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第1课时
微生物的基本培养技术
第1章 发酵工程
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学习目标
1.概述培养基的成分和配制方法。
2.区分消毒和灭菌，掌握不同物品的灭菌方法。
3.概述微生物纯培养的基本操作要求。
内容索引
一、培养基的配制
三、微生物的纯培养
二、无菌技术
课时对点练
培养基的配制
一
1.培养基的概念：人们按照微生物对 的不同需求，配制出供其
的营养基质——培养基，用以培养、 、鉴定、 微生物或积累其代谢物。
营养物质
梳理　教材新知
生长繁殖
分离
保存
2.培养基的种类
培养基种类 划分标准 培养基特点 作用
培养基 ________ 加凝固剂，如_____ 微生物的分离与鉴定，活菌计数，保藏菌种
半固体培养基 容器放倒不致流出，剧烈震动则破散 观察微生物的运动、分类鉴定
培养基 不加凝固剂 常用于工业生产
固体
液体
物理性质
琼脂
特别提醒
固体培养基中的琼脂仅作为凝固剂，不能为微生物生长提供能量和碳源。
组分 含量 提供的主要营养
牛肉膏 5 g 等
蛋白胨 10 g 等
NaCl 5 g 无机盐
H2O 定容至1 000 mL 水
碳源、氮源、磷酸盐和维生素
碳源、氮源和维生素
3.培养基的营养构成
(1)主要营养物质：水、 (提供碳元素的物质)、 (提供氮元素的物质)和无机盐。
(2)某种常见的细菌培养基——牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成
碳源
氮源
(3)培养基还需满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。例如，在培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加 ；在培养霉菌时，一般需要将培养基调至 ；在培养细菌时，一般需要将培养基调至______
；在培养厌氧微生物时，需要提供 的条件。
维生素
酸性
中性或
弱碱性
无氧
特别提醒
培养基的配制原则：目的要明确；营养要协调；pH要适宜。
提示　培养自生固氮菌的培养基中可以不添加氮源。
(1)牛肉膏和蛋白胨来源于动物，含有糖、维生素和有机氮等营养物质(　　)
(2)所有微生物在培养时，培养基中都需加入氮源(　　)
×
×
√
提示　培养不同微生物的培养基成分不完全一样，如培养自养微生物的培养基不需要碳源，培养自生固氮菌的培养基中可以不添加氮源。
(3)培养不同微生物的培养基成分完全一样(　　)
任务一：概述培养基的种类和营养构成
1.结合提供的资料和教材中的“1 000 mL牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成”，分析并回答下列问题：
资料一　配制培养酵母菌的培养基：称取去皮的马铃薯200 g，切成小块，加水1 000 mL，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入
20 g葡萄糖(也可用蔗糖代替)、15～20 g琼脂，用蒸馏水定容至1 000 mL。
资料二　100 g马铃薯中含有80 g水、2 g蛋白质、16 g碳水化合物，还有维生素、无机盐等。
探究　核心知识
(1)按物理性质划分，培养酵母菌的培养基是 培养基，判断的依据是 ；而牛肉膏蛋白胨培养基是 培养基，判断的依据是 。
(2)上述两种培养基的营养构成：都含有____________________________
等，其中培养酵母菌的培养基中主要由 提供碳源， 提供氮源，牛肉膏蛋白胨培养基中能为细菌同时提供碳源和氮源的物质是
。
固体
培养基成分中有琼脂(凝固剂)
液体
培养基中未加凝固剂
水、碳源、氮源、无机盐和维
生素
糖类
蛋白质
牛肉膏和蛋白胨
(3)为什么培养基需要氮源？
提示　培养基中的氮元素是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的。
2.如表是某微生物培养基的成分，该培养基可用来培养 型微生物。若除去①，此培养基 (填“能”或“不能”)用来培养圆褐固氮菌，原因是_________________________________________________________
。
编号 ① ② ③ ④ ⑤
成分 (NH4)2SO4 KH2PO4 FeSO4 CaCl2 H2O
用量 0.4 g 4.0 g 0.5 g 0.5 g 100 mL
自养
不能
圆褐固氮菌虽可以固氮，但其同化作用类型为异养型，培养基中
必须提供有机碳源
3.培养微生物时，培养基中是否必须有碳源和氮源？
提示　不一定。例如，培养自养型微生物时，一般不需要添加碳源，微生物可以利用空气中的二氧化碳；培养固氮微生物时，一般不需要添加氮源，微生物可以利用空气中的氮气。
几种微生物的营养和能量来源
核心归纳
微生物 碳源 氮源 能源
蓝细菌 CO2 等 光能
硝化细菌 CO2 NH3 NH3的氧化
根瘤菌 糖类等有机物 N2 有机物
大肠杆菌 糖类、蛋白质等有机物 蛋白质等 有机物
1.关于微生物的营养，下列说法正确的是
A.同一种物质不可能既作碳源又作氮源
B.凡是碳源都能提供能量
C.除水以外的无机物仅提供无机盐
D.无机氮源也可能提供能量
√
落实　思维方法
对一些微生物来说，含C、H、O、N的有机化合物可以既是碳源，又是氮源，A错误；
CO2是光能自养型细菌的碳源，但不能提供能量，B错误；
除水以外的无机物种类繁多、功能多样，如CO2可作自养型微生物的碳源，C错误；
硝化细菌所利用的氮源是无机氮源——氨气，同时氨气的氧化过程也为硝化细菌提供用以化能合成作用的能量，D正确。
2.下列有关微生物培养基种类及配制原则的叙述，正确的是
A.任何培养基都必须含有碳源、氮源、水、无机盐及特殊的营养物质
B.液体培养基可用于观察菌落，固体培养基可用于工业生产
C.微生物的生长除受营养因素影响外，还受pH、O2、渗透压等的影响
D.淀粉可作为所有微生物的碳源
√
培养基不一定都含有碳源、氮源，如培养自养型微生物的培养基中不需要加入碳源，培养自生固氮菌的培养基中不需要加入氮源；一般固体培养基可用于观察菌落，液体培养基可用于工业生产；某些微生物不能利用淀粉，而只能利用葡萄糖、果糖、蔗糖和麦芽糖等糖类。
二
无菌技术
获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染，无菌技术主要包括消毒和灭菌。
1.消毒
(1)概念：指使用较为 的物理、化学或 等方法杀死物体表面或内部 微生物。
(2)适用对象：操作的 、操作者的 和手等。
(3)常用方法： 消毒、 消毒等。
梳理　教材新知
温和
生物
一部分
空间
衣着
煮沸
巴氏
2.灭菌
(1)概念：指使用 的理化方法杀死物体内外 的微生物，包括____
和孢子。
(2)适用对象：用于微生物培养的器皿、 用具和 等。
(3)常用方法： 灭菌、干热灭菌和 灭菌等。
强烈
所有
芽孢
接种
培养基
湿热
灼烧
知识拓展
芽孢：有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体(不是繁殖体)，叫作芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜(如温度、水分适宜)的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌。
孢子：细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖或休眠作用的生殖细胞。孢子的特点是能直接长成新个体。
芽孢和孢子
(1)消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害(　　)
(2)与消毒相比，灭菌对微生物的杀灭更彻底(　　)
(3)无菌操作的对象只要是没有生物活性的材料(如培养基、接种环等)，都可采用干热灭菌法进行灭菌(　　)
√
×
√
提示　培养基的灭菌一般采用湿热灭菌法。
项目 主要方法 应用范围
消毒 巴氏消毒法 ℃消毒30 min或 ℃处理15 s或80～85 ℃处理10～15 s 牛奶、啤酒、果酒和酱油等不耐高温的液体
煮沸消毒法 100 ℃煮沸 min 家庭餐具等生活用品
紫外线消毒 30 W紫外灯照射 min(损伤细菌的DNA) 、 或
__________
任务二：消毒和灭菌的比较及无菌技术的其他作用
1.请完善表格中消毒和灭菌的主要方法及应用范围。
探究　核心知识
63～65
72～76
5～6
30
接种室
接种箱
超净工作台
项目 主要方法 应用范围
消毒 化学药物消毒 用体积分数为70%的_____ 擦拭实验者双手
______ 水源
灭菌 灼烧灭菌 直接在酒精灯火焰的 层灼烧 接种工具，如 、_____
、 或其他金属用具、 或 等
干热灭菌 干热灭菌箱中， ℃的热空气中维持______ 的物品，如玻璃器皿、金属用具等
高压蒸汽灭菌(湿热灭菌) 的条件下，维持____ ______ 等
酒精
氯气
充分燃烧
涂布器
接种
环
接种针
试管口
瓶口
160～170
1～2 h
耐高温的、需要保持干燥
100 kPa、121 ℃
15～
30 min
培养基
2.牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是什么？
提示　在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少。
3.体积分数为70%的酒精杀菌效果最好，若酒精浓度过高，___________
，酒精不能渗入其中；若酒精浓度过低， 。
菌体表面蛋
白质变性过快而凝固成一层保护膜
杀菌能力减弱
4.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么作用？
提示　无菌技术还能有效避免污染环境以及操作者自身被微生物感染。
无菌技术的关键是防止杂菌污染，A错误；
无菌技术中，若处理对象为液体，可以用湿热灭菌法灭菌，D错误。
3.下列有关无菌技术的说法，正确的是
A.无菌技术的关键是杀灭实验室中所有的微生物
B.培养微生物的试剂和器具都要进行湿热灭菌
C.经巴氏消毒法处理的食品因微生物未被彻底消灭，不能在常温下长期
　保存
D.无菌技术中，若处理对象为液体，则只能消毒，不能灭菌
√
落实　思维方法
4.(2024·德阳高二月考)下列关于实验室无菌技术的叙述，错误的是
A.接种室、超净工作台可以用紫外线照射进行消毒
B.在100 ℃条件下煮沸5～6 min属于灭菌方法
C.实验结束后使用过的培养基应灭菌处理后再丢弃
D.金属接种工具直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧灭菌
√
在100 ℃条件下煮沸5～6 min属于煮沸消毒法，B错误。
三
微生物的纯培养
1.概念
(1)培养物：在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类 称为培养物。
(2)纯培养物：由 繁殖所获得的微生物群体。
(3)纯培养：获得 的过程。
2.步骤：微生物的纯培养包括 、 、 、 和
等步骤。
微生物的群体
梳理　教材新知
单一个体
纯培养物
配制培养基
灭菌
接种
分离
培养
3.酵母菌的纯培养
(1)原理：微生物群体分散或稀释成单个细胞，单个细胞繁殖成单个菌落。
菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的 ，这就是菌落。
(2)获得单菌落的方法：采用 法和 法将单个微生物分散在固体培养基上，之后经培养得到的单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。
子细胞群体
平板划线
稀释涂布平板
(3)步骤
①制备培养基：配制培养基―→灭菌―→ 。
倒平板注意事项：a.温度：50 ℃左右；b.操作：在 附近；c.冷凝后平板倒置。
②接种和分离酵母菌
通过接种环在固体培养基表面 的操作，将聚集的菌种逐步____
到培养基的表面。经数次划线后培养，可以分离得到单菌落。
③培养酵母菌
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个_______
的平板倒置，放入28 ℃左右的恒温培养箱中培养24～48 h。
倒平板
酒精灯火焰
连续划线
稀释
分散
未接种
(1)培养基分装到培养皿后再进行湿热灭菌(　　)
提示　应将配制好的培养基先进行湿热灭菌，再在无菌环境中将其分装到培养皿中。
(2)倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上(　　)
提示　倒平板时，将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基倒入培养皿，立即盖上皿盖。
(3)配制培养基时应先灭菌再调pH(　　)
提示　配制培养基时应先调pH再灭菌。
×
×
×
任务三：分析酵母菌的纯培养
1.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，最好不要再用这个平板培养微生物，防止___________________________
。
2.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
探究　核心知识
提示　平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，将平板倒置，既可以防止皿盖上的水珠落入培养基，又可以避免培养基中的水分过快挥发。
空气中的微生物在皿盖与皿底
之间的培养基上滋生
3.下列接种过程，正确的顺序是 。
b、a、e、f、c、g、d
灼烧时期 目的
取菌种前 杀死接种环上______________
每次划线前 杀死上次划线时残留的菌种，使下一次划线的菌种直接来源于 ，从而使___________________
，直至得到__________
接种结束后 杀死接种环上残留的菌种，避免微生物污染环境和感染操作者
4.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？请完善下方的表格。
原有的微生物
上次划线的末端
每次划线时菌种数目
逐渐减少
单个细胞
5.上述问题3中，图d中共划了 个区域，在每次划线 (填“前”“后”或“前后”)均需要对接种环灼烧灭菌，因此共需要灼烧接种环 次。
6.为什么最后一次的划线与第一次的划线不能相连？
提示　最后一次的划线已经将微生物稀释成单个的细胞，如果与第一次的划线相连则增加了微生物的数目，得不到纯化的效果。
7.设置未接种平板组的意义是什么？
提示　通过观察未接种平板是否有菌落存在以确定培养基是否被污染或灭菌是否彻底。
5
前后
6
核心归纳
1.配制培养基的注意事项
(1)如果需要调节培养基的pH，应该在定容完成之后，灭菌之前进行操作。
(2)培养基灭菌后要冷却到50 ℃左右时开始倒平板。其原因是琼脂是一种多糖，在98 ℃以上熔化，在44 ℃以下凝固，倒平板时温度高于50 ℃会烫手，低于50 ℃时，若不及时操作，琼脂会凝固。
(3)倒平板时，要使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰。通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
核心归纳
2.平板划线法接种菌种时，可防止杂菌污染的操作
(1)接种前将接种环放在酒精灯火焰上灼烧。
(2)划线操作在酒精灯火焰旁进行。
(3)接种环蘸取菌液前后，要将试管口通过火焰。
(4)划线时将培养皿的皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划线，划线后及时盖上皿盖。
核心归纳
3.实验结果的分析
(1)培养未接种的培养基的目的是检测培养基是否被杂菌污染(或检查培养基制备是否合格)。未接种的培养基表面若有菌落生长，则说明培养基被污染，应该重新制备；若无菌落生长，则说明未被污染。
(2)在接种酵母菌的培养基上可观察到独立的菌落，这些菌落在颜色、形状和大小上相似，酵母菌菌落一般表面光滑，多呈乳白色。
(3)若在培养基中观察到不同形态的菌落，原因可能是菌液不纯，混入其他杂菌，或在实验操作过程中被杂菌污染。
5.(2023·厦门高二期末)下列有关微生物的分离与培养的叙述，错误的是
A.获得纯净培养物的关键是防止杂菌污染
B.倒置平板可防止培养皿皿盖上的冷凝水落入培养基
C.倒平板时将培养皿的皿盖拿开，以便于将锥形瓶中的培养基倒入培养皿
D.检验培养基是否被杂菌污染的最有效方法是将未接种的培养基放在恒
温培养箱中培养
√
倒平板时用食指和拇指夹住培养皿的皿盖并开启一条缝隙，使其恰好能让锥形瓶瓶口伸入，随后倒入培养基，C错误。
落实　思维方法
6.在分离、纯化细菌的实验中，划线接种(甲)、培养结果(乙)如图，a、b、c、d是划线的四个区域。下列叙述错误的是
A.每次划线前后都要对接种环灼烧灭菌
B.连续划线的目的是获得单个细菌形成的菌落
C.图甲中的a区域为划线的起始区域
D.蘸取菌液和划线要在酒精灯火焰旁进行
√
题图中a对应的区域出现了单个菌落，d区域菌落最多，因此a区域应该为划线的最终区域，d区域为划线的起始区域，C错误。
网络构建
课时对点练
四
题组一　培养基的配制
1.(2024·长治高二质检)下列有关培养基的叙述，错误的是
A.培养基中一般都含有碳源、氮源、水和无机盐等主要营养物质
B.根据微生物对碳源需求上的差别，可在培养基中增减不同的碳源
C.某些细菌生长过程中需要额外补充营养物质，如在培养乳酸杆菌时，
需要在培养基中添加维生素
D.微生物只能在琼脂固体培养基表面生长并产生菌落
√
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微生物可以在琼脂固体培养基表面或内部生长，形成肉眼可见的菌落，D错误。
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培养该菌时，需要加入蒸馏水；该微生物为异养生物，需要葡萄糖作为碳源；培养该微生物需要无机盐，故需要加入氯化钠；该微生物可以自己固氮，不需要加入氮源，故不需要加入蛋白胨，D符合题意。
2.某异养自生固氮菌能将大气中的氮还原成氨，若在实验室中分离土壤中的该菌，则配制培养基时，一般不需要加入的物质是
A.蒸馏水 B.葡萄糖 C.氯化钠 D.蛋白胨
√
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固体培养基中含有凝固剂琼脂，加入水不会制成液体培养基，C错误；
在培养细菌时，一般需要将培养基调至中性或弱碱性，D错误。
3.(2023·唐山高二检测)下列关于微生物培养基的叙述，正确的是
A.培养基是为微生物的生长繁殖提供营养的基质
B.培养基中的营养物质浓度越高，对微生物的生长越有利
C.固体培养基中加入少量水即可制成液体培养基
D.在培养细菌时，一般需要将培养基调至酸性
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接种中试管口等易被污染的部位通过火焰，属于灼烧灭菌，D符合题意。
题组二　无菌技术
4.(2024·宁德高二期中)下列操作不属于消毒方法的是
A.牛奶在63～65 ℃下煮30 min以杀死其中的微生物
B.用体积分数为70%的酒精擦拭实验者双手
C.接种室、接种箱使用前用紫外线照射30 min
D.接种中试管口等易被污染的部位通过火焰
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5.微生物的实验室培养要进行严格的灭菌和消毒。下列关于灭菌和消毒的叙述，正确的是
A.煮沸消毒法中100 ℃煮沸5～6 min可以杀死全部微生物的细胞和芽孢、
孢子
B.培养皿用酒精直接擦拭即可达到彻底灭菌的目的
C.灼烧灭菌的对象是金属器具，不可以是玻璃器具
D.消毒和灭菌的原理是相同的
√
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灭菌可以杀死环境中的一切微生物，包括芽孢和孢子，消毒只能杀死物体表面或内部一部分微生物，A错误；
玻璃器皿等耐高温、需要保持干燥的实验器具，应采用干热灭菌法进行灭菌，而用酒精直接擦拭达不到彻底灭菌的目的，B错误；
灼烧灭菌的对象可以是金属器具，也可以是玻璃器具，C错误；
消毒和灭菌的原理是相同的，都是使微生物的蛋白质变性，D正确。
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题组三　微生物的纯培养
6.(2023·宜宾高二期中)下列关于实验室培养和纯化酵母菌过程中的部分操作的说法，正确的是
A.培养酵母菌的试剂和器具都要进行湿热灭菌
B.制作培养基时，湿热灭菌后还需要调pH
C.倒好的平板要立即使用，以免表面干燥，影响酵母菌生长
D.将平板倒置放入适宜温度的恒温培养箱中培养
√
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接种环等常用灼烧灭菌法处理，吸管、培养皿等常用干热灭菌法处理，培养基及多种器材用湿热灭菌法处理，A错误；
制作培养基时，应先调pH再灭菌，B错误；
倒好的平板需要冷却后再使用，C错误。
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7.采用平板划线法能将单个微生物分散在固体培养基上，下列有关平板划线操作的叙述，错误的是
A.第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物
B.每次划线前，灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留
的菌种
C.在第二区域内划线时，接种环上的菌种直接来源于菌液
D.划线结束后，灼烧接种环，能及时杀死接种环上的菌种，避免微生物
污染环境和感染操作者
√
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从第二次划线开始，每次划线时接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，C错误。
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8.(2024·三明高二期末)如图是实验室培养和纯化酵母菌过程中的部分操作步骤，下列说法错误的是
A.①步骤使用的培养基已经
灭菌
B.①②③步骤操作时均需要在酒精灯火焰旁进行
C.④步骤操作时，不能将第1区和第5区的划线相连
D.④操作过程中，需灼烧接种环5次
√
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每次划线前后都要灼烧接种环，因此④操作过程中，需灼烧接种环6次，D错误。
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注：“＋”表示含有该物质，“－”表示不含有该物质。
9.如表中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ是用来培养微生物的三种培养基。甲、乙、丙都能在Ⅲ中正常生长繁殖；甲能在Ⅰ中正常生长繁殖，而乙和丙都不能；乙能在Ⅱ中正常生长繁殖，甲、丙都不能。下列说法正确的是
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序号 粉状硫10 g K2HPO4 4 g FeSO4 0.5 g 蔗糖10 g (NH4)2SO4 0.4 g H2O 100 mL MgSO4 9.25 g CaCl20.5 g
Ⅰ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋
Ⅱ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋ ＋
Ⅲ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
序号 粉状硫10 g K2HPO4 4 g FeSO4 0.5 g 蔗糖10 g (NH4)2SO4 0.4 g H2O 100 mL MgSO4 9.25 g CaCl20.5 g
Ⅰ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋
Ⅱ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋ ＋
Ⅲ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
A.甲、乙、丙都是异养型微生物
B.甲、乙都是自养型微生物、丙是异养型微生物
C.甲是固氮微生物、乙是自养型微生物、丙是异养型微生物
D.甲是异养型微生物、乙是固氮微生物、丙是自养型微生物
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根据表格分析，甲能在Ⅰ中正常生长繁殖，而乙和丙都不能，而Ⅰ培养基缺氮，说明甲属于固氮微生物；乙能在Ⅱ中正常生长繁殖，而甲和丙都不能，Ⅱ培养基中没有有机碳源，说明乙属于自养微生物；而丙不能在Ⅰ培养基中生长，说明不能固氮，又不能在Ⅱ培养基中生长，说明不能合成有机物，只能在Ⅲ培养基中生长，说明丙属于异养微生物，C正确。
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10.生长图形法是一种测定微生物营养需求的简便方法。为探究某嗜热菌所需生长因子的种类，某研究小组把该菌的悬浮液与不含任何特殊营养物质但含有其他必需营养物质的培养基混合后倒平板，然后在平板上划分数区，将甲、乙、丙三种生长因子分别添加到不同区域，培养结果如图所示。下列说法不正确的是
A.倒平板后直接培养可判断有无污染
B.将所有平板放置在适宜的37 ℃下倒置培养并观察
C.图示结果表明该菌需要特殊营养物质乙和丙
D.生长图形法还可用于某些菌种的筛选
√
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倒平板后不接种任何菌种直接进行培养观察有无菌落的出现，可以判断培养基有无污染，A正确；
该菌为嗜热菌，应放置在其适宜的高温条件下
培养，而不是37 ℃，B错误；
图中嗜热菌在添加了乙、丙特殊营养物质的区
域生长，故该菌需要的特殊营养物质是乙和丙，C正确；
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不同的菌种所需的特殊营养物质不同，利用生长图形法可用于某些菌种的筛选，菌种只会在提供其需要的生长因子的区域生长，D正确。
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消毒也可以杀死物体内部的部分微生物，A错误。
11.(2024·珠海高二期中)关于无菌技术，下列叙述错误的是
A.消毒只能杀死物体表面的部分微生物
B.消毒采用较温和的物理、化学或生物方法
C.灭菌能杀死物体内外所有微生物，包括芽孢和孢子
D.操作者的双手需要用化学药物进行灭菌处理，避免操作过程中的污染
√
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12.某研究小组用平板划线法从有机废水中分离微生物用于废水处理。下列叙述正确的是
A.倒平板后应立即将培养皿倒置
B.转换划线角度时不需灼烧接种环即可进行划线
C.接种时不能划破培养基，否则难以达到分离单菌落的目的
D.划线操作时完全打开皿盖，划完立即盖上
√
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倒平板后应等平板冷凝后，再将培养皿倒置，A错误；
转换划线角度后要对接种环进行灼烧灭菌，接种环冷却后再进行划线，B错误；
划线时左手将皿盖打开一条缝隙，右手于酒精灯火焰旁将接种环迅速伸入平板内，在培养基表面迅速划三至五条平行线，盖上皿盖，不可完全打开皿盖，D错误。
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13.请根据所学微生物培养的知识，回答下列问题：
(1)在液体培养基中加入____________后制成的固体培养基，是实验室最常用的培养基。
(2)实验室中常用_________法对培养基及器皿进行灭菌。不同培养基的具体配方不同，但一般都含有水、_______、______和无机盐。
(3)培养微生物时，将培养皿倒置的目的是__________________________。实验结束后，应对使用过的培养基进行______处理。
琼脂(凝固剂)
湿热灭菌
碳源
氮源
防止皿盖上的水珠落入培养基
灭菌
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14.(2022·全国乙，37)化合物S被广泛应用于医药、食品和化工工业。用菌株C可生产S，S的产量与菌株C培养所利用的碳源关系密切。为此，某小组通过实验比较不同碳源对菌体生长和S产量的影响，结果见表。
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碳源 细胞干重/(g·L－1) S产量/(g·L－1)
葡萄糖 3.12 0.15
淀粉 0.01 0.00
制糖废液 2.30 0.18
回答下列问题：
(1)通常在实验室培养微生物时，需要对所用的玻璃器皿进行灭菌，灭菌的方法有___________________________________(答出2点即可)。
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碳源 细胞干重/(g·L－1) S产量/(g·L－1)
葡萄糖 3.12 0.15
淀粉 0.01 0.00
制糖废液 2.30 0.18
干热灭菌、湿热灭菌(或高压蒸汽灭菌)
获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染，对所需的玻璃器皿进行灭菌，灭菌的方法有干热灭菌、湿热灭菌(或高压蒸汽灭菌)、灼烧灭菌。
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(2)由实验结果可知，菌株C生长的最适碳源是_________；用菌株C生产S的最适碳源是_________。菌株C的生长除需要碳源外，还需要_________
_________________(答出2点即可)等营养物质。
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碳源 细胞干重/(g·L－1) S产量/(g·L－1)
葡萄糖 3.12 0.15
淀粉 0.01 0.00
制糖废液 2.30 0.18
葡萄糖
制糖废液
无机盐、生长因子
氮源、
分析题干实验结果，以葡萄糖为碳源时，细胞干重最大，故菌株C生长的最适碳源是葡萄糖；以制糖废液为碳源时，S产量最高，故用菌株C生产S的最适碳源是制糖废液。微生物的生长需要水、无机盐、碳源、氮源以及特殊的营养物质，故菌株C的生长除需要碳源外，还需要氮源、无机盐、生长因子等营养物质。
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(3)由实验结果可知，碳源为淀粉时菌株C不能生长，其原因是___________。
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碳源 细胞干重/(g·L－1) S产量/(g·L－1)
葡萄糖 3.12 0.15
淀粉 0.01 0.00
制糖废液 2.30 0.18
缺少淀粉酶
由实验结果可知，菌株C可以利用葡萄糖，但在以淀粉为碳源时，菌株C不能生长，说明菌株C无法利用淀粉，原因是菌株C不能合成淀粉酶，导致其无法利用淀粉。
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(4)若以制糖废液作为碳源，为进一步确定生产S的最适碳源浓度，某同学进行了相关实验。请简要写出实验思路：___________________________
________________________________________________________________________________________。
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碳源 细胞干重/(g·L－1) S产量/(g·L－1)
葡萄糖 3.12 0.15
淀粉 0.01 0.00
制糖废液 2.30 0.18
设计一系列不同浓度的制糖废液分别培养菌株C，测定不同浓度制糖废液中S产量，寻找S产量最大的碳源浓度，确定最适碳源浓度
以制糖废液作为碳源，进一步确定生产S的最适碳源浓度，可以以碳源浓度作为自变量，不同碳源浓度下S产量作为因变量，实验思路为：设计一系列不同浓度的制糖废液分别培养菌株C，测定不同浓度制糖废液中S产量，寻找S产量最大的碳源浓度，从而确定最适碳源浓度。
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(5)利用制糖废液生产S可以实现废物利用，其意义是__________________
_____________。
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碳源 细胞干重/(g·L－1) S产量/(g·L－1)
葡萄糖 3.12 0.15
淀粉 0.01 0.00
制糖废液 2.30 0.18
降低生产成本
减少污染、节省原料、第2节　微生物的培养技术及应用
第1课时　微生物的基本培养技术
[学习目标]　1.概述培养基的成分和配制方法。2.区分消毒和灭菌，掌握不同物品的灭菌方法。3.概述微生物纯培养的基本操作要求。
一、培养基的配制
1．培养基的概念：人们按照微生物对________的不同需求，配制出供其__________的营养基质——培养基，用以培养、______、鉴定、______微生物或积累其代谢物。
2．培养基的种类
培养基种类 划分标准 培养基特点 作用
_____培养基 加凝固剂，如_____ 微生物的分离与鉴定，活菌计数，保藏菌种
半固体培养基 容器放倒不致流出，剧烈震动则破散 观察微生物的运动、分类鉴定
_____培养基 不加凝固剂 常用于工业生产
特别提醒　固体培养基中的琼脂仅作为凝固剂，不能为微生物生长提供能量和碳源。
3．培养基的营养构成
(1)主要营养物质：水、______(提供碳元素的物质)、______(提供氮元素的物质)和无机盐。
(2)某种常见的细菌培养基——牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成
组分 含量 提供的主要营养
牛肉膏 5 g ____________________________等
蛋白胨 10 g ________________等
NaCl 5 g 无机盐
H2O 定容至1 000 mL 水
(3)培养基还需满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。例如，在培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加________；在培养霉菌时，一般需要将培养基调至______；在培养细菌时，一般需要将培养基调至______________；在培养厌氧微生物时，需要提供______的条件。
特别提醒　培养基的配制原则：目的要明确；营养要协调；pH要适宜。
判断正误
(1)牛肉膏和蛋白胨来源于动物，含有糖、维生素和有机氮等营养物质(　　)
(2)所有微生物在培养时，培养基中都需加入氮源(　　)
(3)培养不同微生物的培养基成分完全一样(　　)
任务一：概述培养基的种类和营养构成
1．结合提供的资料和教材中的“1 000 mL牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成”，分析并回答下列问题：
资料一　配制培养酵母菌的培养基：称取去皮的马铃薯200 g，切成小块，加水1 000 mL，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20 g葡萄糖(也可用蔗糖代替)、15～20 g琼脂，用蒸馏水定容至1 000 mL。
资料二　100 g马铃薯中含有80 g水、2 g蛋白质、16 g碳水化合物，还有维生素、无机盐等。
(1)按物理性质划分，培养酵母菌的培养基是______培养基，判断的依据是______________；而牛肉膏蛋白胨培养基是______培养基，判断的依据是____________________。
(2)上述两种培养基的营养构成：都含有______________________________等，其中培养酵母菌的培养基中主要由______提供碳源，________提供氮源，牛肉膏蛋白胨培养基中能为细菌同时提供碳源和氮源的物质是__________________。
(3)为什么培养基需要氮源？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
2．如表是某微生物培养基的成分，该培养基可用来培养______型微生物。若除去①，此培养基______(填“能”或“不能”)用来培养圆褐固氮菌，原因是___________________________
______________________________________________________________________________。
编号 ① ② ③ ④ ⑤
成分 (NH4)2SO4 KH2PO4 FeSO4 CaCl2 H2O
用量 0.4 g 4.0 g 0.5 g 0.5 g 100 mL
3.培养微生物时，培养基中是否必须有碳源和氮源？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
　几种微生物的营养和能量来源
微生物 碳源 氮源 能源
蓝细菌 CO2 NH、NO等 光能
硝化细菌 CO2 NH3 NH3的氧化
根瘤菌 糖类等有机物 N2 有机物
大肠杆菌 糖类、蛋白质等有机物 蛋白质等 有机物
1．关于微生物的营养，下列说法正确的是(　　)
A．同一种物质不可能既作碳源又作氮源
B．凡是碳源都能提供能量
C．除水以外的无机物仅提供无机盐
D．无机氮源也可能提供能量
2．下列有关微生物培养基种类及配制原则的叙述，正确的是(　　)
A．任何培养基都必须含有碳源、氮源、水、无机盐及特殊的营养物质
B．液体培养基可用于观察菌落，固体培养基可用于工业生产
C．微生物的生长除受营养因素影响外，还受pH、O2、渗透压等的影响
D．淀粉可作为所有微生物的碳源
二、无菌技术
获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染，无菌技术主要包括消毒和灭菌。
1．消毒
(1)概念：指使用较为______的物理、化学或______等方法杀死物体表面或内部______微生物。
(2)适用对象：操作的______、操作者的______和手等。
(3)常用方法：______消毒、______消毒等。
2．灭菌
(1)概念：指使用______的理化方法杀死物体内外________的微生物，包括________和孢子。
(2)适用对象：用于微生物培养的器皿、______用具和________等。
(3)常用方法：______灭菌、干热灭菌和______灭菌等。
知识拓展　芽孢和孢子
芽孢：有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体(不是繁殖体)，叫作芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜(如温度、水分适宜)的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌。
孢子：细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖或休眠作用的生殖细胞。孢子的特点是能直接长成新个体。
判断正误
(1)消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害(　　)
(2)与消毒相比，灭菌对微生物的杀灭更彻底(　　)
(3)无菌操作的对象只要是没有生物活性的材料(如培养基、接种环等)，都可采用干热灭菌法进行灭菌(　　)
任务二：消毒和灭菌的比较及无菌技术的其他作用
1．请完善表格中消毒和灭菌的主要方法及应用范围。
项目 主要方法 应用范围
消毒 巴氏消毒法 _____ ℃消毒30 min或____ ℃处理15 s或80～85 ℃处理10～15 s 牛奶、啤酒、果酒和酱油等不耐高温的液体
煮沸消毒法 100 ℃煮沸____ min 家庭餐具等生活用品
紫外线消毒 30 W紫外灯照射____ min(损伤细菌的DNA) ____、____或________
化学药物消毒 用体积分数为70%的____ 擦拭实验者双手
水源
灭菌 灼烧灭菌 直接在酒精灯火焰的____层灼烧 接种工具，如____、____、____或其他金属用具、______或____等
干热灭菌 干热灭菌箱中，________ ℃的热空气中维持________ ____________________的物品，如玻璃器皿、金属用具等
高压蒸汽灭菌(湿热灭菌) ________________的条件下，维持____________ ________等
2.牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是什么？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
3．体积分数为70%的酒精杀菌效果最好，若酒精浓度过高，___________________，酒精不能渗入其中；若酒精浓度过低，____________。
4．无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么作用？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
3．下列有关无菌技术的说法，正确的是(　　)
A．无菌技术的关键是杀灭实验室中所有的微生物
B．培养微生物的试剂和器具都要进行湿热灭菌
C．经巴氏消毒法处理的食品因微生物未被彻底消灭，不能在常温下长期保存
D．无菌技术中，若处理对象为液体，则只能消毒，不能灭菌
4．(2024·德阳高二月考)下列关于实验室无菌技术的叙述，错误的是(　　)
A．接种室、超净工作台可以用紫外线照射进行消毒
B．在100 ℃条件下煮沸5～6 min属于灭菌方法
C．实验结束后使用过的培养基应灭菌处理后再丢弃
D．金属接种工具直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧灭菌
三、微生物的纯培养
1．概念
(1)培养物：在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类____________称为培养物。
(2)纯培养物：由__________繁殖所获得的微生物群体。
(3)纯培养：获得__________的过程。
2．步骤：微生物的纯培养包括____________、______、______、______和______等步骤。
3．酵母菌的纯培养
(1)原理：微生物群体分散或稀释成单个细胞，单个细胞繁殖成单个菌落。
菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的____________，这就是菌落。
(2)获得单菌落的方法：采用____________法和________________法将单个微生物分散在固体培养基上，之后经培养得到的单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。
(3)步骤
①制备培养基：配制培养基―→灭菌―→________。
倒平板注意事项：a.温度：50 ℃左右；b.操作：在______________附近；c.冷凝后平板倒置。
②接种和分离酵母菌
通过接种环在固体培养基表面__________的操作，将聚集的菌种逐步__________到培养基的表面。经数次划线后培养，可以分离得到单菌落。
③培养酵母菌
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个____________的平板倒置，放入28 ℃左右的恒温培养箱中培养24～48 h。
判断正误
(1)培养基分装到培养皿后再进行湿热灭菌(　　)
(2)倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上(　　)
(3)配制培养基时应先灭菌再调pH(　　)
任务三：分析酵母菌的纯培养
1．在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，最好不要再用这个平板培养微生物，防止______________________________________________。
2．平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
3．下列接种过程，正确的顺序是____________________。
4．为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？请完善下方的表格。
灼烧时期 目的
取菌种前 杀死接种环上___________
每次划线前 杀死上次划线时残留的菌种，使下一次划线的菌种直接来源于________，从而使________________________________，直至得到________
接种结束后 杀死接种环上残留的菌种，避免微生物污染环境和感染操作者
5.上述问题3中，图d中共划了____个区域，在每次划线______(填“前”“后”或“前后”)均需要对接种环灼烧灭菌，因此共需要灼烧接种环____次。
6．为什么最后一次的划线与第一次的划线不能相连？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
7．设置未接种平板组的意义是什么？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
1．配制培养基的注意事项
(1)如果需要调节培养基的pH，应该在定容完成之后，灭菌之前进行操作。
(2)培养基灭菌后要冷却到50 ℃左右时开始倒平板。其原因是琼脂是一种多糖，在98 ℃以上熔化，在44 ℃以下凝固，倒平板时温度高于50 ℃会烫手，低于50 ℃时，若不及时操作，琼脂会凝固。
(3)倒平板时，要使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰。通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
2．平板划线法接种菌种时，可防止杂菌污染的操作
(1)接种前将接种环放在酒精灯火焰上灼烧。
(2)划线操作在酒精灯火焰旁进行。
(3)接种环蘸取菌液前后，要将试管口通过火焰。
(4)划线时将培养皿的皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划线，划线后及时盖上皿盖。
3．实验结果的分析
(1)培养未接种的培养基的目的是检测培养基是否被杂菌污染(或检查培养基制备是否合格)。未接种的培养基表面若有菌落生长，则说明培养基被污染，应该重新制备；若无菌落生长，则说明未被污染。
(2)在接种酵母菌的培养基上可观察到独立的菌落，这些菌落在颜色、形状和大小上相似，酵母菌菌落一般表面光滑，多呈乳白色。
(3)若在培养基中观察到不同形态的菌落，原因可能是菌液不纯，混入其他杂菌，或在实验操作过程中被杂菌污染。
5．(2023·厦门高二期末)下列有关微生物的分离与培养的叙述，错误的是(　　)
A．获得纯净培养物的关键是防止杂菌污染
B．倒置平板可防止培养皿皿盖上的冷凝水落入培养基
C．倒平板时将培养皿的皿盖拿开，以便于将锥形瓶中的培养基倒入培养皿
D．检验培养基是否被杂菌污染的最有效方法是将未接种的培养基放在恒温培养箱中培养
6．在分离、纯化细菌的实验中，划线接种(甲)、培养结果(乙)如图，a、b、c、d是划线的四个区域。下列叙述错误的是(　　)
A．每次划线前后都要对接种环灼烧灭菌
B．连续划线的目的是获得单个细菌形成的菌落
C．图甲中的a区域为划线的起始区域
D．蘸取菌液和划线要在酒精灯火焰旁进行
答案精析
一、
梳理教材新知
1．营养物质　生长繁殖　分离　保存
2．固体　液体　物理性质　琼脂
3．(1)碳源　氮源　(2)碳源、氮源、磷酸盐和维生素　碳源、氮源和维生素　(3)维生素　酸性　中性或弱碱性　无氧
判断正误
(1)√　(2)×　(3)×
提示　(2)培养自生固氮菌的培养基中可以不添加氮源。(3)培养不同微生物的培养基成分不完全一样，如培养自养微生物的培养基不需要碳源，培养自生固氮菌的培养基中可以不添加氮源。
探究核心知识
任务一
1．(1)固体　培养基成分中有琼脂(凝固剂)　液体　培养基中未加凝固剂　(2)水、碳源、氮源、无机盐和维生素　糖类　蛋白质　牛肉膏和蛋白胨
(3)培养基中的氮元素是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的。
2．自养　不能　圆褐固氮菌虽可以固氮，但其同化作用类型为异养型，培养基中必须提供有机碳源
3．不一定。例如，培养自养型微生物时，一般不需要添加碳源，微生物可以利用空气中的二氧化碳；培养固氮微生物时，一般不需要添加氮源，微生物可以利用空气中的氮气。
落实思维方法
1．D　[对一些微生物来说，含C、H、O、N的有机化合物可以既是碳源，又是氮源，A错误；CO2是光能自养型细菌的碳源，但不能提供能量，B错误；除水以外的无机物种类繁多、功能多样，如CO2可作自养型微生物的碳源，C错误；硝化细菌所利用的氮源是无机氮源——氨气，同时氨气的氧化过程也为硝化细菌提供用以化能合成作用的能量，D正确。]
2．C　[培养基不一定都含有碳源、氮源，如培养自养型微生物的培养基中不需要加入碳源，培养自生固氮菌的培养基中不需要加入氮源；一般固体培养基可用于观察菌落，液体培养基可用于工业生产；某些微生物不能利用淀粉，而只能利用葡萄糖、果糖、蔗糖和麦芽糖等糖类。]
二、
梳理教材新知
1．(1)温和　生物　一部分　(2)空间　衣着　(3)煮沸　巴氏
2．(1)强烈　所有　芽孢　(2)接种　培养基　(3)湿热　灼烧
判断正误
(1)√　(2)√　(3)×
提示　(3)培养基的灭菌一般采用湿热灭菌法。
探究核心知识
任务二
1．63～65　72～76　5～6　30　接种室　接种箱　超净工作台　酒精　氯气　充分燃烧　涂布器　接种环　接种针　试管口　瓶口　160～170　1～2 h　耐高温的、需要保持干燥　100 kPa、121 ℃　15～30 min　培养基
2．在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少。
3．菌体表面蛋白质变性过快而凝固成一层保护膜　杀菌能力减弱
4．无菌技术还能有效避免污染环境以及操作者自身被微生物感染。
落实思维方法
3．C　[无菌技术的关键是防止杂菌污染，A错误；无菌技术中，若处理对象为液体，可以用湿热灭菌法灭菌，D错误。]
4．B　[在100 ℃条件下煮沸5～6 min属于煮沸消毒法，B错误。]
三、
梳理教材新知
1．(1)微生物的群体　(2)单一个体　(3)纯培养物
2．配制培养基　灭菌　接种　分离　培养
3．(1)子细胞群体　(2)平板划线　稀释涂布平板　(3)①倒平板　酒精灯火焰　②连续划线　稀释分散　③未接种
判断正误
(1)×　(2)×　(3)×
提示　(1)应将配制好的培养基先进行湿热灭菌，再在无菌环境中将其分装到培养皿中。(2)倒平板时，将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基倒入培养皿，立即盖上皿盖。(3)配制培养基时应先调pH再灭菌。
探究核心知识
任务三
1．空气中的微生物在皿盖与皿底之间的培养基上滋生
2．平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，将平板倒置，既可以防止皿盖上的水珠落入培养基，又可以避免培养基中的水分过快挥发。
3．b、a、e、f、c、g、d
4．原有的微生物　上次划线的末端　每次划线时菌种数目逐渐减少　单个细胞
5．5　前后　6
6．最后一次的划线已经将微生物稀释成单个的细胞，如果与第一次的划线相连则增加了微生物的数目，得不到纯化的效果。
7．通过观察未接种平板是否有菌落存在以确定培养基是否被污染或灭菌是否彻底。
落实思维方法
5．C　[倒平板时用食指和拇指夹住培养皿的皿盖并开启一条缝隙，使其恰好能让锥形瓶瓶口伸入，随后倒入培养基，C错误。]
6．C　[题图中a对应的区域出现了单个菌落，d区域菌落最多，因此a区域应该为划线的最终区域，d区域为划线的起始区域，C错误。]

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