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重点强化练74　基因工程的工具、原理和应用
一、选择题
1．(2023·海口高三模拟)限制酶、DNA连接酶等的发现为DNA分子的切割、连接及基因表达载体的构建创造了条件。下列关于重组DNA技术基本工具的叙述，正确的是(　　)
A．限制酶在原核细胞内的主要作用是切割修剪自身的DNA
B．噬菌体、动植物病毒均可作为载体将外源基因导入受体细胞
C．用作载体的质粒DNA分子上可以不含有限制酶切割位点
D．DNA 连接酶可连接DNA分子两条链中碱基对之间的氢键
2．(2024·湖北龙泉中学高三月考)下列关于DNA的提取和DNA片段的扩增及电泳鉴定的叙述，正确的是(　　)
A．利用DNA和蛋白质在冷酒精中溶解性的差异可初步分离DNA
B．在提取白色丝状物时双向搅拌比单向搅拌更有利于获得结构完整的DNA
C．PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水和移液器等在使用前都必须进行高压灭菌处理
D．PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，电泳时电泳缓冲液不能没过凝胶
3．(2024·永州第一中学高三月考)运用基因工程构建的生物反应器可实现药用蛋白的批量生产，目前常用的生物反应器有乳腺生物反应器和膀胱生物反应器，其构建过程如下：构建药用蛋白基因的表达载体，并将表达载体导入动物的受精卵中，然后从这个受精卵发育而成的个体的乳汁或者尿液中提取药用蛋白。下列相关说法错误的是(　　)
A．构建乳腺生物反应器时，需将药用蛋白基因和乳腺蛋白基因的启动子等重组在一起
B．在转基因动物的乳腺细胞或膀胱上皮细胞以外的细胞中不含有药用蛋白基因
C．与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器不受性别和年龄的限制
D．将表达载体导入哺乳动物的受精卵时，常采用显微注射技术
4．(2024·河源高三联考)组织型纤溶酶原激活物(t－PA)能激活纤溶酶原转化为纤溶酶，将沉积在血管内外的纤维蛋白溶解，从而保持血管畅通。t－PA进入血浆后大部分与纤溶酶原激活剂抑制物形成复合物，并迅速失去活性。科学家对其进行改造，增加溶栓效能、减少药用剂量和降低副作用等。下列叙述错误的是(　　)
A．改造t－PA可通过改造基因或合成基因来实现
B．改造t－PA的过程不需要构建基因表达载体
C．需根据t－PA氨基酸序列合成出相应的基因
D．利用蛋白质工程生产的改造t－PA在自然界中不存在
5．(2023·厦门高三模拟)如表为四种限制酶所识别的核苷酸序列及相应的切割位置(箭头所指)，下列叙述正确的是(　　)
限制酶种类 序列及切点 限制酶种类 序列及切点
①： EcoR Ⅰ ③：Bgl Ⅱ
②：BamH Ⅰ ④：Not Ⅰ
A.①②③④可催化磷酸二酯键和氢键断裂，形成黏性末端
B．①切出的 DNA 片段，只有用E.coliDNA连接酶才能连接起来
C．②③切出的末端连接后形成的片段，不能再被②或③识别切割
D．构建基因表达载体时，用②③进行双酶切，可防止目的基因与载体的反向连接
6．(2023·天津和平区高三二模)农杆菌Ti质粒上的T－DNA可以转移并随机插入到被侵染植物的染色体DNA中。研究者将如图中被侵染植物的DNA片段连接成环，并以此环为模板进行PCR，扩增出T－DNA插入位置两侧的未知序列，以此可确定T－DNA插入的具体位置。下列说法不正确的是(　　)
A．PCR扩增依据的是DNA分子双链复制的原理
B．进行PCR扩增需要热稳定DNA聚合酶
C．利用图中的引物②③组合可扩增出两侧的未知序列
D．通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定T－DNA的插入位置
7．(2023·厦门外国语学校高三模拟)研究人员将编码甜菜红素合成酶的四个基因BvCYP、BvDOD、cDOPA和ADH与绿色荧光蛋白基因eGFP连接，搭载到农杆菌Ti质粒的T－DNA片段上构建多基因表达载体，利用农杆菌转化法使其在烟草细胞中表达，并能观察到甜菜红素的合成与绿色荧光。下列说法错误的是(　　)
A．构建多基因表达载体时需用到限制酶和DNA连接酶
B．可用PCR技术检测五个基因是否成功导入烟草细胞
C．图中五个基因转录时均以DNA的同一条单链为模板
D．应选用含潮霉素的培养基筛选转化成功的烟草细胞
8．某实验小组利用如图所示质粒和目的基因来构建基因表达载体，将目的基因导入大肠杆菌细胞并表达。下列叙述正确的是(　　)
A．图中的质粒用酶a切割后，会产生8个游离的磷酸基团
B．在构建重组质粒时，可用酶a和酶c切割质粒和目的基因
C．成功导入目的基因的大肠杆菌可在含四环素的培养基中生长
D．若用酶b和酶c切割，可以避免质粒的自身环化
9．(2024·珠海高三联考)一种天然蛋白t－PA能高效降解因血浆纤维蛋白凝聚而成的血栓，是心梗和脑血栓的急救药，但是心梗患者注射大剂量的t－PA会诱发颅内出血。研究证实，将t－PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低其诱发出血的副作用。据此，先对天然t－PA基因的碱基序列进行改造，然后再采取传统的基因工程方法表达该改造后的基因，可制造出性能优异的改良t－PA蛋白(注：图中表示相关的目的基因、载体及限制酶，pCLY11为质粒)。下列叙述不正确的是(　　)
A．改造后的t－PA基因的黏性末端如图所示，则需要选用限制酶XmaⅠ和NheⅠ切割质粒pCLY11
B．成功转入重组质粒的受体细胞在培养基上会出现白色菌落
C．以上技术制造出性能优异的改良t－PA过程被称为蛋白质工程
D．改良t－PA基因的表达可在一定程度上降低颅内出血的概率
10．(2023·东莞实验中学高三模拟)干扰素是动物或人体细胞受到病毒侵染后产生的一种糖蛋白，可以用于对抗病毒的感染和癌症，但体外保存相当困难。如图是利用蛋白质工程设计生产干扰素的流程图，据图分析不正确的是(　　)
A．图中构建新的干扰素模型的主要依据是蛋白质的预期功能
B．图中新的干扰素基因必须插入质粒上的启动子和终止子之间才能表达
C．图中改造干扰素结构的实质是改造干扰素基因的结构
D．图中各项技术并没有涉及基因工程技术
二、非选择题
11．(2024·广州白云中学高三月考)如图表示某种绿色荧光蛋白基因表达载体的构建过程，绿色荧光蛋白基因有820个碱基对(bp)，质粒有5 369个碱基对(bp)。请据图回答问题：
(1)上述基因表达载体的构建过程需要的基本工具包括：______________________________。过程①②用相同的两种限制酶切割，与单一酶切相比，优势有________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)过程②目的基因的扩增可通过PCR技术实现，进行PCR时除提供DNA母链、4种脱氧核苷酸外，还需要__________________________(至少填两个)等基本条件。PCR可呈指数形式扩增目的基因，每个循环一般可分为________________________________________。
(3)已知图中质粒经BamH Ⅰ、Hind Ⅲ双酶切后进行电泳，若出现了一条长度为5 150 bp的DNA条带，则重组质粒的长度为____________的DNA片段条带。
(4)若想获得发绿色荧光的小鼠，可将重组质粒用____________法导入小鼠的____________(细胞)中。
12．(2024·深圳红岭中学高三月考)新型冠状病毒的抗原性和感染性与其表面的S蛋白(刺突糖蛋白)密切相关，现利用基因工程的方法生产相关疫苗。图甲为构建S蛋白基因表达载体的过程，图乙为重组质粒被相关酶切后的电泳结果。请回答下列问题：
(1)①过程所使用的酶为______________，为保证PCR技术扩增S蛋白基因正常进行，该反应体系的主要成分有____________________________________________________________。
PCR技术中复性的目的是________________________________________________________
_____________________________________________________________________________。
(2)PCR过程经过4次循环，消耗的引物的数量是______________个。
(3)构建好的重组质粒长度共2 000 bp，用限制酶Hind Ⅲ及限制酶Hind Ⅲ和BamH Ⅰ分别对重组质粒进行切割并电泳，结果如图乙所示，可推测BamH Ⅰ在重组质粒上有____________个酶切位点。
(4)腺病毒载体疫苗是将S蛋白基因插入到改造后的腺病毒基因组中，该疫苗进入人体后，S蛋白基因利用人体细胞的蛋白质表达系统指导S蛋白的合成，其过程是__________________
___________________________________________________________(用文字和箭头表示)。
重点强化练74　基因工程的工具、原理和应用（解析班）
一、选择题
1．(2023·海口高三模拟)限制酶、DNA连接酶等的发现为DNA分子的切割、连接及基因表达载体的构建创造了条件。下列关于重组DNA技术基本工具的叙述，正确的是(　　)
A．限制酶在原核细胞内的主要作用是切割修剪自身的DNA
B．噬菌体、动植物病毒均可作为载体将外源基因导入受体细胞
C．用作载体的质粒DNA分子上可以不含有限制酶切割位点
D．DNA 连接酶可连接DNA分子两条链中碱基对之间的氢键
答案　B
解析　限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，其在原核细胞中的主要作用是切割外源DNA使之失效，从而达到保护自身的目的，A错误；作为载体的质粒上必须有限制酶的切割位点，这是质粒作为运载体的条件之一， C错误；DNA连接酶连接的是磷酸二酯键，D错误。
2．(2024·湖北龙泉中学高三月考)下列关于DNA的提取和DNA片段的扩增及电泳鉴定的叙述，正确的是(　　)
A．利用DNA和蛋白质在冷酒精中溶解性的差异可初步分离DNA
B．在提取白色丝状物时双向搅拌比单向搅拌更有利于获得结构完整的DNA
C．PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水和移液器等在使用前都必须进行高压灭菌处理
D．PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，电泳时电泳缓冲液不能没过凝胶
答案　A
解析　在提取白色丝状物时用玻璃棒轻轻单向搅拌更有利于获得结构完整的DNA，B错误；PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水在使用前都必须进行高压灭菌处理，移液器不需要进行高压灭菌处理，C错误；通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物时，电泳缓冲液没过凝胶1 mm为宜，D错误。
3．(2024·永州第一中学高三月考)运用基因工程构建的生物反应器可实现药用蛋白的批量生产，目前常用的生物反应器有乳腺生物反应器和膀胱生物反应器，其构建过程如下：构建药用蛋白基因的表达载体，并将表达载体导入动物的受精卵中，然后从这个受精卵发育而成的个体的乳汁或者尿液中提取药用蛋白。下列相关说法错误的是(　　)
A．构建乳腺生物反应器时，需将药用蛋白基因和乳腺蛋白基因的启动子等重组在一起
B．在转基因动物的乳腺细胞或膀胱上皮细胞以外的细胞中不含有药用蛋白基因
C．与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器不受性别和年龄的限制
D．将表达载体导入哺乳动物的受精卵时，常采用显微注射技术
答案　B
解析　启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，可用于驱动基因的转录，构建乳腺生物反应器时，需将药用蛋白基因和乳腺蛋白基因的启动子等重组在一起，以保证目的基因在乳腺细胞中能够表达，A正确；受体细胞是动物的受精卵，所以在转基因动物的乳腺细胞或膀胱细胞以外的其他细胞中也含有药用蛋白基因，只是该基因没有表达，B错误；乳腺生物反应器只能从哺乳期雌性个体的乳汁中获取产物，与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器的优点是从雌雄个体的尿液中都可提取到产物，且不受性别、年龄等的限制，C正确。
4．(2024·河源高三联考)组织型纤溶酶原激活物(t－PA)能激活纤溶酶原转化为纤溶酶，将沉积在血管内外的纤维蛋白溶解，从而保持血管畅通。t－PA进入血浆后大部分与纤溶酶原激活剂抑制物形成复合物，并迅速失去活性。科学家对其进行改造，增加溶栓效能、减少药用剂量和降低副作用等。下列叙述错误的是(　　)
A．改造t－PA可通过改造基因或合成基因来实现
B．改造t－PA的过程不需要构建基因表达载体
C．需根据t－PA氨基酸序列合成出相应的基因
D．利用蛋白质工程生产的改造t－PA在自然界中不存在
答案　B
解析　通过蛋白质工程改造t－PA的过程仍需要构建基因表达载体，B错误。
5．(2023·厦门高三模拟)如表为四种限制酶所识别的核苷酸序列及相应的切割位置(箭头所指)，下列叙述正确的是(　　)
限制酶种类 序列及切点 限制酶种类 序列及切点
①： EcoR Ⅰ ③：Bgl Ⅱ
②：BamH Ⅰ ④：Not Ⅰ
A.①②③④可催化磷酸二酯键和氢键断裂，形成黏性末端
B．①切出的 DNA 片段，只有用E.coliDNA连接酶才能连接起来
C．②③切出的末端连接后形成的片段，不能再被②或③识别切割
D．构建基因表达载体时，用②③进行双酶切，可防止目的基因与载体的反向连接
答案　C
解析　①②③④均为限制酶，可催化磷酸二酯键的断裂，但不能催化氢键的断裂，且均形成黏性末端，A错误；①切出的 DNA 片段，带有黏性末端，用E.coliDNA连接酶和T4 DNA连接酶均能连接起来，B错误；②③切出的黏性末端相同，用DNA连接酶连接后形成的片段的碱基序列为－GGATCT－，因而不能再被②或③识别切割，C正确；构建基因表达载体时，用②③进行双酶切，不能防止目的基因与载体的反向连接，因为这两种限制酶切出的黏性末端是相同的，D错误。
6．(2023·天津和平区高三二模)农杆菌Ti质粒上的T－DNA可以转移并随机插入到被侵染植物的染色体DNA中。研究者将如图中被侵染植物的DNA片段连接成环，并以此环为模板进行PCR，扩增出T－DNA插入位置两侧的未知序列，以此可确定T－DNA插入的具体位置。下列说法不正确的是(　　)
A．PCR扩增依据的是DNA分子双链复制的原理
B．进行PCR扩增需要热稳定DNA聚合酶
C．利用图中的引物②③组合可扩增出两侧的未知序列
D．通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定T－DNA的插入位置
答案　C
解析　由于DNA的两条链反向平行，且子链从引物的3′端开始延伸，故利用图中的引物①④组合可扩增出两侧的未知序列，C错误。
7．(2023·厦门外国语学校高三模拟)研究人员将编码甜菜红素合成酶的四个基因BvCYP、BvDOD、cDOPA和ADH与绿色荧光蛋白基因eGFP连接，搭载到农杆菌Ti质粒的T－DNA片段上构建多基因表达载体，利用农杆菌转化法使其在烟草细胞中表达，并能观察到甜菜红素的合成与绿色荧光。下列说法错误的是(　　)
A．构建多基因表达载体时需用到限制酶和DNA连接酶
B．可用PCR技术检测五个基因是否成功导入烟草细胞
C．图中五个基因转录时均以DNA的同一条单链为模板
D．应选用含潮霉素的培养基筛选转化成功的烟草细胞
答案　C
解析　BvCYP启动子启动转录的方向与其他的不同，所以五个基因转录时的模板不是同一条DNA单链，C错误；卡那霉素抗性基因不位于T－DNA中，不能表达，而潮霉素抗性基因位于T－DNA中，能表达，应选用含潮霉素的培养基筛选被农杆菌转化的烟草细胞，D正确。
8．某实验小组利用如图所示质粒和目的基因来构建基因表达载体，将目的基因导入大肠杆菌细胞并表达。下列叙述正确的是(　　)
A．图中的质粒用酶a切割后，会产生8个游离的磷酸基团
B．在构建重组质粒时，可用酶a和酶c切割质粒和目的基因
C．成功导入目的基因的大肠杆菌可在含四环素的培养基中生长
D．若用酶b和酶c切割，可以避免质粒的自身环化
答案　D
解析　质粒中含有2个酶a的切割位点，切割后会产生4个游离的磷酸基团，A错误；如果用酶a和酶c同时切割质粒，会破坏质粒的标记基因，B错误；若用酶b和酶c同时切割质粒和目的基因，会导致四环素抗性基因被破坏，则导入目的基因的大肠杆菌不能在含四环素的培养基中生长，C错误。
9．(2024·珠海高三联考)一种天然蛋白t－PA能高效降解因血浆纤维蛋白凝聚而成的血栓，是心梗和脑血栓的急救药，但是心梗患者注射大剂量的t－PA会诱发颅内出血。研究证实，将t－PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低其诱发出血的副作用。据此，先对天然t－PA基因的碱基序列进行改造，然后再采取传统的基因工程方法表达该改造后的基因，可制造出性能优异的改良t－PA蛋白(注：图中表示相关的目的基因、载体及限制酶，pCLY11为质粒)。下列叙述不正确的是(　　)
A．改造后的t－PA基因的黏性末端如图所示，则需要选用限制酶XmaⅠ和NheⅠ切割质粒pCLY11
B．成功转入重组质粒的受体细胞在培养基上会出现白色菌落
C．以上技术制造出性能优异的改良t－PA过程被称为蛋白质工程
D．改良t－PA基因的表达可在一定程度上降低颅内出血的概率
答案　A
解析　t－PA改良基因的黏性末端如图所示，需选用限制酶Xma Ⅰ和 Bgl Ⅱ切开质粒pCLY11，才能与t－PA改良基因连接，A错误。
10．(2023·东莞实验中学高三模拟)干扰素是动物或人体细胞受到病毒侵染后产生的一种糖蛋白，可以用于对抗病毒的感染和癌症，但体外保存相当困难。如图是利用蛋白质工程设计生产干扰素的流程图，据图分析不正确的是(　　)
A．图中构建新的干扰素模型的主要依据是蛋白质的预期功能
B．图中新的干扰素基因必须插入质粒上的启动子和终止子之间才能表达
C．图中改造干扰素结构的实质是改造干扰素基因的结构
D．图中各项技术并没有涉及基因工程技术
答案　D
解析　启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，从而驱动转录，而终止子提供转录终止的信号，因此图中新的干扰素基因必须插入到质粒上的启动子和终止子之间才能表达，B正确；利用蛋白质工程设计生产干扰素的流程图中，合成新的干扰素基因后，要构建基因表达载体在受体细胞中表达，这属于基因工程技术，D错误。
二、非选择题
11．(2024·广州白云中学高三月考)如图表示某种绿色荧光蛋白基因表达载体的构建过程，绿色荧光蛋白基因有820个碱基对(bp)，质粒有5 369个碱基对(bp)。请据图回答问题：
(1)上述基因表达载体的构建过程需要的基本工具包括：______________________________。过程①②用相同的两种限制酶切割，与单一酶切相比，优势有________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)过程②目的基因的扩增可通过PCR技术实现，进行PCR时除提供DNA母链、4种脱氧核苷酸外，还需要__________________________(至少填两个)等基本条件。PCR可呈指数形式扩增目的基因，每个循环一般可分为________________________________________。
(3)已知图中质粒经BamH Ⅰ、Hind Ⅲ双酶切后进行电泳，若出现了一条长度为5 150 bp的DNA条带，则重组质粒的长度为____________的DNA片段条带。
(4)若想获得发绿色荧光的小鼠，可将重组质粒用____________法导入小鼠的____________(细胞)中。
答案　(1)限制酶、DNA连接酶、载体　可以避免目的基因自身环化、使目的基因定向插入到载体中　(2)TaqDNA聚合酶和引物　变性、复性、延伸　(3)5 970 bp　(4)显微注射　受精卵
解析　(2)利用PCR技术扩增DNA时，除需要模板DNA分子、4种脱氧核苷酸外，还需要TaqDNA聚合酶和引物。扩增时，每个循环一般需要经过“变性、复性、延伸”三个过程。(3)绿色荧光蛋白基因有820个碱基对，质粒有5 369个碱基对，质粒经BamHⅠ、HindⅢ双酶切后进行电泳，出现了一条长度为5 150 bp的DNA条带，说明5 150 bp的DNA条带是原质粒中切去部分片段的质粒，故重组质粒的长度＝5 150＋820＝5 970(bp)。
12．(2024·深圳红岭中学高三月考)新型冠状病毒的抗原性和感染性与其表面的S蛋白(刺突糖蛋白)密切相关，现利用基因工程的方法生产相关疫苗。图甲为构建S蛋白基因表达载体的过程，图乙为重组质粒被相关酶切后的电泳结果。请回答下列问题：
(1)①过程所使用的酶为______________，为保证PCR技术扩增S蛋白基因正常进行，该反应体系的主要成分有____________________________________________________________。
PCR技术中复性的目的是________________________________________________________
_____________________________________________________________________________。
(2)PCR过程经过4次循环，消耗的引物的数量是______________个。
(3)构建好的重组质粒长度共2 000 bp，用限制酶Hind Ⅲ及限制酶Hind Ⅲ和BamH Ⅰ分别对重组质粒进行切割并电泳，结果如图乙所示，可推测BamH Ⅰ在重组质粒上有____________个酶切位点。
(4)腺病毒载体疫苗是将S蛋白基因插入到改造后的腺病毒基因组中，该疫苗进入人体后，S蛋白基因利用人体细胞的蛋白质表达系统指导S蛋白的合成，其过程是__________________
___________________________________________________________(用文字和箭头表示)。
答案　(1)逆转录酶　模板DNA(目的基因片段)、四种脱氧核苷酸(或dNTP)、引物、耐高温的DNA聚合酶、缓冲液　低温下，引物能与相应互补DNA序列结合(引物通过碱基互补配对与单链DNA结合)　(2)30　(3)3　(4)S蛋白基因mRNAS蛋白
解析　(2)PCR 技术大量扩增目的基因时，消耗的引物个数计算公式为2n＋1－2，因此若一个该 DNA 分子在 PCR 仪中经过4次循环，需要消耗引物24＋1－2＝30(个)。(3)用Hind Ⅲ将质粒(2 000 bp)切割后形成了200 bp、400 bp和1 400 bp共3个片段，而用HindⅢ和BamH Ⅰ将质粒切割后形成了200 bp、420 bp、560 bp的片段，2 000＝420×2＋560＋200×3，所以一共形成了6个片段，共有5个酶切位点，因此 BamH Ⅰ 在重组质粒上有5－2＝3(个)酶切位点。

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