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Fermentation Engineering
第1章 发酵工程
Fermentation Engineering
任课教师：XXX
第2节 微生物的培养技术及应用
一起生物课件
CONTENTS
微生物的选择培养和计数
SELECTION, CULTIVATION, AND ENUMERATION OF MICROORGANISMS
第 2 课时
学习目标
通过实例，理解各类微生物都能适应其生活环境。
生命观念
根据微生物的代谢类型，配制选择培养基，
总结分离微生物的过程和测定微生物数量的常用方法。
科学思维
通过对土壤中分解尿素的细菌进行分离和计数，
理解并掌握微生物计数的方法。
科学探究
自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合的菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。该怎么办呢？
这是因为水生栖热菌能在 70-80 ℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
为什么水生栖热菌能从热泉中被筛选出来呢？
以上例子给我们在分离纯化微生物带来什么启示？
实验室中，人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度和pH等) ，同时抑制或阻止其他微生物的生长，从而筛选特定的微生物。
根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌( Thermus aquaticus)，进而从这种菌中提取出耐高温的DNA聚合酶。这种酶目前已被广泛用于体外扩增DNA片段的聚合酶链式反应(PCR)。
问题探讨
讨 论
人为提供有利于目的菌生长，同时抑制或阻止其他微生物生长的条件，进行实验室微生物的筛选。
选择培养基
耐寒微生物
石油分解菌
被石油污染的土壤
冰川冻土层
PART01
选择培养基
一、选择培养基
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。
在培养基中加入分离对象“嗜好”的营养物质。
(投其所好)
定 义
类 型
实 例
加富性选择培养基
1
在培养基中加入分离对象对能够抵抗的某种抗菌物质。
(取其所抗)
抑制性选择培养基
2
水生栖热菌
水生栖热菌的应用
1
耐高温DNA聚合酶
提取
筛选原理
2
用于
PCR
水生栖热菌能在70~80℃高温条件下生存，绝大多数微生物在此条件下不能生存。
一、选择培养基
分离酵母菌、霉菌等真菌
分离固氮菌
分离自养型微生物
金黄色葡萄球菌
常见的选择培养基
加入青霉素的培养基
1
不加氮源的无氮培养基
2
不加含碳有机物的无碳培养基
3
加高浓度食盐
4
培养基 + 氨苄青霉素
培养基
一、选择培养基
怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌
具有抗氨苄青霉素能力的菌落
长出各种
各样的细菌
没有抗氨苄青霉素能力的菌落被淘汰
一、选择培养基
项目 选择培养基 鉴别培养基
原理
用途
举例
图示
尿素分解菌
大肠杆菌
加入某种指示剂或化学药品（不影响微生物正常生长），使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应
培养、分离出目标微生物
鉴别目标微生物
培养酵母菌和霉菌时，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌的生长；
利用以尿素为唯一氮源的培养基来培养可分解尿素的细菌
可用伊红美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否含有大肠杆菌(若有，则菌落呈黑色)
加入不影响甚至促进目标微生物生长，而抑制或阻止其他种类微生物生长的化学物质
拓展延伸
一、选择培养基
怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？
应该设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数菌多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。
基础培养基
选择培养基
VS
那么如果让你分离土壤中分解
尿素的细菌，你会如何设计呢？
一、选择培养基
尿素[CO(NH2)2]含氮量高，化学性质相对稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，NH3再转化为NO3-，NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可以为细菌生长的氮源。
CO(NH2)2 + H2O
CO2 + 2NH3
脲酶
选择培养基配方的设计
转化
NH4+
NO3-
配方
一、选择培养基
设计一种选择培养基，用尿素作为唯一氮源，可以将分解尿素的细菌分离出来。
这种培养基与普通培养基相比，只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。
葡萄糖 10.0 g
尿素 1.0 g
KH2PO4 1.4 g
Na2HPO4 2.1 g
MgSO4·7H2O 0.2 g
琼脂 15.0 g
蒸馏水 1000ml
如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解
尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
讨论1
该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
讨论1
PART02
微生物的选择培养
二、微生物的选择培养
方 法
稀释涂布平板法
将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
基本操作
A、梯度稀释菌液 B、涂布平板
稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。
要对土壤进行充分稀释，然后再将菌液涂布到制备好的选择培养基上。
分离：获得分解尿素的细菌的纯培养物
计数：测定分解尿素的细菌的数量
1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？
由于土壤细菌的数量庞大，怎么获得所需特定微生物的纯培养物呢？
二、微生物的选择培养
操作步骤
细菌宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大部分分布在距地表 3~8 cm的土壤层。铲去表层土 3 cm左右，取样，将样品装入事先准备好的信封中。
土壤取样
1
取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。
操作完成后，一定要洗手。
注 意
二、微生物的选择培养
操作步骤
样品的稀释（梯度稀释菌液）
2
1×10
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1×102
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
9 mL
无菌水
90mL无菌水
10g
将 10g土样加入盛有 90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。取 1mL上清液加入盛有 9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
二、微生物的选择培养
操作步骤
涂布平板
3
取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
1
将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
2
将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
3
用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
4
微量移液器
二、微生物的选择培养
操作步骤
涂布平板
3
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入恒温箱培养。
5
各梯度分别涂布3个平板（重复实验）1个不涂布作空白对照。
注 意
二、微生物的选择培养
特别提醒
10g土样加入盛有90mL无菌水中后，已稀释10倍，计算时，不要忽略；
1
由于使用的是选择培养基，所以一般情况下，获得的单菌落即目的菌，但因为有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖，所以还需要
进一步验证；
2
过程中所有操作都应在酒精灯火焰旁进行；
3
将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在
火焰上灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
4
二、微生物的选择培养
操作步骤
培养与观察
4
恒温培养箱
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30-37℃的恒温培养箱中，培养1-2d。
稀释
103倍
稀释
104倍
稀释
105倍
空白对照
二、微生物的选择培养
培养时要将一个未接种的培养基和一个已接种的培养基放在
一起培养，为什么？
培养未接种的培养基的作用是对照。
未接种的培养基在恒温箱中保温一段时间后，如果无菌落生长，
说明培养基制备成功、合格，未受到污染。
未接种的培养基表面是否有菌落生长很关键，如果无菌落生长，
说明了什么？
二、微生物的选择培养
比较 平板划线法 稀释涂布平板法
工具 接种环 涂布器
原理 在数次划线后培养，可以分离到由一个细菌细胞繁殖而来的肉眼可见的细胞群体，即菌落。 在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细菌细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。
特点 方法简单，但不适宜计数。 单菌落更易分开，可以计数，但操作复杂。
结果
共同点 使培养基上形成由单个细菌细胞繁殖而来的子细胞群体——菌落
常用微生物分离方法比较
PART03
微生物的数量测定
1. 间接计数法——稀释涂布平板法
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
① 一般选择菌落数为30～300的平板计数。
②在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，
然后求出平均值。
③ 适当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。
① 统计的菌落数往往比活菌的实际数目少；
② 统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
1. 原 理
2. 计数原则
3. 结果分析
原因：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
例1. 某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) ( )
A. 2.34×108 B. 2.34×109 C. 234 D. 23.4
1. 间接计数法——稀释涂布平板法
4. 计算公式
每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M
C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；
V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)；
M：代表稀释倍数。
234 ÷ 0.1×106
B
可以用来测定土壤、水、食品等样品中的细菌、酵母菌、芽孢和孢子等的数量，但不适于测定样品中的放线菌、丝状真菌等丝状体
微生物的数量。
5. 使用范围
利用特定的______________或_______________在________下观察、计数，然后再计算__________的样品中微生物的数量；
2.直接计数法——显微镜直接计数
为了避免上述缺点，可以染色后进行显微镜计数。
① 统计结果一般是________________________不能区分死菌与活菌。
② 个体小的细菌在显微镜下难以观察。
细菌计数板
血细胞计数板
显微镜
一定体积
快速直观
活菌数和死菌数的总和
设备简单，能观察微生物的形态特征。
1. 原 理
*血细胞计数板常用对相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等；
*细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数；
2. 优 点
__________
3. 缺 点
2.直接计数法——显微镜直接计数
4. 计数方法
每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数 × 400 × 10000 × 稀释倍数
计数区
放大后的计数室
统计结果一般是活菌数和死菌数的总和。（“染色排除法”）
注 意
PART04
土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
四. 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
① 从土壤中分离出能够分解尿素的细菌
② 统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成_____的微生物才能分解尿素，利用 的 培养基，可以从土壤中分离出 的细菌。
脲酶
以尿素作为唯一氮源
选择
分解尿素
1. 实验目的
2. 实验原理
常见的分解尿素的微生物：芽孢杆菌、小球菌、棒状杆菌等细菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。
CO(NH2)2 + H2O 2NH3 + CO2
脲酶
四. 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
样品稀释
涂布平板
微生物的
培养与观察
菌落计数
土壤取样
制备培养基
1
2
3
4
5
实验流程
四. 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
3. 实验步骤
注意事项：
取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
① 取样地点要求：酸碱度接近中性的潮湿土壤。细菌适宜在该环境中生长。
②取样过程：铲去表层土（一般3cm左右）。细菌绝大部分分布在距地表
3～8 cm的土壤层。
土壤取样
1
制备培养基
2
①选择培养基：
以尿素为唯一氮源
②牛肉膏蛋白胨培养基：
作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用
四. 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
3. 实验步骤
制备培养基
2
①选择培养基：
以尿素为唯一氮源
②牛肉膏蛋白胨培养基：
作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用
注意事项：
取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
① 取样地点要求：酸碱度接近中性的潮湿土壤。细菌适宜在该环境中生长。
②取样过程：铲去表层土（一般3cm左右）。细菌绝大部分分布在距地表
3～8 cm的土壤层。
土壤取样
1
样品的稀释与涂布平板
3
不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间适于计数的平板。
① 测细菌数：一般用104、105、106稀释液
进行平板培养。
② 测放线菌数：一般用103、104、105稀释液。
③ 测真菌数：一般用102、103、104稀释液。
四. 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
3. 实验步骤
样品的稀释与涂布平板
3
制备培养基
2
①选择培养基：
以尿素为唯一氮源
②牛肉膏蛋白胨培养基：
作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用
不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间适于计数的平板。
① 测细菌数：一般用104、105、106稀释液
进行平板培养。
② 测放线菌数：一般用103、104、105稀释液。
③ 测真菌数：一般用102、103、104稀释液。
四. 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
3. 实验步骤
样品的稀释与涂布平板
3
在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？
思考
选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的
平板进行计数。
四. 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
本实验实验组和对照组设计如下
组别 具体组别 具体操作 作用
实验组 实验组1 涂布接种的选择培养基 三次重复排除偶然因素对实验
结果的影响，用以分离并计数
能分解尿素的细菌。
实验组2 涂布接种的选择培养基
实验组3 涂布接种的选择培养基
实验组4 涂布接种的牛肉膏蛋白胨培养基 实验组4与实验组1 、2、3组对比用以验证选择培养基是否具有选择作用。
对照组 对照组1 不涂布接种的选择培养基 对照组1与实验组1 、2、3组对比用以验证选择培养基中是否含有杂菌。
对照组2 不涂布接种的牛肉膏蛋白胨培养基 对照组2与实验组4 对比用以验证牛肉膏蛋白胨培养基中是否含有杂菌。
实验结果 实验组1、2、3分离得到尿素分解菌的单菌落； 第4组得到多种菌落； 第5、6组正常情况下无菌落。
四. 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
3. 实验步骤
样品的稀释与涂布平板
3
① 培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。
细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。
② 观察：每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
③ 一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。
四. 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
3. 实验步骤
样品的稀释与涂布平板
3
如果1个平板的计数结果与另 2个相差太远(不在30~300范围内)，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。
注意事项：
本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等；
四. 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
4. 结果分析与评价
如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。如果接种后的完全培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。
结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基
是否筛选出一些菌落。
1
如果得到了两个或多个菌落数为30～300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。
你是否获得了某一稀释度下菌落数为30~300的平板？在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近？
2
如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。
你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学统计的结果接近吗？如果差异很大,可能是什么原因引起的？
3
四. 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
4. 结果分析与评价
如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。如果接种后的完全培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。
结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基
是否筛选出一些菌落。
1
如果得到了两个或多个菌落数为30～300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。
你是否获得了某一稀释度下菌落数为30~300的平板？在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近？
2
如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。
你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学统计的结果接近吗？如果差异很大,可能是什么原因引起的？
3
四. 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
5. 进一步探究
本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌,对分离的菌种进行鉴定还需要借助
生物化学的方法。你可以查阅相关资料,进一步设计实验来鉴定自己分离的菌种。
细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌。
脲酶的检测
原 理
四. 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
5. 进一步探究
方 法
在以尿素为唯一氮源的培养 基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红。这样，我们就可以初步鉴定该种细菌能够分解尿素。
液体培养基：
可以直接看液体的变色情况。
固体培养基：
可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。
PART05
课题测验
课题测验
1
研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。
① 这种培养基是一种选择培养基。（ ）
② 利用这种石油降解菌可以降解石油。修复土壤。（ ）
③ 相对于未被污染的土壤,从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。（ ）
用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数,原因是（ ）
A. 菌落中的细菌数目是固定的
B. 平板上的一个菌落就是一个细菌
C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同
D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
2
√
√
√
D
课题测验
3
反刍（chú）动物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。
反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基，还应该参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。
答：
课题测验
3
地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中 40% ~ 60% 能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用精杆等生产酒精，用纤维索酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维索被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈(如下图所示)。
你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？
提示：纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，采集土样时，可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。

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