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第1节 植物细胞工程
第1课时：植物细胞工程的基本技术
第二章
课题1 菊花的组织培养
植物组织培养具有增殖效率高、繁殖速度快的特点,
可以用较短的时间和较少的空间生产出大量的试管苗.
菊花是菊科菊属的多年生宿根草本植物,是我国的传统名
花和世界四大切花之一
扦插
嫁接
压条
传统的繁殖方法
传统的繁殖方法易受环境影响,繁殖周期长,随着市场需求的急剧增加,已经不能满足市场日益发展的需要。
课题1
菊花的组织培养
学习目标：
1、掌握植物组织培养的原理
2、学会菊花或其他植物的组织培养
重 难 点：
植物组织培养过程中使用的无菌技术
（1）细胞的分化
①概念：
在个体发育中，相同细胞的后代在形态、结构、生理功能上发生稳定性差异的过程 .
②特点：
持久性
稳定性
普遍性
不可逆性
相关知识回顾
④原因：
基因的选择性表达的结果.
③结果：
形成不同的细胞和组织
（2）细胞的全能性
①定义：
生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体潜能的特性.
②原理：
生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质。
高度特化的动物细胞，从整个细胞来说，全能性受到限制。但它的细胞核仍然保持着全能性。
已分化的植物细胞，仍具有全能性.
③实例
受精卵>生殖细胞>体细胞
④全能性的比较:
自学回答
一、植物组织培养的基本过程。
1、植物组织培养概念，原理、过程？ （书P32）
2、细胞分化、脱分化（去分化）、再分化、全能性的理解？
3、外植体概念（书P34）、愈伤组织三个特点？
4、植物组织培养过程比较？
（一）植物组织培养的基本过程
1.概念：在无菌和人工控制条件下，将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工配置的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。
基础知识
3.表达条件：
2.原理：
植物细胞的全能性
1、离体条件
2、无菌操作
3、适宜物质的诱导和调节（植物激素）
4、适宜的营养物质
5、温度、酸碱度、光照等条件的控制
3.植物组织培养过程:
（胚状体，
丛芽等）
外植体
由高度分化的植物器官、组织或细胞
产生愈伤组织的过程，又称去分化
细胞排列疏松而无规则,是高度液
泡化的、成无定形状态的薄壁细胞
脱分化产生的愈伤组织在培养过程
中重新分化根或芽等器官的过程
人参的愈伤组织
菠萝的愈伤组织
3.植物组织培养过程:
离体组织或细胞
植物体
脱分化
细胞分裂素≈生长素
愈伤组织
芽
根
细胞分裂素>生长素
细胞分裂素<生长素
再分化
不需要光
需要光(叶绿素形成需要光,幼
苗后需光进行光合作用）
如何控制细胞的脱分化与再分化？
培养过程中所使用的植物激素的比例
（1）培育无病毒植株
（2）大规模培养愈伤组织（提取紫草素，治疗烫伤和割伤的药物以及染料和化妆品的原料）
（4）基因工程中亦需用到植物组织培养的方法
（受体细胞为植物细胞）
4.应用：
（3）人工种子（解决有些作物品种繁殖能力差，结子困难或发芽率低等问题）
(二)、影响植物组织培养的因素
（1）植物材料的选择
烟草和胡萝卜的组织培养较为容易
枸杞愈伤组织的芽诱导比较难
②同一植物材料的年龄、保存时间的长短会影响实验结果
菊花的组织培养一般选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝
①不同植物的组织培养难度不同
为何选取生长旺盛嫩枝进行组培？
（一般来说，容易进行无性繁殖的植物容易进行组织培养）
生理状态好，容易诱导脱分化和再分化
（2）离体的植物组织和细胞对营养、环境等条件的要求相对特殊，需配置不同的培养基
常用的MS培养基主要成分包括：
A、大量元素: N、P、 S 、 K、Ca、Mg等
B、微量元素:B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、Co等
C、有机物：甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖等
D、植物激素：生长素、细胞分裂素、赤霉素等
讨论：你能说出各种营养物质的作用吗？同专题2中微生物培养基的配方相比，MS培养基的配方有哪些明显的不同？
答：微量元素和大量元素提供植物细胞生活所必需的无机盐；蔗糖提供碳源，同时能够维持细胞的渗透压；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的特殊营养需求。
微生物培养基以有机营养为主,不含植物激素。与微生物的培养不同，MS培养基则需提供大量无机营养，无机盐混合物包括植物生长必须的大量元素和微量元素两大类，一般含植物激素。
①常用的植物激素：生长素、细胞分裂素和赤霉素
生长素类：
2，4－二氯苯氧乙酸（2，4－D）、吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）
细胞分裂素类：
激动素（KT）、6－苄基嘌呤（ 6－BA）、玉米素（ZT）
赤霉素类：
赤霉酸（GA3）
（3）植物激素的影响
②生长素和细胞分裂素作用
植物中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强的趋势
使用顺序 实验结果
先使用生长素，后使用
细胞分裂素
有利于细胞分裂，
但不利分化
先使用细胞分裂素后
使用生长素
细胞既分裂也分化
同时使用
分化频率高
生长素
细胞分裂素：
>
有利于根的分化，抑制芽的形成
生长素
细胞分裂素：
<
有利于芽的分化，抑制根的分化
生长素
细胞分裂素：
＝
促进愈伤组织生长
③生长素和细胞分裂素同时使用时，用量的比例对植物细胞发育方向的影响
比值高
比值低
比值适中
使用顺序 实验结果
先使用生长素，后使用细胞分裂素 有利于细胞分裂，但不利分化
先使用细胞分裂素后使用生长素 细胞既分裂、也分化
同时使用 分化频率高
使用比例 实验结果
生长素
细胞分裂素
>
生长素
细胞分裂素
<
生长素
细胞分裂素
＝
有利于根的分化
有利于芽的分化，抑制根的分化
促进愈伤组织生长
3、不同植物激素使用顺序
4、不同植物激素使用量
常用的植物激素：
生长素、细胞分裂素是 的关键性激素
在生长素存在的情况下， 的作用呈加强的趋势
激素的 影响植物细胞的发育方向
小结：植物激素的影响
生长素、细胞分裂素
启动细胞分裂、脱分化和再分化
细胞分裂素
使用顺序、使用的量及比例
（4） pH、温度、光照
（不同的植物对各种条件的要求往往不同）
pH=5.8
温度控制在18—22℃
每日光照12h
（5）消毒
在培养的整个过程中，都需要是一个无菌环境
如菊花组织培养所需条件：
（一）制备MS固体培养基
（二）外植体消毒
（三）接种
（四）培养
（五）移栽
（六）栽培
二、实验操作
（一）制备MS固体培养基
MS培养基包括20多种营养成分，实验室一般使用4℃保存配制好的培养基母液来制备
1、配制各种母液
①无机物中大量元素浓缩10倍，微量元素浓缩100倍，常温保存
②激素类、维生素类以及用量较小的有机物一般可按1mg/ml的质量浓度单独配制成母液
③用母液配制培养基时，需要根据各种母液的浓缩倍数，计算用量
注意：配制各种母液时要防止在混合盐类时产生沉淀，母液保存时间不宜过长，最好在一个月内用完，发现有霉菌或沉淀出现，就停止使用。
2、配制培养基
分装到锥形瓶中，每瓶分装50ml或100ml
① 配制培养液
② 调PH=5.8
③培养基的分装
由于菊花的茎段的组织培养比较容易，因此不必添加植物激素
3、灭菌
分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽灭菌
注意使用母液前要先摇匀，移液用的的移液管和量筒需清洗两次，以免造成误差
1、选材：菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝.
（二）外植体消毒
2、消毒
①流水冲洗
菊花茎段用流水冲洗后可少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗20min左右.
② 酒精处理
用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为70％的酒精中摇动2－3次，持续6－7s，立即将外植体取出，在无菌水中清洗.
③消毒液处理
取出后仍用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入质量分数为0.1％的氯化汞溶液中1－2min，取出后在无菌水中至少清洗3次，漂净消毒液.
在此消毒过程中，是不是强度越大越好，
为什么？
不是。对外植体进行表面消毒时，既要考虑
到药剂的消毒效果，又要考虑到植物的耐受
力。
（三）接种
污染的主要来源是空气中的细菌和孢子，接种室消毒是至关重要的。用70％的酒精喷雾使空气消毒， 酒精或新洁尔灭搽洗工作台并用紫外线照射20分钟
1、接种室消毒
2、无菌操作要求
操作要在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械后，都需要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。
3、材料的切取和接种
植物组织培养过程中，哪些可能带菌？如何灭菌？
A. 操作者双手
B. 外植体
C. 培养基
D. 接种用的解剖刀，镊子等
E. 接种室
-------高压蒸汽灭菌
------酒精、次氯酸钠
-----------酒精
-----酒精、酒精灯灼烧
-----------紫外灯
4、接种注意事项
①每接种一块外植体前，镊子需放入体积分数为75％的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种.
②外植体在培养基中要分布均匀，放置外植体数量根据锥形瓶的大小确定，一般胡萝卜3－4块，菊的茎或叶6－8块，也不要太少，以充分利用培养基中的营养成分和光照条件.
③插入时应注意方向，不要倒插。茎段、茎尖基部插入培养基利于吸收水分和养分.
（四）培养
接种后的锥形瓶最好放在无菌箱中培养，培养期间应定期消毒
培养温度控制在18-22℃
每日用日光灯光照12h
培养时，一般会先诱导生芽培养，然后通过稀释再诱导生根。如果次序颠倒，先诱导生根，则不易诱导生芽
（五）移栽
移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养瓶的封口膜，让试管苗在培养间生长几日
1、打开封口膜
2、清洗转移
用流水清洗根部的培养基，将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境下生活一段时间,此目的是进行壮苗处理，使试管苗逐步适应外界环境的做法
3、移栽
幼苗长壮后，移栽到土壤中
固体基质型，含水量高、
蓄水性强、透性好，适合栽培
珍珠岩 ,珍珠岩是一种火山喷发的酸性熔岩，经急剧冷却而成的玻璃质岩石，有弧形或圆形裂隙，如珍珠的结构，所以被命名为珍珠岩 。
蛭石是一种天然、无毒的矿物质，在高温作用下会膨胀的矿物。它是一种比较少见的矿物，属于硅酸盐。
（六）栽培
幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗的生长情况，适时浇水、施肥，直至开花
制备MS固体培养基
外植体消毒
接种
培 养
栽 培
小结：
移 栽
冲洗—酒精—无菌水冲洗—氯化汞—无菌水冲洗至少三次之上
配制各种母液
配制培养基
灭毒
1、培养基的灭菌（高压蒸汽灭菌）
2、外植体的消毒（酒精、氯化汞）
3、接种的无菌操作（酒精、酒精灯——灼烧）
4、无菌箱中的培养；
5、移栽到消过毒的环境中生存一段时间。
思考1：在整个操作过程中，是如何来
实现无菌环境的？
正常苗
污染苗
1、外植体带菌
2、培养基及接种器具灭菌不彻底
3、接种操作时带入
4、环境不清洁
污染途径
思考2：你打算做几组重复？你打算设置对照实验吗？
答：每种材料或配方至少要做一组以上的重复。设置对照实验可以取用一个经过灭菌的装有培养基的锥形瓶，与接种操作后的锥形瓶一同培养，用以说明培养基制作合格，没有被杂菌污染。
结果分析与评价
（一）对接种操作中污染情况的分析
（二）是否完成了对植物组织的脱分化和再分化
（三）是否进行了统计、对照与记录
（四）生根苗的移栽是否合格
课题延伸
1、一般来说，容易进行无性繁殖的植物，也容易进行组织培养
2、实例：芦荟、豆瓣绿、秋海棠、月季
作业：P36　
1、在植物组织培养过程中，为什么要进行一系列的消毒、灭菌，并且要求无菌操作。
2、在选取菊花茎段是，为什么要选取生长旺盛的嫩枝？
外植体的生理状态是成功进行组织培养的重要条件之一。生长旺盛的嫩枝生理状况好，容易诱导脱分化和再分化。
植物组织培养所利用的植物材料体积小、抗性差，对培养条件的要求较高。用于植物组织培养的培养基同样适合于某些微生物的生长，如一些细菌、真菌等的生长。而培养物一旦受到微生物的污染，就会导致实验前功尽弃，因此要进行严格的无菌操作。
菊花的组织培养
再分化
材料性质、营养物质、
调节物质、环境条件
外植体的消毒
接种
基本原理:
细胞的全能性
基本过程:
脱分化
愈伤组织
影响因素：
操作流程：
配制MS固体培养基
培养
移栽
栽培
练习1、 基因型为AaBb的水稻（含24条染色体）的花药通过无菌操作接入试管后，在一定条件下形成试管苗，问：
（1）愈伤组织是花粉细胞不断分裂后形成的不规则的细胞团，愈伤组织形成过程中，必须从培养基中获得_____________等营养物质。
（2）要促进花粉细胞分裂生长，培养基中应有_____________和_____________两类激素。
水、无机盐、维生素和小分子有机物
细胞分裂素 植物生长素
（3）愈伤组织分化是指愈伤组织形成芽和根，再由芽发育成叶和茎。这一过程必须给予光照，其原因是_____________能利用光能制造有机物，供试管苗生长发育。
（4）试管苗的未分裂细胞细胞核中含_________条脱氧核糖核苷酸链。
（5）培育成的试管苗可能出现的基因型有_____________。
答案：（3）叶绿体 （4）24
（5）AB、aB、Ab、ab
再见

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