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(共40张PPT)
基因工程
GENETIC ENGINEERING
CHAPTER 3
第3章
授课老师 | XX老师
什么是基因工程？
从社会中来
DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？
讨论
基因工程
基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋子生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品，从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
基因工程
原理
意义
基因重组
① 定向改造生物性状
② 克服远缘杂交不亲和障碍。
基因工程
1.对基因工程概念的理解
基因工程的别名
重组DNA技术、转基因技术
操作环境
生物体外
操作对象
生物基因
操作水平
DNA分子水平
基本过程
剪切→拼接→导入→表达
基因工程
2.图解“基因工程实质”
A生物
B生物
萤火虫
普通动植物
发光基因
荧光树
荧光小鼠
学习目标
生命观念
科学探究
社会责任
运用结构与功能观，说明基因工程的各种工具的特点。
理解DNA粗提取与鉴定实验的原理，熟悉实验操作步骤，掌握相关试剂的使用方法。
关注基因工程的诞生和发展历程，参与讨论基础理论和技术发展促进基因工程的诞生和发展。
01
03
02
3.1 重组DNA技术的基本工具
限制性核酸内切酶
DNA连接酶
基因进入受体细胞的载体
“分子手术刀”
“分子缝合针”
“分子运输车”
限制性核酸内切酶的命名
大肠杆菌
用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。
限制酶是如何命名的呢？
Escherichia coli
从大肠杆菌的R型菌株分离来的，就用字母EcoR表示；如果它是从大肠杆菌R型菌株中分离出来的第一种限制酶，则进一步表示成EcoR I
流感嗜血杆菌
Haemophilus influenzae
流感嗜血杆菌d株中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:
Hind I
Hind II
Hind III
限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
来源
主要来自原核生物
种类
数千种
（限制酶不是一种酶，而是一类酶）
特点
一种限制酶能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。（因此具有专一性）
限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
作用部位
特定切点上的磷酸二酯键
识别序列长度
大多数是6个核苷酸序列
结果
产生黏性末端或平末端
双链DNA的结构和磷酸二酯键的位置示意图
磷酸二酯键
被限制酶切开的DNA切口处，带有几个伸出的核苷酸，这样的切口叫黏性末端。
限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
EcoRI 限制酶
大肠杆菌(E.coli)的EcoRⅠ限制酶能特异性识别_________序列，并切割___和___之间的___________。切割后产生__________。
GAATTC
G
A
磷酸二酯键
黏性末端
限制酶
限制酶
限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
SmaI 限制酶
SmaI 限制酶只能识别________序列，切割___和___之间_________切开，切割后产生________。
CCCGGG
C
G
平末端
磷酸二酯键
限制酶
限制酶
限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
写出下列限制酶切割形成的黏性末端
GATC
AATT
AGCT
GATC
不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端
总结
识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶。
同尾酶
限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
动脑思考
01 / 你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？
破坏外源DNA，保护自我
02 / 为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？
缺乏特定的核苷酸序列
如EcoRI 限制酶识别GAATTC，而细菌缺乏此序列
DNA连接酶—“分子缝合针”
作用
将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
DNA连接酶
DNA连接酶
DNA连接酶—“分子缝合针”
EcoRI DNA连接酶
① 只能将黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，不能连接具有平末端的DNA片段；
② 作用对象：两DNA片段要具有互补（或相同）的黏性末端才能拼起来。
作用结果：催化磷酸二酯键的形成，形成重组DNA
DNA连接酶可连接双链DNA中的DNA单链缺口，但不能将单个脱氧核苷酸连接到DNA链上！
DNA连接酶—“分子缝合针”
T4 DNA连接酶
既可以“缝合”DNA互补的粘性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但效率较低。
DNA连接酶—“分子缝合针”
类型 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源
功能 只缝合____________ 缝合____________和____________
结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_________________
大肠杆菌
T4噬菌体
黏性末端
黏性末端
平末端
磷酸二酯键
【思考】T4 DNA连接酶连接平末端的效率和连接黏性末端的效率相同吗？
不同，因为黏性末端的碱基是互补的，在连接时，黏性末端可以通过碱基互补配对，加快DNA连接酶的连接速度，而平末端则不能。
DNA连接酶—“分子缝合针”
DNA连接酶与DNA聚合酶的比较
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同点 作用实质
化学本质
不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
DNA连接酶—“分子缝合针”
总结归纳
几种相关酶的比较
名称
作用部位
作用结果
限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
解旋酶
磷酸二酯键
磷酸二酯键
磷酸二酯键
碱基对之间的氢键
将DNA切成两个片段
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
1.作用
将外源基因送入受体细胞，在受体细胞内对目的基因进行大量复制。
2.种类
种类
用途
不同点
来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别
质粒、噬菌体
植物病毒
动物病毒
将外源基因导入大肠杆菌
等受体细胞
将外源基因导入植物细胞
将外源基因导入动物细胞
基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
质粒
1.来源
质粒主要存在于细菌和真菌体内。
2.本质
独立于拟核或细胞核外，具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
有一个至多个限制酶切割位点，并含有一些抗生素抗性基因（如图）,如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等，这些基因可以作为鉴定和筛选重组DNA的标记基因。
大肠杆菌及质粒结构模式图
能复制并带着插入的目的基因一起复制
有标记基因的存在，可用含青霉素的培养基鉴别
基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
3.运载体需具备的条件
DNA
大肠杆菌细胞
质粒
目的基因插入位点
抗四环素抗性基因
控制质粒DNA转移的基因
复制原点
氨苄青霉素抗性基因
能够在宿主细胞中复制并稳定地保存
能使目的基因稳定存在且数量可扩增
有一个至多个限制酶切点
可携带多个或多种外源基因
有某些标记基因
便于重组DNA分子筛选
对受体细胞无害、易分离
有标记基因的存在，可用含青霉素的培养基鉴别
能复制并带着插入的目的基因一起复制
有切割位点
实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。
3.1 重组DNA技术的基本工具
课堂小结
基因工程的工具
限制酶
DNA连接酶
载体
①主要存在于原核生物中
②具有专一性(识别序列)
③切开DNA分子的磷酸二酯键
④产生黏末端或平末端
连接磷酸二酯键
种类
E.coliDNA连接酶
T4 DNA连接酶
质粒、噬菌体、动植物病毒等
具备的条件
①能在宿主细胞中自我复制
②并稳定存在
③具有一种至多种限制酶切点
④具有标记基因
探究实践
DNA的粗提取与鉴定
1.DNA粗提取的原理
提取原理
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
（1）DNA不溶于酒精溶液
DNA不溶于酒精溶液，但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可初步分离DNA与蛋白质。
探究实践
DNA的粗提取与鉴定
1.DNA粗提取的原理
（2）DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同
在 NaCl溶液中的溶解性：
DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA 充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。
0
DNA溶解度
NaCl浓度（mol/L）
0.14
2
探究实践
DNA的粗提取与鉴定
1.DNA粗提取的原理
（3） DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性
对酶的耐受性∶蛋白酶能水解蛋白质，但对DNA没有影响。
对温度的耐受性∶大多数蛋白质不能忍受60～80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性。
对洗涤剂的耐受性∶洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。
探究实践
DNA的粗提取与鉴定
1.DNA粗提取的原理
鉴定原理
DNA 的鉴定
在沸水浴的条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色。
探究实践
DNA的粗提取与鉴定
2.试剂及作用
体积分数为95%的冷酒精
析出DNA（即粗提取DNA）
2mol/L 的NaCl 溶液
溶解DNA（并去除部分杂质蛋白）
蒸馏水
滴入NaCl溶液中，使其浓度逐渐下降至0.14mol/L,从而析出DNA
二苯胺试剂
滴入NaCl溶液中，使其浓度逐渐下降至0.14mol/L,从而析出DNA
破坏细胞，释放出细胞内的物质
研磨液
溶解细胞膜、核膜，释放出细胞内含物。
使构成染色体的核蛋白加速解聚，游离出DNA分子，并使DNA分子充分溶解于NaCl溶液中。
食 盐：
洗涤剂：
探究实践
DNA的粗提取与鉴定
3.过程
Step 1
研磨
研磨不充分，会使DNA分子不能从细胞核中释放出来，从而影响提取的DNA含量
称取约30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。
探究实践
DNA的粗提取与鉴定
Step 2
过滤取上清液
直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。
方法一
在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。
方法二
探究实践
DNA的粗提取与鉴定
Step 3
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95%），静置2～3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或者将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干。
避免破坏DNA
析出DNA
探究实践
DNA的粗提取与鉴定
Step 3
析出DNA
冷却的酒精溶液(体积分数95％)作用
① 抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；
② 低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。
这一步的目的是蛋白质溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。
探究实践
DNA的粗提取与鉴定
Step 4
DNA的鉴定
取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
探究实践
DNA的粗提取与鉴定
Step 4
对照组
空白对照组
在等体积的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水浴中加热5min。
实验组
探究实践
DNA的粗提取与鉴定
课后习题
单选题
1. DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（ ）
A
能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B
能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C
能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D
只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端
C
课后习题
单选题
2. 在重组DNA技术中,将外源基因送入受体细胞的载体可以是（ ）
A
大肠杆菌的质粒
B
切割DNA分子的酶
C
DNA片段的黏性末端
D
用来识别特定基因的DNA探针
A
版权声明
课件版权归属“一起课件”，仅可自用，不可传播，不得用作商业性使用，不得上传至百度文库、等盈利网站。任何侵权行为将被视为版权侵害，侵权者将承担一定的法律责任。3.1 重组DNA技术的基本工具（同步检测）
一、选择题(本题有14小题，每小题5分，共70分)
1.如下图,两个核酸片段在适宜的条件下,经X酶的催化作用,发生下列变化,则X酶是(　　)
A.DNA连接酶　　　B.RNA聚合酶 C.DNA聚合酶　　D.限制酶
2.下列叙述正确的是(　　)
A.限制酶可作用于①部位,解旋酶作用于③部位
B.限制酶可作用于③部位,解旋酶作用于①部位
C.作用于①部位的限制酶同时也可以作用于④部位
D.作用于①部位的限制酶与作用于⑤部位的限制酶的碱基识别序列相反
3.下列关于几种酶的作用的叙述,错误的是(　　)
A.DNA连接酶能连接双链DNA片段
B.RNA聚合酶能与基因的特定位点结合,催化遗传信息的转录
C.一种限制酶能识别多种核苷酸序列,并切割出多种目的基因
D.DNA聚合酶能把单个脱氧核苷酸分子连接成一条DNA单链
4.基因工程中用来修饰、改造生物基因的工具是(　　)
A.限制酶和水解酶 B.限制酶和DNA连接酶
C.限制酶和载体 D.DNA连接酶和载体
5.下图是3种限制性内切核酸酶对DNA分子的识别序列和切割位点图(箭头表示切割位点,切出的断面为黏性末端)。下列叙述错误的是(　　)
A.不同的限制酶有不同的识别序列和切割位点,体现了酶的专一性
B.限制酶2和限制酶3的识别序列均为6个核苷酸
C.限制酶1和限制酶3切割得到的黏性末端相同
D.能够识别和切割RNA分子内一小段核苷酸序列的酶只有限制酶2
6.下列关于质粒的说法,正确的是(　　)
A.质粒在宿主细胞内都要整合到染色体DNA上
B.质粒是独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外的小型细胞器
C.基因工程使用的质粒一定含有标记基因和复制原点
D.质粒DNA中碱基之间的数量关系有A+G=U+C
7.下列关于DNA连接酶的叙述,正确的是(　　)
A.DNA连接酶需要模板,连接的是两条链碱基对之间的氢键
B.基因工程中可以用DNA聚合酶替代DNA连接酶
C.T4 DNA连接酶既可以连接黏性末端,又可以连接平末端
D.E.coli DNA连接酶只能连接平末端
8.作为基因工程中的“分子运输车”,载体应具备的条件有( 　)
①必须有一个至多个限制酶切割位点,以便目的基因插入其中　
②必须具备自我复制的能力,或整合到受体DNA上,随受体DNA同步复制　
③必须带有特殊的标记基因,便于重组DNA分子的筛选　
④必须是安全的,不会对受体细胞有害　⑤大小应合适,太大不易操作
A.①②③④　　B.①②③⑤ C.①②④⑤　　　D.①②③④⑤
9.基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是。根据下图判断下列操作正确的是(　　)
A.目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割
B.目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割
C.质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割
D.质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割
10.用限制酶EcoRⅠ、KpnⅠ和二者的混合物分别作用于一个1 000 bp(1 bp即1个碱基对)的DNA分子，同时对酶切产物分别进行凝胶电泳，在电场的作用下，酶切产物分开，凝胶电泳结果如图所示。该DNA分子的酶切图谱(单位：bp)正确的是(　　)
11.限制酶MunⅠ和限制酶EcoRⅠ的识别序列及切割位点分别是－ ATTG－和－ ATTC－。如图表示四种质粒和目的基因，其中，箭头所指部位为酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因运载体的质粒是(　　)
12.下列有关基因工程的叙述，正确的是(　　)
A.基因工程是细胞水平上的生物工程
B.基因工程的产物对人类都是有益的
C.基因工程育种的优点之一是目的性强
D.基因工程产生的变异属于人工诱变
13.下列有关E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶作用的叙述，正确的是(　　)
A.T4 DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来
B.E.coli DNA连接酶只能将双链DNA片段平末端之间进行连接
C.T4 DNA连接酶既可以“缝合”黏性末端，又可以“缝合”平末端
D.E.coli DNA连接酶连接平末端的效率比较低
14.下列有关限制酶和DNA连接酶的叙述，错误的是(　　)
A.一种限制酶只能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列
B.DNA连接酶可催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键
C.E.coli DNA连接酶是从大肠杆菌中分离出来的，它只能连接黏性末端
D.T4 DNA连接酶既可连接黏性末端，也可连接平末端，但连接黏性末端的效率较低
二、非选择题(本题有2小题，共30分)
15.（14分）根据基因工程的有关知识,回答下列问题。
(1)限制酶切割DNA分子后产生的片段,其类型有　　　　　　和　　　　　　。
(2)用EcoRⅠ切割质粒后产生的片段如下:
AATTC……G
G……CTTAA
为使载体与目的基因相连,含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外,还可用其他限制酶切割,其他酶必须具有的特点是　　　　　　　　　　　　。
(3)按其来源不同,基因工程中所使用的DNA连接酶有两类,即　　　　　　DNA连接酶和　　　
　　　　　DNA连接酶。
(4)基因工程中除质粒外,　　　　　　和　　　　　　也可作为载体。
16.（16分）如图为鸡血细胞中DNA的粗提取和鉴定实验过程中的部分操作示意图，请据图分析，回答下列问题：
(1)上述图示中，该实验的正确操作顺序是____________________(用序号与箭头表示)。
(2)步骤④中使用2 mol/L NaCl溶液的目的是___________________________________。
(3)步骤①的目的是________________，其依据的原理是________________。
(4)步骤①中所得到的丝状物为__________色，若要鉴定其主要成分为DNA，可滴加________试剂，________后，如果出现__________则证明该丝状物的主要成分为DNA。
(5)由于鸡血较难找到，某学生试图用猪血代替，结果没有成功，其原因最可能是_____________________________________________________________________________。
参考答案及解析：
一、选择题
1.A
2.A 解析:限制酶可作用于①磷酸二酯键,解旋酶作用于③氢键,A项正确,B项错误。作用于①部位的限制酶同时也可以作用于⑤部位,C项错误。作用于①部位的限制酶与作用于⑤部位的限制酶的碱基识别序列相同,都为—GAATTC—,D项错误。
3.C 解析:一种限制酶只能特异性地识别一种核苷酸序列,并在特定位点切割DNA分子,切割出一种目的基因,体现了酶的专一性。
4.B
5.D 解析:限制酶只能识别特定的DNA序列,因此3种限制酶均不能识别和切割RNA中的核苷酸序列。
6.C 解析:质粒进入宿主细胞后不一定都要整合到染色体DNA上,也可独立复制。质粒是小型环状双链DNA分子,而不是细胞器,也不含有碱基U。
7.C 8.D
9.D 解析：目的基因若用限制酶Ⅰ切割时，只能在目的基因的一侧切开，而不能将其切下，质粒若用限制酶Ⅱ切割，两种标记基因均将被破坏，所以只能用限制酶Ⅰ切割，D正确。
10.C 11.A
12.C 解析：基因工程是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行有目的地改造，然后导入受体细胞内，使目的基因在受体细胞内成功表达，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品，因而基因工程是分子水平上的生物工程；基因工程产生的变异属于基因重组，而不属于人工诱变；基因工程虽是按照人们的意愿改造生物，目的性强，但并不是所有的基因产物对人类都有益。
13.C 解析：T4 DNA连接酶可用于连接黏性末端和平末端，A错误，C正确；E.coli DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端连接起来，B错误；E.coli DNA连接酶不能连接平末端，T4 DNA连接酶可连接平末端但效率较低，D错误。
14.D　
二、非选择题
15.答案:(1)黏性末端　平末端 (2)切割产生的DNA片段末端与EcoRⅠ切割产生的相同
(3)E.coli　T4 (4)噬菌体　动植物病毒
16.答案：(1)③→②→①→④→⑤　(2)溶解DNA　(3)析出并获得DNA　DNA不溶于酒精　
(4)白　二苯胺　沸水浴　蓝色　(5)猪血含DNA太少(或成熟的红细胞没有细胞核)
解析：(1)由分析可知，图中表示的实验正确操作顺序是③→②→①→④→⑤。(2)DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，DNA能溶于2 mol/L的NaCl溶液。(3)步骤①的目的是利用DNA不溶于酒精的性质，除去细胞中溶于酒精的物质提取DNA。(4)提取的DNA呈白色丝状物，鉴定DNA用二苯胺试剂，沸水浴加热5 min，冷却后溶液呈蓝色。(5)猪是哺乳动物，哺乳动物血液中的成熟红细胞没有细胞核和众多的细胞器，细胞中DNA含量很少，因此用猪血代替鸡血来进行该实验难以取得成功。
（北京）股份有限公司

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