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(共27张PPT)
动物细胞融合技术与单克隆抗体
1.概念：
使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。
2.原理：
细胞膜具有一定的流动性
3.诱导融合的常用方法：
PEG融合法
电融合法
灭活病毒诱导法
01
动物细胞融合技术概述
19世纪30年代，科学家曾在患肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象？
病人体内的病毒等因素诱导了多个体细胞融合形成了多核细胞。
动物细胞融合技术概述
病毒
紫外线灭活
丧失感染活性（不感染细胞）
保留融合活性（诱导细胞融合）
灭活是指用物理或化学手段使病毒失去感染能力，
但是并不破坏病毒的抗原结构。
动物细胞融合技术概述
1965年，研究证实了灭活的病毒在适当条件下确实可以诱导动物细胞融合。
灭活病毒诱导细胞融合的原理：
病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
动物细胞融合技术概述
4.细胞融合的过程
获得分散的细胞
(胰蛋白酶处理)
↓
诱导融合（杂种细胞）
物理法：电融合法
化学法：聚乙二醇PEG
生物法：灭活病毒诱导法
5.结果：
形成的单核杂交细胞具有原来两个或多个细胞的遗传信息。
动物细胞融合技术概述
6.意义：
突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能
7.应用：
（1）细胞融合技术已经成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。
（2）利用动物细胞融合技术发展起来的杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。
动物细胞融合技术概述
1.“灭活病毒”中灭活的具体含义是什么？
用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构
2.灭活病毒诱导细胞融合的原理是什么？
病毒吸附在细胞表面，含有的糖蛋白和酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚
细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布形成通道
通道扩大，细胞膜打开
两亲本的细胞核逐渐融合，形成杂种细胞
相关信息
植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理
细胞融合前的处理方法
诱导细胞融合的方法
细胞融合成功的标志
结果
意义
细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性
细胞膜具有一定的流动性
用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁
用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞
电融合法、离心法；聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法
PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法
再生出细胞壁
细胞核的融合
获得完整的杂种植株
形成杂交细胞，生产细胞产品
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种
突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能
动物细胞融合 植物体细胞杂交
1.早期获得抗体的方法
向动物体内反复注射某种抗原，从动物血清中分离所需抗体
产量低、纯度低、特异性差
缺点：
2.单克隆抗体
(1)概念：
化学性质单一、特异性强的抗体
(3)存在的问题：
每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体
单一B淋巴细胞
细胞群
选择
克隆
产生
大量纯度高特异性强的抗体
B淋巴细胞不可能无限增殖
02
单克隆抗体
（2）理论基础：
每一个B细胞只分泌一种特异性抗体
1975年英国科学家米尔斯坦和德国科学家科勒在前人工作的基础上，充分发挥想象力，发明了单克隆抗体的制备技术，于1984年获得了诺贝尔生理学或医学奖
单克隆抗体
把一种B淋巴细胞与能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞融合，所得到的融合细胞就可能大量增殖，产生足够数量的特定抗体。
米尔斯坦
【英国】
科勒
【德国】
2.单克隆抗体
一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体
骨髓瘤细胞（癌细胞）能无限增殖
动物细胞融合
杂交瘤细胞
动物细胞培养
单克隆抗体
杂交瘤细胞：既能迅速大量增殖，又能产生抗体
（4）单克隆抗体的制备思路
单克隆抗体
①请用箭头把代表各图解的字母按单克隆抗体制备过程的顺序连接起来。
②B图中注射的物质是什么？其目的是什么？
③在获取C步骤杂交瘤细胞的过程中，筛选淘汰了哪些细胞？
④D图和G图中细胞有什么特点？
⑤在流程图中标出两次筛选，并说明其目的。
⑥大量增殖杂交瘤细胞获得单克隆抗体的方法有哪些？
⑧本过程利用了哪些技术？
⑦单克隆抗体有何特点？
单克隆抗体
注射特定的抗原,小鼠脾产生特定抗体的淋巴B细胞
多种B细胞
培养骨髓瘤细胞
骨髓瘤细胞
将骨髓瘤细胞和B细胞融合
多种杂交细胞
诱导融合
能产生抗体，
但不能大量增殖
不能产生抗体，但能大量增殖
B-B、
瘤-瘤、
B-瘤
融合类型：
单克隆抗体
杂交瘤细胞
（既可以大量增殖又能产生抗体）
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞（分泌的抗体能和特定的抗原结合）
注射到小鼠腹腔内
体外培养
单克隆抗体
第一次筛选：用特定的选择培养基
在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长
第二次筛选：克隆化培养、抗体检测（可以多次）
将抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞在体外大规模培养或者注射小鼠腹腔中增值
从细胞培养液或小鼠腹水中获取大量的单克隆抗体
单克隆抗体
1.第一次筛选的目的：
第1次筛选得到的是多种杂交瘤细胞
2.扩展：如何进行第1次筛选？
阻断DNA复制的D途经
单克隆抗体
3.第2次筛选的目的
4.如何进行第2次筛选？
第2次筛选得到能产生该特异性抗体的杂交瘤细胞。
单克隆抗体
怎样二次筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞？
将杂交瘤细胞群稀释，约每孔1个进行培养（克隆化培养）
一段时间后，检测各孔上清液中细胞分泌的抗体
上清液可与特定抗原
结合的培养孔为阳性孔
抗体检测板
96孔板培养和筛选杂交瘤细胞
单克隆抗体
第一次筛选 第二次筛选
原因
方法
结果
诱导融合后得到的细胞中，除杂交瘤细胞之外，还有未融合的亲本细胞，也有融合的具有同种核的细胞
由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经第一次筛选之后获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞
用特定的选择培养基进行筛选
用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下，进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选）
筛选获得杂交瘤细胞
获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
两次筛选的比较
应用到的技术：
原理：
动物细胞融合
动物细胞培养
细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖
单克隆抗体能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备。
利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病
1.单克隆抗体的优点：
2.单克隆抗体的应用
（1）作诊断试剂——应用最广泛
实例：
单克隆抗体的应用
2.单克隆抗体的应用
（2）运载药物：
ADC（抗体—药物偶联物）：“生物导弹”是免疫导向药物的形象称呼，它由单克隆抗体与药物、酸或放射性同位素配合而成，因带有单克隆抗体而能自动导向，在生物体内与特定目标细胞或组织结合，并由其携带的药物产生治疗作用。
（3）直接用于治疗疾病。
单克隆抗体的应用
单克隆抗体的应用
思考·讨论
1.ADC的抗体和药物各具有什么作用？
抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞；药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞
2.除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？
①可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗；
②可以将阻断肿瘤细胞的信号通路的药物与单克隆抗体结合来抑制肿瘤细胞的生长
3.单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？
①单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高；
②生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒；
③ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点
思考·讨论
1.下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是( )
A.它们的原理都涉及细胞膜的流动性
B.都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合
C.融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞
D.前者主要是为了获得细胞产品，后者主要是为了获得杂种植株
C
一.概念检测
练习与应用
2.科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是( )
A.利用该单克隆抗体可以诊断是否感染SARS病毒
B.体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体
C.将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞
D.将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体
A
一.概念检测
练习与应用
假如你掌握了动物细胞融合技术，你想用这种技术来解决哪些问题？解决这些问题的大致思路是怎样的？这样做会有什么风险？请查阅相关资料，完善自己的思路，并形成文字报告，与同学交流。
提示：可以利用动物细胞融合技术培育多倍体胚胎，研究其发育机制，甚至可能培育出新的物种。但是，目前相关技术还不成熟，存在融合率低、胚胎死亡率高等问题，并且还可能带来一些伦理方面的问题。
二、拓展应用
练习与应用

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