培养细菌a的目的是扩增目的基因，不需要获得表达产物，因此目的基因不一定要插入重组载体a的启动子和终止子之间，C错误；培养细菌a的目的是扩增目的基因，培养细菌b的目的是获得胰岛素，因此培养两者的培养基在营养成分和功能上有明显差异，D错误。
7．(2024·成都高三检测)研究人员利用绿色荧光蛋白基因(sGFP)转染大丽轮枝菌，培育表达绿色荧光蛋白的转基因菌株，主要过程如图所示(图中a链和b链分别是相应基因转录的模板链)。下列说法正确的是(　　)
A．利用PCR扩增sGFP时需解旋酶打开DNA双链，b链的黏性末端碱基序列(5′→3′)为AGCT
B．应将目的基因插入到复制原点，以保证sGFP基因可以在大丽轮枝菌细胞中表达
C．先将目的基因导入农杆菌，再将转化后的农杆菌放置于含有潮霉素的培养基上，筛选出含有目的基因的农杆菌
D．最终通过抗原－抗体杂交技术检测绿色荧光以筛选出绿色荧光蛋白旺盛表达的大丽轮枝菌
答案　C
解析　利用PCR扩增sGFP时，高温可将DNA双链打开，A错误；启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，终止子是使转录终止的序列，而目的基因不携带启动子和终止子，所以将sGFP插入到构巢曲霉启动子和终止子之间的目的是保证sGFP能在大丽轮枝菌细胞中表达，B错误；转基因成功的标志是形成目的基因的产物，最终可通过检测大丽轮枝菌菌丝细胞中绿色荧光强度，筛选出绿色荧光蛋白旺盛表达的大丽轮枝菌，绿色荧光可以直接观察到，不需通过抗原－抗体杂交技术检测，D错误。
8．(2023·韶关高三联考)真菌AFPs基因表达的蛋白质能提高细胞的抗冻能力，将AFPs基因导入番茄中培育抗冻番茄品种，延长番茄果实的储存期。AFPs基因及基因表达载体的元件组成情况如图所示，图中的EcoR Ⅰ、HindⅢ、BamHⅠ、SmaⅠ均表示限制性内切核酸酶，相关酶的切割位点分布如图所示，基因经所有酶切割后均会产生不同的黏性末端。下列分析正确的是(　　)
A．用限制性内切核酸酶可从真菌细胞内获取大量的AFPs基因
B．构建基因表达载体宜选择BamHⅠ、HindⅢ与E.coli DNA连接酶
C．需用显微注射技术将重组质粒注入番茄胚细胞中获得转基因植株
D．含有重组质粒的受体细胞不能在含四环素的培养基上正常生长
答案　B
解析　要得到大量的AFPs基因需要利用PCR技术进行扩增，A错误；为了不破坏目的基因，且避免由一种酶切割产生的黏性末端自行结合，宜选用BamHⅠ和HindⅢ进行切割，E.coli DNA连接酶可以连接黏性末端，B正确；将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，C错误；目的基因导入后会破坏潮霉素抗性基因，四环素抗性基因作为标记基因，含有AFPs基因的受体细胞能在含四环素的培养基上正常生长，D错误。
9．如图为质粒pUC18，为生产出满足需求的质粒载体，利用定点诱变技术，通过设计具有诱变位点的引物P1和引物P2进行PCR，来实现目标载体的单碱基突变，目的是使质粒pUC18不能被限制酶Eam1105Ⅰ识别，但依然具有氨苄青霉素抗性。下列相关叙述错误的是(　　)
A．诱变位点位于限制酶Eam1105Ⅰ识别序列中
B．PCR反应体系由P1、P2两种引物、脱氧核苷酸、TaqDNA聚合酶及含Mg2＋的缓冲液组成
C．诱变成功的质粒依然具有氨苄青霉素抗性，利用了密码子具有简并性的原理
D．诱变成功的质粒pUC18经过EcoRⅠ、Eam1105Ⅰ双酶切后进行电泳，只能产生1条条带
答案　B
解析　PCR反应体系除有P1、P2两种引物、脱氧核苷酸、TaqDNA聚合酶及含Mg2＋的缓冲液之外，还需要有模板DNA，B错误；诱变成功的质粒pUC18只有限制酶EcoR Ⅰ的识别序列，没有限制酶Eam1105 Ⅰ的识别序列，因此经过EcoR Ⅰ、Eam1105 Ⅰ双酶切后进行电泳，只能产生1条条带，D正确。
10．(2024·丹东第二中学高三期末)为提高大豆对磷元素的吸收能力，研究人员利用农杆菌转化法将水稻的耐低磷基因OsPTF转移到大豆植株中，如图为重组Ti质粒上T－DNA的序列结构示意图。下列相关叙述错误的是(　　)
A．以水稻RNA为模板通过逆转录及PCR扩增可获得大量OsPTF基因
B．RNA聚合酶与启动子1识别并结合后，启动抗除草剂基因的转录
C．可通过含除草剂的选择培养基筛选含有目的基因的大豆愈伤组织
D．用EcoRⅠ、BamHⅠ酶同时切割重组Ti质粒后，经电泳分离至少得到两个不同长度的条带
答案　B
解析　启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，用于驱动基因的转录，抗除草剂基因位于启动子2的后面，故RNA聚合酶与启动子2识别并结合后，启动抗除草剂基因的转录，B错误；由于图中T－DNA的序列中含有目的基因和抗除草剂基因，故可通过含除草剂的选择培养基筛选含有目的基因的大豆愈伤组织，C正确。
二、非选择题
11．(2024·珠海实验中学高三月考)土壤盐渍化影响水稻生长发育。科研人员将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88中，培育出了耐盐碱水稻新品种。其操作流程及可能用到的限制酶如图所示，图中Bar为抗除草剂基因，AmpR为氨苄青霉素抗性基因，TetR为四环素抗性基因。请分析回答：
限制酶 识别序列和切割位点
Sac Ⅰ －GAGCT↓C－
Sma Ⅰ －CCC↓GGG－
BamH Ⅰ －G↓GATCC－
Bcl Ⅰ －T↓GATCA－
(1)过程①利用PCR技术扩增并改造OsMYB56基因需要添加引物，为了构建基因表达载体时用相同限制酶切割后的质粒和OsMYB56基因能正确连接，应选用的引物组合为______________。
A．5′－CCCGGG…－3′和5′－GGATCC…－3′
B．5′－GAGCTC…－3′和5′－GGATCC…－3′
C．5′－GAGCTC…－3′和5′－TGATCA…－3′
D．5′－CCCGGG…－3′和5′－TGATCA…－3′
(2)根据基因表达载体的结构组成分析，Ti质粒中的CaMV 53S是__________。
(3)为筛选出含重组T－DNA的水稻愈伤组织细胞，应在添加__________的选择培养基上培养。诱导水稻愈伤组织细胞再分化发育成植株的培养过程中，__________(填“需要”或“不需要”)给予光照。
(4)为确定转基因耐盐碱水稻是否培育成功，可用________________方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐碱性。经检测，科研人员发现部分获得耐盐碱基因OsMYB56的水稻幼苗不具有耐盐碱能力，原因可能是_________________________________________________________
_______________________________________________________________________________。
答案　(1)B　(2)启动子　(3)除草剂　需要　(4)一定浓度的盐水浇灌　虽然获得了相应的基因，但耐盐基因OsMYB56转录或翻译异常(或耐盐基因OsMYB56表达异常)
解析　(1)在进行PCR操作时，引物应分别与基因两条链的3′端结合，根据图中序列，应选用的引物组合为5′－GAGCTC…－3′和5′－GGATCC…－3′，B符合题意。(2)根据基因表达载体的结构组成分析，在目的基因的上游要有启动子，下游要有终止子，因此CaMV 53S是启动子。(3)目的基因和质粒连接后，T－DNA上只保留了抗除草剂基因，为了筛选出含重组质粒的受体细胞，应在添加除草剂的选择培养基上培养。诱导水稻愈伤组织细胞再分化发育成植株的培养过程中，需要给予光照。
12．(2024·黄冈高三统考)CRISPR/Cas9基因编辑技术的原理如下：一条单链向导RNA(sgRNA)引导核酸酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割，如图1所示。研究发现恶性肿瘤的发生与TDO2基因编码的色氨酸2,3－双加氧酶(TDO2)有关，某研究所采用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除TDO2基因的部分外显子，从而构建TDO2基因敲除(TDO2－KO)纯合模型小鼠(2n)，以期进一步探究TDO2基因的调控作用，相关过程如图2所示。
(1)为获取TDO2－KO小鼠，研究者利用显微注射技术将Cas9蛋白、sgRNA等混合液注入小鼠受精卵，其中sgRNA是以TDO2基因第______号外显子的部分碱基序列进行设计，Cas9蛋白可催化________键水解。
(2)通过基因编辑及相关技术获得4只小鼠，标记为1～4号，1、2为雌鼠，3、4为雄鼠。利用PCR等技术检测小鼠TDO2基因敲除情况。
①分别提取野生型和4只小鼠体细胞的________作为PCR模板，进行PCR时应选择图中引物__________，鉴定时才能区分各小鼠TDO2基因的敲除情况。
②PCR产物常采用________________(填技术)鉴定，鉴定结果如图3。据图判断，4号小鼠有____个TDO2基因被敲除，判断依据是_____________________________________________
______________________________________________________________________________。
(3)利用已有小鼠设计杂交实验，选择并获得TDO2－KO纯合小鼠，请写出实验思路。
答案　(1)3、7　磷酸二酯　(2)①基因组DNA　1和8　②琼脂糖凝胶电泳　1　4号小鼠有2个电泳条带，有1个条带与野生型小鼠不同，说明有1个TDO2基因被敲除　(3)将1号和4号小鼠杂交得子代，通过PCR及电泳对子代进行鉴定，选出TDO2－KO纯合小鼠
解析　(1)为获取TDO2－KO小鼠，研究者利用显微注射技术将Cas9蛋白、sgRNA等混合液注入小鼠受精卵，据图可知，其中sgRNA是以TDO2基因第3、7号外显子的部分碱基序列进行设计。(2)利用PCR等技术检测小鼠TDO2基因敲除情况，需分别提取野生型(作为对照)和4只小鼠体细胞的基因组DNA作为PCR模板；据图可知，基因敲除位点是图2中引物2、3、6、7结合的区域，不能选用，而引物1和8分别与TDO2基因两条链的3′端结合，PCR扩增时，分别在引物1和8的3′端延伸，可获得TDO2基因，基因敲除成功的小鼠扩增得到的片段较野生型(基因未敲除)小鼠的短，故进行PCR时应选择图中引物1和8，鉴定时才能区分各小鼠TDO2基因的敲除情况；PCR产物常采用琼脂糖凝胶电泳鉴定；据图判断，4号小鼠有1个TDO2基因被敲除，因为4号小鼠有2个电泳条带，有1个条带与野生型小鼠不同，说明有1个TDO2基因被敲除，而有1个条带与野生型小鼠相同，说明这个TDO2基因未被敲除。(3)1号和4号均有1个TDO2基因被敲除，1个TDO2基因未被敲除，可认为是杂合子，1号为雌鼠，4号为雄鼠，故可选择1号和4号进行杂交，再通过PCR及电泳对子代进行鉴定，选出仅含图3中1号或4号与野生型小鼠不同的条带所对应的小鼠，即TDO2－KO纯合小鼠。

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