资源简介

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胞
动
物
细
动物细胞培养
第1课时
Animal cell culture
授课教师：XXX
第2章 细胞工程
生命观念
运用稳态与平衡观，分析动物细胞培养的条件。
学习目标
科学思维
采用归纳与概括、演绎与推理等方法，用文字和图示说明动物细胞培养的过程。
社会责任
对干细胞培养用于人类疾病治疗等社会热点问题进行科学评价。
2.动物细胞工程的发展历程
1890年
首例胚胎移植成功
1907年
首创动物组织体外培养法
1951年
发现哺乳动物精子获能现象
1958年
体细胞核移植成功
1981年
分离和培养小鼠胚胎干细胞
1978年
胚胎分割移植成功
1975年
创立单克隆抗体技术
1959年
试管家兔诞生
1996年
克隆羊多莉诞生
2006年
获得诱导多能干细胞
2014年
单细胞基因组测序进行遗传病筛查的试管婴儿诞生
2017年
我国科学家首次培育了体细胞克隆猴。
动物细胞工程常用的技术
动物细胞培养
动物细胞工程的基础
动物细胞融合
动物细胞核移植
克隆皮肤
单克隆抗体
克隆猴：中中和华华
从社会中来
小面积烧伤：患者通过切除 + 植皮(自身)后恢复。
大面积烧伤？
皮肤的自体移植
使用他人皮肤如何？
患者自身的不够用，如何解决？
培养自身细胞？
通过细胞培养
构建的人造皮肤
目前，科学家还在研究对皮肤干细胞进行培养，以获得适合临床上使用的人造皮肤。
动物细胞培养
1、概念
指动物机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞，然后，
放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和繁殖的技术。
2、原理
细胞增殖(有丝分裂)
3、培养对象
胚胎或幼龄动物的细胞
4、目的
获得细胞或者细胞产物
5、地位
动物细胞工程的基础
胚胎或幼龄动物的细胞较成体的细胞更易培养，因为这些组织或细胞的生命力旺盛，分化程度低，分裂能力强，容易培养
一、动物细胞培养的条件
糖类、氨基酸
无机盐、维生素… …
无菌、无毒的环境
适宜的温度、pH和渗透压
适宜的气体环境
+
合成培养基
血清
人们对细胞所需的营养物质尚未全部研究清楚，在使用合成培养基时，通常需要加入血清等一些天然成分。
一般使用液体培养基，也称培养液。
如何维持无菌、无毒的环境？
适宜的温度、pH和渗透压分别是多少？
适宜的气体环境包括？分别有什么作用？如何保持该气体环境？
环境、培养液、培养环境；定期更换培养液；抗生素等
温度：（36.5±0.5）℃ pH7.2-7.2 适宜的渗透压
95%空气和5%CO2;培养皿或松盖培养瓶。
动物细胞培养所需基本条件
营养条件
其他条件
一、动物细胞培养的条件
糖类、氨基酸
无机盐、维生素… …
动物细胞培养所需基本条件
营养条件
其他条件
1、营养条件
合成培养基
将细胞所需的上述营养物质按其种类和所需量严格配制而成的培养基，称为合成培养基。
☆通常需加入血清和血浆等一些天然成分。
培养动物细胞一般用液体培养基，也称培养液。
无菌、无毒的环境
适宜的温度、pH和渗透压
适宜的气体环境
一、动物细胞培养的条件
2、无菌、无毒的环境
无菌：无菌操作—防止培养过程中的微生物污染；培养液中添加抗生素。
无毒：定期更换培养液—清除代谢产物，防止代谢产物积累对细胞造成危害。
3、温度、pH和渗透压
4、气体环境
温度：36.5±0.5℃
pH：7.2-7.4
渗透压：维持细胞正常形态
用培养皿或松盖培养瓶，在95%空气和5 %CO2 的混合气体的CO2培养箱中进行培养。
气体的组成及作用：
O2：
CO2：
细胞代谢所必需
维持培养液的pH
二、动物细胞培养的过程
用机械的方法，或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理的方法，将组织分散成单个细胞
放入CO2培养箱中培养
取动物组织
制成细胞悬液
原代培养
原代培养
放入CO2培养箱中培养
取动物组织
制成细胞悬液
转入培养液进行原代培养
分瓶
进行传代培养
细胞贴壁
接触抑制
二、动物细胞培养的过程
取动物组织
分散成单个细胞
悬浮生长
贴壁生长
(大多数）
细胞密度过大、有害代谢物积累、营养物质缺乏等
接触抑制
传代培养
用机械法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理
细胞悬液
解决
原代培养
分瓶
培养
①原代培养：指动物组织经处理后的初次培养。
②细胞贴壁：某些细胞需要贴附于某些基质表面才能增殖，这类细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上。
③接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞停止分裂增殖的现象。
④传代培养：分瓶后的细胞培养。
加培养液
在培养皿或培养瓶内
悬浮培养的细胞：直接用离心法收集
贴壁细胞：用胰蛋白酶处理分散成单个细胞，用离心法收集
细胞分裂受阻
②制成细胞悬液，分瓶培养
①收集细胞
二、动物细胞培养的过程
（一）取动物组织：
1.取材：动物胚胎或幼龄动物的组织、器官
2.原因:
细胞分化程度低，增殖能力强，容易培养
（二）制成细胞悬液：
1.将组织分散成单个细胞
①方法:
机械法、或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理
②原因:
a.从动物体取出的成块组织中，细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长和增殖；
b.能使细胞与培养液充分接触，更易进行物质交换。保证细胞所需的营养物质、氧气及代谢物的及时排出。
2.用培养液将细胞制成细胞悬液，再将细胞悬液放入培养皿或培养瓶。
培养瓶或培养皿要求：内表面光滑、无毒、易于贴附。
二、动物细胞培养的过程
★体外培养动物细胞分为两类
悬浮生长细胞
细胞能够悬浮在培养液中生长增殖
贴壁生长细胞
细胞需要贴附于某些基质(如培养瓶壁)表面才能增殖(主要类型)
悬浮培养瓶
细胞的接触抑制：细胞在贴壁生长过程中，随着细胞分裂，数量不断增加，最后形成一个单层，此时细胞间相互接触，细胞分裂和生长停止，数量不再增加。
这时就需要对细胞进行分瓶培养，让细胞继续增殖。
二、动物细胞培养的过程
思考：“细胞增殖到互相接触的时候，糖蛋白识别了这种信息，就会使细胞停止继续繁殖，出现接触抑制的现象”试结合上述解释，举例说明哪种细胞无接触抑制现象，并阐述原因。
癌细胞；癌细胞的细胞膜上糖蛋白等物质减少
细胞贴壁、接触抑制
二、动物细胞培养的过程
细胞由原代培养瓶中分离稀释后，转到新的培养瓶中继续培养的过程。(分瓶后的细胞培养 )
（三）原代培养、传代培养：
1.概念
2.步骤
收集细胞
a.悬浮生长类：
直接用离心法收集
b.贴壁生长类：
重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞， 然后再用离心法收集
将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养
出现接触抑制，分瓶培养
获取动物组织器官
将动物组织块剪碎
胰蛋白酶
处理制成细胞悬液并培养
二、动物细胞培养的过程
①第一次：用胰蛋白酶对剪碎的动物组织进行处理，使其分散成单个细胞后进行培养，为原代培养。
②第二次：细胞培养过程中出现接触抑制，用胰蛋白酶使其从瓶壁上脱离下来，然后，将其分散到多个培养瓶中继续培养，为传代培养。
思考：正常细胞能否一直传代培养下去？
区分两种“培养”的关键是看用胰蛋白酶处理的对象。
二、动物细胞培养的过程
传代培养
部分细胞的细胞核型可能会发生变化，增殖缓慢，甚至完全停止
大部分细胞衰老死亡
少数细胞会克服细胞寿命的自然极限，获得不死性，这些细胞已经发生了突变，正朝癌细胞发展
10~50代
继续培养
（50代以后）
（有限细胞系）
（无限细胞系）
使用或保存的细胞通常为10代以内，以保持细胞正常的二倍体核型(遗传物质不改变)
这一阶段的细胞称为细胞株
细胞系的遗传物质一定改变了
二、动物细胞培养的过程
比较项目 植物组织培养 动物细胞培养
原理
培养基性质
培养基特有成分
培养结果
培养目的
相同点
植物组织培养和动物细胞培养的比较
获得细胞或细胞产物
常用固体培养基
植物体
葡萄糖、动物血清
常用液体培养基
细胞增殖
细胞的全能性
许多细胞
快速繁殖等
蔗糖、植物激素
1.培养过程中细胞都进行有丝分裂，不涉及减数分裂
2.均需无菌操作，需要适宜的温度、pH等条件
三、干细胞的培养及其应用
（3）分布
（1）概念
（4）分类
电镜下的胚胎干细胞
存在于早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中。
包括胚胎干细胞和成体干细胞等。
动物和人体内仍保留的少数具有分裂和分化能力的细胞。在一定条件下，干细胞可以分化成其他类型的细胞。
（2）特点
体积较小，细胞核大，核仁明显。
1.干细胞
三、干细胞的培养及其应用
①胚胎干细胞（简称 ES 细胞）
a.分布：
存在于早期胚胎中
b.特点：
具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。
c.实例：
ES细胞在体外分化成心肌细胞、神经元细胞和造血干细胞等
骨髓中的造血干细胞、神经系统中的神经干细胞、睾丸中的精原干细胞等；
②成体干细胞
a.分布：
存在于成体组织或器官内中
b.举例：
c.特点：
发现最早、研究最多的、应用最成熟的实例：造血干细胞；主要存在于成体的骨髓、外周血和脐带血中
一般认为，成体干细胞具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力
（3）应用：
有着自我更新能力及分化潜能的干细胞，与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关。
三、干细胞的培养及其应用
诱导多能干细胞（iPS细胞）
（1）胚胎干细胞的局限性：
胚胎干细胞必须从胚胎中获取 ，涉及伦理问题；因而限制了在医学上的应用。
（2）iPS细胞概念：
通过体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞，称为诱导多能干细胞，简称iPS细胞。
（3）诱导方法：
①将特定基因或特定蛋白导入细胞（成纤维细胞以及已分化的T细胞、B细胞均可）；
②用小分子化合物诱导形成。
（4）iPS细胞优点：
①诱导过程无须破坏胚胎；
②iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应。
三、干细胞的培养及其应用
移植
取成纤维细胞等
iPS细胞
转入相关因子
细胞发生转化
分化
胰岛细胞
神经元
血细胞
肠上皮细胞
心肌细胞
肝细胞
病人
iPS细胞用于治疗人类疾病示意图
取成纤维细胞
转入相关因子
细胞转化为iPS细胞
诱导iPS细胞定向分化为多种组织细胞
移植回病人体内
（5）iPS细胞应用：
三、干细胞的培养及其应用
类型 应用
造血干细胞
神经干细胞
诱导多能干细胞（iPS细胞）
治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病
治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）
可治疗小鼠的镰状细胞贫血症，在治疗阿尔兹海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展
干细胞应用面临的问题存在存在着导致肿瘤发生的风险。
1.下列关于动物细胞培养的叙述，不正确的是( )。
A.使用合成培养基时，通常需要加入血清等一些天然成分
B.通常置于 %O2和 % 的混合气体的 培养箱中进行培养
C.渗透压也是动物细胞培养过程中需要考虑的一个重要环境参数
D.需要对培养液和所有培养用具进行灭菌处理以及在无菌环境下进行操作
B
[解析] 使用合成培养基时，通常需要加入血清等一些天然成分，以利于动物细胞生长，A正确；在进行动物细胞培养时，通常将动物细胞置于含有空气和的混合气体的培养箱中进行培养，B不正确；渗透压维持细胞形态，故渗透压也是动物细胞培养过程中需要考虑的一个重要环境参数，C正确；需要对培养液和所有培养用具进行灭菌处理以及在无菌环境下进行操作，防止污染，D正确。
2. 下列关于动物细胞培养过程的叙述，正确的是( )。
A.取新鲜动物组织后可用机械方法或酶处理，制成细胞悬液
B.可悬浮培养的动物细胞也会出现接触抑制，导致分裂受阻
C.分化程度高的动物细胞一般较分化程度低的细胞更容易培养
D.传代培养的过程中动物细胞可经历脱分化从而形成愈伤组织
A
[解析] 可用机械方法或酶（胰蛋白酶、胶原蛋白酶）处理新鲜动物组织，制成细胞悬液，A正确；贴壁生长的动物细胞会出现接触抑制，导致分裂受阻，悬浮培养的细胞会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻，B错误；分化程度低的动物细胞一般较分化程度高的细胞更容易培养，C错误；在植物组织培养中，才会发生外植体脱分化形成愈伤组织的过程，D错误。
3.小鼠的成纤维细胞经诱导可成为 iPS 细胞，为新型再生疗法带来了希望。下列叙述正确的是( )。
A.经诱导形成的 细胞增殖能力增强，分化能力减弱
B.分化后的细胞蛋白质种类和数量不变
C. 细胞属于成体干细胞
D.与囊胚内细胞团 细胞相比， 细胞用于再生医学可避免伦理争议
D
[解析] 经诱导形成的 细胞增殖能力增强，分化能力增强，A错误；由于基因的选择性表达，分化后的细胞蛋白质种类和数量可能会发生改变，B错误；细胞不属于成体干细胞，C错误； 细胞来源于早期胚胎，来源于体细胞，因此与细胞相比，细胞用于再生医学可避免伦理争议，D正确。

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