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(共81张PPT)
第2课时
微生物的选择培养和计数
第1章 发酵工程
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学习目标
1.阐明微生物选择培养的原理。
2.进行土壤中分解尿素的细菌的分离和计数。
内容索引
一、选择培养基、微生物的选择培养和数量测定
二、探究·实践——土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
课时对点练
选择培养基、微生物的选择培养和数量测定
一
1.选择培养基
(1)自然界中目的菌的筛选
①实例：聚合酶链式反应(PCR)中用到的耐高温的DNA聚合酶，就是从热泉中筛选出的 中提取出来的。
②依据：水生栖热菌能在 的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
水生栖热菌
梳理　教材新知
70～80 ℃
(2)实验室中目的菌的筛选
①原理：人为提供有利于 生长的条件(包括营养、温度和pH等)，同时 其他微生物的生长。
②方法：利用选择培养基分离。
选择培养基：允许 的微生物生长，同时 其他种类微生物生长的培养基。
目的菌
抑制或阻止
特定种类
抑制或阻止
2.微生物的选择培养
(1)方法：对样品进行充分稀释，然后将 涂布到制备好的 培养基上。
(2)稀释涂布平板法的操作过程
①系列稀释操作
菌液
选择
a.编号为1×102～1×107试管中分别盛有9 mL 。
b.将 g土样加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。
c.取1 mL上清液加入盛有9 mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
无菌水
10
②涂布平板操作
取菌液：取0.1 mL菌液，滴加到 表面
↓
涂布器消毒：将涂布器浸在盛有 的烧杯中
↓
涂布器灭菌：将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器 后，
再进行涂布
培养基
酒精
冷却
↓
涂布平板：用涂布器将 均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培
养皿，使涂布均匀
(3)培养：待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板 ，放入30～37 ℃的
中培养1～2 d。
菌液
倒置
恒温培养箱
3.微生物的数量测定
(1)稀释涂布平板法
①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个 。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少 。
②计数原则：一般选择菌落数为 的平板进行计数。样品的稀释度将直接影响平板上的菌落数目，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养。在同一稀释度下，应至少对 个平板进行重复计数，然后求出 。
活菌
活菌
30～300
平均值
3
③计算公式
(2)显微镜直接计数法
一种常用的、快速直观的测定微生物数量的方法。该方法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量，统计的结果一般是 的总和。
活菌数和死菌数
特别提醒
显微镜直接计数法本身不能区分细菌的死活，因此一般用来统计总菌数。但是，通过一定的辅助处理，可以实现活菌计数，如在计数前用台盼蓝染液进行染色，可以通过统计无色细胞的个数来对活菌进行计数。
(1)以尿素为唯一氮源的培养基是选择培养基(　　)
(2)脲酶能催化尿素分解产生N2，N2可作为细菌生长的氮源(　　)
提示　分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解成氨(NH3)，氨可作为细菌生长的氮源。
(3)利用显微镜直接计数法统计的细菌数量就是活菌的数量(　　)
提示　利用显微镜直接计数法统计的细菌数量无法区分死菌和活菌。
×
×
√
任务一：微生物的选择培养和计数
1.通常1 g土壤中有几亿到几百亿个土壤微生物，其中，细菌的数量最多，能分解尿素的细菌是其中的一部分。设计一种 的选择培养基，可以将分解尿素的细菌分离出来。
探究　核心知识
以尿素作为唯一氮源
2.用平板划线法接种培养结果的图片如图。请结合图片分析，平板划线法能否达到对细菌进行计数的目的？为什么？
提示　不能；平板划线法最开始的划线很可能菌类会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环的时候也会杀死一部分菌类。
3.当菌液稀释倍数足够高时，培养基表面生长的一个单菌落来源于一个活菌。用稀释涂布平板法接种培养的结果如图所示。与平板划线法相比，为什么稀释涂布平板法可以用于细菌的计数？
提示　稀释涂布平板法会进行等比稀释，在合适的稀释倍数下，均匀涂布得到的菌落互不接触，可以确定菌落的密度，再通过计算可以得知原液中的活细菌数。
4.请计算：4号试管的结果表明每克土壤中的活菌数约为 个。
5.通过稀释涂布平板法统计的菌落的数目往往比活菌实际数目 。因为
。
1.1×108
少
当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
项目 稀释涂布平板法 显微镜直接计数法
主要用具 培养基等 显微镜、____________________
等
计数依据 培养基上的 数 菌株本身
优点 计数的都是活菌 计数方便、操作简单
缺点 操作复杂、有一定误差 死菌、活菌都计数在内
6.请完善表格中稀释涂布平板法和显微镜直接计数法的比较。
血细胞计数板或细菌计
数板
菌落
核心归纳
1.选择培养基的类型
类型 条件 分离得到的菌种
改变培养条件 70～80 ℃的高温 水生栖热菌
添加某种 化学物质 加入青霉素 酵母菌、霉菌等真菌
高浓度食盐 金黄色葡萄球菌
特殊碳源、 氮源 石油是唯一碳源 能消除石油污染的微生物
营养缺陷 不加碳源 自养型微生物
不加氮源 固氮菌
核心归纳
2.两种纯化方法的比较
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
主要步骤 接种环在固体培养基表面连续划线 等比稀释操作和涂布平板操作
接种工具 接种环 涂布器
单菌落 的获得 从最后划线的区域挑取 稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落
用途 分离纯化菌种，获得单菌落 ①分离纯化菌种，获得单菌落；
②用于计数
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
菌落分布
共同点 都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可用于观察菌落特征
核心归纳
1.(2023·广东，10)研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌。根据堆肥温度变化曲线(如图)和选择培养基筛选原理来判断，下列最可能筛选到
目标菌的条件组合是
A.a点时取样、尿素氮源培养基
B.b点时取样、角蛋白氮源培养基
C.b点时取样、蛋白胨氮源培养基
D.c点时取样、角蛋白氮源培养基
√
落实　思维方法
研究目的是筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌，因此目标菌既要耐高温，又要能够高效降解角蛋白，所以应在c点取样，并且用角蛋白氮源培养基进行选择培养，D正确。
2.如图是纯化微生物时采用的两种接种方法接种后培养的效果图，下列相关叙述正确的是
A.图甲三个平板中所用培养液的稀释倍数相同
B.图甲、乙均适合分离微生物，但乙不适合对微生物进行计数
C.图甲、图乙所用的接种工具分别是接种环和涂布器
D.图乙每次划线应从同一起点开始，以便使聚集的菌种逐步稀释获得单
菌落
√
根据图甲中三个平板的菌落密度可知，三个平板中所用培养液的稀释倍数不同，A错误；
图甲、乙中若均为选择培养基，均可用于分离微生物，图乙是平板划线法接种后的结果，不适合对微生物进行计数，B正确；
稀释涂布平板法接种工具为涂布器，平板划线法接种工具为接种环，C错误；
图乙每次划线应从上一次划线的末端开始，以便使聚集的菌种逐步稀释获得单菌落，D错误。
二
探究·实践——土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1.实验设计
(1)土壤取样
①土壤要求：酸碱度接近中性且潮湿。
②取样部位：距地表约 的土壤层。
(2)样品的稀释
测定土壤中细菌的数量，一般选用 倍稀释的稀释液进行平板培养，当第一次做这个实验时可以将稀释的范围放 一点。
梳理　教材新知
3～8 cm
1×104、1×105和1×106
宽
(3)微生物的培养与观察
①培养：根据不同微生物的需要，控制适宜的培养 和培养时间。细菌一般在 ℃的温度下培养 d。
②观察
a.观察方法：每隔 h统计一次菌落数目，选取 时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而遗漏部分菌落。
b.记录菌落的特征：包括菌落的 、 和 等。
温度
30～37
1～2
24
菌落数目稳定
形状
大小
颜色
2.操作提示
(1)无菌操作：取土样的用具在使用前都需要 。
(2)做好标记：本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的 等。
(3)制定计划：对于耗时较长的生物实验，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。
灭菌
稀释度
(1)测定不同微生物数量时，接种的土壤稀释液的稀释度相同(　　)
提示　土壤中各种微生物的数量不同，因此分离不同的微生物要采用不同的稀释度。
(2)利用稀释涂布平板法统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数(　　)
提示　当两个或多个菌落连在一起时，只能观察计为一个菌落，因此利用稀释涂布平板法统计的菌落数目往往比活菌的实际数目少。
(3)菌落特征是鉴别菌种的重要依据(　　)
×
×
√
任务二：土壤中分解尿素的细菌的分离、计数与鉴定
1.测定土壤中细菌的总量和能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？为什么？
探究　核心知识
提示　不相同；因为土壤中能分解尿素的细菌的数量比细菌的总量要少。
2.甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
(1)甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230，该同学的统计结果 (填“可靠”或“不可靠”)。若不可靠，应如何改进？
提示　为增加实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下至少涂布3个平板，统计结果后计算平均值。
不可靠
(2)乙同学在该浓度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学将21舍去，然后取平均值。该同学对实验结果的处理______
(填“合理”或“不合理”)。微生物计数时，如果实验中出现重复实验的结果差别很大的情况，应_______________________________________
。
不合理
分析实验过程中可能的影响因素，从操作是
否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因
目的 现象 结论
是否有杂菌污染的判断 ___________________________ 未被杂菌污染
培养物中菌落形态多样，菌落数偏高 培养物中混入其他杂菌
选择培养基是否起筛选作用 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目 选择培养基上的数目 选择培养基具有筛选作用
3.尝试完成下表中对微生物的分离与计数实验结果的分析。
对照组的培养基中无菌落生长
大于
4.利用尿素作为唯一氮源的培养基分离出的微生物都是能分解尿素的微生物吗？并说明理由。
提示　不一定；因为有些微生物可以利用能分解尿素的细菌的代谢物进行生长繁殖。
5.细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解菌。依据以上原理，如何对分离得到的微生物是否是分解尿素的细菌作进一步鉴定？
提示　在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，接种并培养初步筛选的菌种，若菌落周围出现红色环带，则可说明该菌种能够分解尿素。
选择培养基与鉴别培养基
核心归纳
项目 选择培养基 鉴别培养基
特殊成分 加入某种化学物质 加入某种指示剂或化学药品
目的 抑制或阻止其他微生物生长，促进目的微生物生长 与微生物的代谢物或培养基中的成分发生特定反应
用途 培养、分离出特定微生物 鉴别不同的微生物
举例 培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌生长；用以尿素作为唯一氮源的培养基来培养尿素分解菌 可用伊红—亚甲蓝琼脂培养基鉴定饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，菌落呈深紫色，并有金属光泽)
3.下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验操作的叙述，不正确的是
A.利用稀释涂布平板法准确估计菌落数目的关键是有恰当的稀释度
B.若要判断选择培养基是否起到了选择作用，需要设置未接种的牛肉膏
蛋白胨培养基作为对照
C.该实验应采用稀释涂布平板法
D.用以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基来培养该细菌后不
会使酚红指示剂变红
√
落实　思维方法
利用稀释涂布平板法估算菌落数目的关键是有恰当的稀释度，若稀释倍数太低、菌落数目太多，会连在一起，稀释倍数太高，平板上菌落数目过少，都不宜进行计数，A正确；
若要判断选择培养基是否起到了选择作用，需设置接种在没有选择作用的细菌通用的牛肉膏蛋白胨培养基上培养作为对照，B错误；
分解尿素的细菌能合成脲酶，将尿素分解产生氨，使培养基的碱性增强，用以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基来培养该细菌，能维持pH稳定，不会使酚红指示剂变红，D正确。
4.(2023·连云港高二期末)在做“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”的实验时，甲同学从对应稀释倍数为106的培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只筛选出大约50个菌落。下列有关叙述错误的是
A.甲同学出现这种结果的原因可能是土样不同，也可能是操作过程出了
问题
B.将甲同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养作为空白对照，
可以证明培养基是否受到污染
C.让其他同学用与甲同学一样的土壤进行实验，如果结果与甲同学一致，
则可以证明甲同学无误
D.B、C选项的实验思路都遵循了实验的对照原则
√
B选项的实验思路遵循了实验的对照原则，C选项的实验思路遵循了实验的重复原则，D错误。
网络构建
课时对点练
三
题组一　选择培养基和微生物的选择培养
1.(2022·江苏，3)下列是某同学分离高产脲酶菌的实验设计，不合理的是
A.选择农田或公园土壤作为样品分离目的菌株
B.在选择培养基中需添加尿素作为唯一氮源
C.适当稀释样品是为了在平板上形成单菌落
D.可分解酚红指示剂使其褪色的菌株是产脲酶菌
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农田或公园土壤中含有较多的产脲酶的微生物，A合理；
为了筛选可分解尿素的细菌，配制的培养基应选择尿素作为唯一氮源，能合成脲酶的微生物在该培养基上能生长，B合理；
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，C合理；
在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的pH升高，酚红指示剂将变红，因此在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，能对分离的菌种做进一步鉴定，D不合理。
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2.(2023·邢台高二期中)原油中含有大量有害的、致癌的多环芳烃。土壤中有些细菌可以利用原油中的多环芳烃为碳源，在培养基中形成分解圈。为筛选出能高效降解原油的菌株并投入除污，某小组同学设计了相关实验。下列有关实验的叙述，不正确的是
A.应配制来源于被原油污染土壤的土壤稀释液备用
B.配制以多环芳烃为唯一碳源的选择培养基
C.将土壤稀释液灭菌后接种到选择培养基上
D.在选择培养基上能形成分解圈的即为所需菌种
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若将土壤稀释液进行灭菌，则不能筛选出能高效降解原油的菌株，C错误。
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3.油烟污染由多种有害物质组成，不易降解。某同学从长期受到油烟污染的环境中分离出油烟降解菌，其筛选分离过程如图所示。下列叙述正确的是
A.图中①～③的过程为梯度
稀释
B.在培养基中加入油烟污染
物，其作用是为微生物提
供碳源和能源
C.④使用的是固体培养基，需加入琼脂作为微生物生长繁殖的营养物质
D.过程④可采用稀释涂布平板法或平板划线法分离菌种并进行计数
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图中①～③的过程中加入油烟污染物作为唯一碳源，能够初步筛选出能分解油烟的微生物，故该过程称为选择培养，A错误；
配制固体培养基时加入琼
脂，其作用是作为凝固剂，
而不是为微生物生长提供
碳源，C错误；
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分离菌种常用的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法，但对活菌进行计数时常用稀释涂布平板法而不能用平板划线法，D错误。
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4.(2024·广州高二期末)稀释涂布平板法是微生物培养与计数中常用的方法，下列叙述错误的是
A.由于土壤中细菌的数量庞大，需将土壤溶液稀释后再涂布在选择培养
基上培养计数
B.稀释涂布平板法操作时可用无菌水进行稀释
C.涂布器使用前和使用后均需要灼烧灭菌
D.在同一稀释度下至少对3个平板进行重复计数，统计的菌落数目往往比
活菌数目多
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当两个或多个细胞连在一起时，平板上只能观察到一个菌落，因此统计的菌落数目往往比活菌的数目少，D错误。
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5.(2024·玉溪高二期中)从自然界筛选嗜盐菌(好氧型)的一般步骤：采集菌样→富集培养→纯种分离→计数及性能测定。图1表示上述步骤中的一个环节，图2表示该筛选过程中一个培养基上菌落的分布情况，其中白色部分为透明圈，黑点代表大小不同的菌落。下列相关叙述正确的是
A.富集培养必须在固体培养基中进行
B.图1所示的接种方法也适用于对细
菌进行计数
C.图2中嗜盐菌的耐盐性能最强的是乙
D.按用途划分，图1所示的培养基属于鉴别培养基
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富集培养一般在液体培养基中进行，A错误；
图1所示的接种方法是平板划线法，该方法不适于对细菌进行计数，B错误；
图2中的乙菌落的透明圈直径/菌
落直径最大，说明该菌落嗜盐菌
的耐盐性能最强，C正确；
图1所示的培养基属于选择培养基，D错误。
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题组二　微生物的数量测定
6.(2023·无锡高二质检)养殖池中存在的有毒物质主要是氨及亚硝酸，这两种物质可被硝化细菌吸收利用。在“养殖池底泥中硝化细菌的分离和计数”实验中，下列说法正确的是
A.需要配制添加一定浓度铵盐的牛肉膏蛋白胨培养基，以筛选硝化细菌
B.应对采集底泥使用的工具进行灭菌，全部接种过程均需在酒精灯火焰旁进行
C.采用平板划线法进行分离和计数时，还需与未接种的空白培养基同时培养
D.若空白对照组上长出了菌落，需要在实验组数据的基础上减去空白对照组的
菌落数
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要分离硝化细菌，应该用以铵盐为唯一氮源的培养基，培养基中不能加入牛肉膏蛋白胨，A错误；
平板划线法不能用于菌落计数，C错误；
若空白对照组上长出了菌落，则说明培养基被污染了，实验数据无效，需重新实验，D错误。
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7.下列有关稀释涂布平板法计数和显微镜直接计数法的叙述，不正确的是
A.利用血细胞计数板计数属于显微镜直接计数法，其缺点是不能区分死
菌与活菌
B.两种计数方法，其统计值与实际值相比，均有差异，但产生差异的原
因不同
C.两种计数方法均能在计数的同时观察到所研究微生物的形态特征
D.当菌落数目稳定时，一般选取菌落数在30～300的且差异不大的平板进
行计数
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显微镜直接计数法无法区分死菌和活菌，A正确；
稀释涂布平板法计数时，当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，故而统计值比实际值小；显微镜直接计数法计数时不能区分死菌和活菌，故测定的微生物数量往往大于实际的活菌数，因此两种计数方法其统计值与实际值相比，均有差异，但产生差异的原因不同，B正确；
稀释涂布平板法观察到的是菌落的形态特征，而不是微生物的形态特征，显微镜直接计数法观察到的是微生物的形态特征，C错误。
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8.(2024·西宁高二期中)如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验示意图。据图分析，下列相关叙述错误的是
A.4号试管中稀释液进行平板培养
得到的菌落平均数可能是5号试
管中的10倍
B.5号试管中稀释液进行平板培养
的结果表明每克该土壤中的菌
株数目为1.7×106个
C.当样品稀释度足够高时，一般平板上一个单菌落来源于一个活菌
D.某一稀释度下至少涂布3个平板，确保实验结果的准确性
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5号试管中稀释液进行平板培养的结果表明，每克土壤中的菌株数为(168＋175＋167)÷3÷0.1×106＝1.7×109(个)，B错误。
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9.(2021·山东，14)解脂菌能利用分泌的脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸并吸收利用。脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色。将不能直接吸收脂肪的甲、乙两种菌分别等量接种在醇溶青琼脂平板上培养。甲菌菌落周围呈现深蓝色，乙菌菌落周围不变色，下列说法错误的是
A.甲菌属于解脂菌
B.实验中所用培养基以脂肪为唯一碳源
C.可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比
D.该平板可用来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力
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根据题干信息“甲菌菌落周围呈现深蓝色”，说明甲菌可以分泌脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸，脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色，因此甲菌属于解脂菌，A正确；
乙菌落周围没有出现深蓝色，说明乙菌落不能产生脂肪酶，不能利用脂肪为其供能，但乙菌落也可以在培养基上生存，说明该培养基不是以脂肪为唯一碳源，B错误；
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可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比，更加直观，C正确；
可以利用该平板来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力，观察指标可以是菌落周围深蓝色圈的大小，D正确。
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10.筛选是分离和培养微生物新类型常用的手段，下列有关技术中不能筛选成功的是
A.在全营养的LB培养基(普通培养基)中，筛选大肠杆菌
B.在尿素固体培养基中，筛选能够分解尿素的微生物
C.用以纤维素为唯一碳源的培养基，筛选能分解纤维素的微生物
D.在培养基中加入不同浓度的氯化钠，筛选抗盐突变体的微生物
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在全营养的LB培养基(普通培养基)中，几乎所有细菌都能生长，不能筛选大肠杆菌，A符合题意；
在尿素固体培养基中，只有能分解尿素的微生物才能生长，不能分解尿素的微生物因缺乏氮源不能生长，能够筛选分解尿素的微生物，B不符合题意；
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在以纤维素为唯一碳源的培养基中，只有能分解纤维素的微生物才能生长，不能分解纤维素的微生物因缺乏碳源不能生长，能够筛选分解纤维素的微生物，C不符合题意；
在培养基中加入不同浓度的氯化钠，只有抗盐的微生物才能生长，故可用于筛选抗盐突变体的微生物，D不符合题意。
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11.(2023·重庆高二期中)精氨酸依赖型菌株不能在缺少精氨酸的培养基上正常生长，但可作为鸟氨酸发酵的优良菌种。如图为野生型谷氨酸棒状杆菌经诱变获得精氨酸依赖型菌并进行筛选的过程示意图。下列相关叙述不正确的是
A.野生型菌液的培养皿中不会
出现菌落
B.乙培养基与甲相比可能缺少了精氨酸
C.紫外线照射可导致谷氨酸棒状杆菌发生可遗传变异
D.乙中的菌落A为鸟氨酸发酵的优良菌种
√
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由图观察可知，乙中的菌落A是野生型菌种，菌落B为精氨酸依赖型菌株，B可作为鸟氨酸发酵的优良菌种，D错误。
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12.某生物兴趣小组试图探究山羊瘤胃中的微生物对尿素是否有分解作用，设计了以下实验，并成功筛选到能降解尿素的细菌(目的菌)。实验步骤如图所示。请回答下列问题：
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稀释倍数 103 104 105 106 107
菌落数 500 367 248 36 18
(1)该实验中所用培养基在成分上的特殊要求是____________________；培养基中的KH2PO4和Na2HPO4的作用有__________________________
_______________________。
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稀释倍数 103 104 105 106 107
菌落数 500 367 248 36 18
以尿素为唯一氮源
为细菌生长提供无机盐、作为缓冲液维持培养液的pH
(2)实验中采用的分离纯化细菌的方法是_______
_________。实验过程中，除了需将接种后的平
板放在适宜的环境中培养一段时间后观察，还
需要设置在相同条件下培养的_______________
_____，作为对照实验，其目的是____________
____________。
稀释倍数 103 104 105 106 107
菌落数 500 367 248 36 18
稀释涂
布平板法
未接种的空白培
养基
检测培养基
是否被污染
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稀释倍数 103 104 105 106 107
菌落数 500 367 248 36 18
(3)为了计数细菌，将取自瘤胃中的液体进行稀释，
接种在培养基上，放置在37 ℃恒温培养箱中培养
24～48 h，统计菌落数，结果如上表。其中____
______倍的稀释倍数比较适合计数。有同学认为，
该计数方法统计的细菌数目会比实际数目_____，
他的理由是________________________________
_______________________。
105
或106
偏小
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当两个或多个细胞连在一起时，平板
上观察到的只是一个菌落
13.(2023·龙岩高二期末)某种在田间广泛使用的除草剂(含氮有机化合物)在土壤中不易降解，长期使用会污染土壤。为修复被该除草剂污染的土壤，可按下面程序选育能有效降解该除草剂的细菌(已知该除草剂在水中溶解度一定，该除草剂的培养基不透明，培养皿中会残留少量无菌空气)。回答下列问题：
1
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(1)制备土壤浸出液时，为避免菌体浓度过高，需将浸出液进行________处理。
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稀释
(2)要从长期使用该除草剂的土壤中分离目的菌，从物理性质、营养成分的角度要求上述培养基具备的特点是_______________________________。若需要调节培养基pH，应在灭菌_____(填“前”或“后”)进行。对培养基进行灭菌，常采用__________法。
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以除草剂为唯一氮源的固体培养基
前
湿热灭菌
(3)图中形成的菌落中，无透明带菌落利用的氮源可能是_____，有透明带菌落利用的氮源主要是__________，据此可筛选出目的菌。
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N2
该除草剂
根据题中信息“该除草剂的培养基不透明”，则可知无透明带菌落利用的氮源并不是除草剂，而是空气中的N2，有透明带菌落利用的氮源为该除草剂。
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(4)若对活菌进行计数，常用的接种方法为______________。为了测定微生物的数量，一位同学在4个平板培养基上分别接种稀释倍数为106的土壤样液 0.1 mL，培养后菌落数目分别为155、160、176、149，则每毫升原土壤样液中上述微生物数量为________个。
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稀释涂布平板法
1.6×109
接种微生物常用平板划线法和稀释涂布平板法，其中稀释涂布平板法还可用于对微生物进行计数。在4个平板培养基上分别接种稀释倍数为106的土壤样液0.1 mL，
培养后菌落数目分别为
155、160、176、149，
则每毫升原土壤样液中
上述微生物数量为(155＋
160＋176＋149)÷4÷0.1×106＝1.6×109(个)。
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13第2课时　微生物的选择培养和计数
[学习目标]　1.阐明微生物选择培养的原理。2.进行土壤中分解尿素的细菌的分离和计数。
一、选择培养基、微生物的选择培养和数量测定
1．选择培养基
(1)自然界中目的菌的筛选
①实例：聚合酶链式反应(PCR)中用到的耐高温的DNA聚合酶，就是从热泉中筛选出的____________中提取出来的。
②依据：水生栖热菌能在________的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
(2)实验室中目的菌的筛选
①原理：人为提供有利于________生长的条件(包括营养、温度和pH等)，同时____________其他微生物的生长。
②方法：利用选择培养基分离。
选择培养基：允许__________的微生物生长，同时___________其他种类微生物生长的培养基。
2．微生物的选择培养
(1)方法：对样品进行充分稀释，然后将______涂布到制备好的______培养基上。
(2)稀释涂布平板法的操作过程
①系列稀释操作
a．编号为1×102～1×107试管中分别盛有9 mL________。
b．将____ g土样加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。
c．取1 mL上清液加入盛有9 mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
②涂布平板操作
取菌液：取0.1 mL菌液，滴加到______表面
↓
涂布器消毒：将涂布器浸在盛有_____的烧杯中
↓
涂布器灭菌：将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器_____后，再进行涂布
↓
涂布平板：用涂布器将_____均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀
(3)培养：待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板_____，放入30～37 ℃的__________中培养1～2 d。
3．微生物的数量测定
(1)稀释涂布平板法
①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个______。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少______。
②计数原则：一般选择菌落数为__________的平板进行计数。样品的稀释度将直接影响平板上的菌落数目，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养。在同一稀释度下，应至少对______个平板进行重复计数，然后求出________。
③计算公式
每克样品中的菌株数＝×稀释倍数
(2)显微镜直接计数法
一种常用的、快速直观的测定微生物数量的方法。该方法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量，统计的结果一般是________________的总和。
特别提醒　显微镜直接计数法本身不能区分细菌的死活，因此一般用来统计总菌数。但是，通过一定的辅助处理，可以实现活菌计数，如在计数前用台盼蓝染液进行染色，可以通过统计无色细胞的个数来对活菌进行计数。
判断正误
(1)以尿素为唯一氮源的培养基是选择培养基(　　)
(2)脲酶能催化尿素分解产生N2，N2可作为细菌生长的氮源(　　)
(3)利用显微镜直接计数法统计的细菌数量就是活菌的数量(　　)
任务一：微生物的选择培养和计数
1．通常1 g土壤中有几亿到几百亿个土壤微生物，其中，细菌的数量最多，能分解尿素的细菌是其中的一部分。设计一种____________________的选择培养基，可以将分解尿素的细菌分离出来。
2.用平板划线法接种培养结果的图片如图。请结合图片分析，平板划线法能否达到对细菌进行计数的目的？为什么？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
3.当菌液稀释倍数足够高时，培养基表面生长的一个单菌落来源于一个活菌。用稀释涂布平板法接种培养的结果如图所示。与平板划线法相比，为什么稀释涂布平板法可以用于细菌的计数？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
4．请计算：4号试管的结果表明每克土壤中的活菌数约为__________个。
5．通过稀释涂布平板法统计的菌落的数目往往比活菌实际数目____。因为______________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
6．请完善表格中稀释涂布平板法和显微镜直接计数法的比较。
项目 稀释涂布平板法 显微镜直接计数法
主要用具 培养基等 显微镜、____________________等
计数依据 培养基上的______数 菌株本身
优点 计数的都是活菌 计数方便、操作简单
缺点 操作复杂、有一定误差 死菌、活菌都计数在内
1．选择培养基的类型
类型 条件 分离得到的菌种
改变培养条件 70～80 ℃的高温 水生栖热菌
添加某种化学物质 加入青霉素 酵母菌、霉菌等真菌
高浓度食盐 金黄色葡萄球菌
特殊碳源、氮源 石油是唯一碳源 能消除石油污染的微生物
营养缺陷 不加碳源 自养型微生物
不加氮源 固氮菌
2.两种纯化方法的比较
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
主要步骤 接种环在固体培养基表面连续划线 等比稀释操作和涂布平板操作
接种工具 接种环 涂布器
单菌落的获得 从最后划线的区域挑取 稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落
用途 分离纯化菌种，获得单菌落 ①分离纯化菌种，获得单菌落； ②用于计数
菌落分布
共同点 都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可用于观察菌落特征
1．(2023·广东，10)研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌。根据堆肥温度变化曲线(如图)和选择培养基筛选原理来判断，下列最可能筛选到目标菌的条件组合是(　　)
A．a点时取样、尿素氮源培养基
B．b点时取样、角蛋白氮源培养基
C．b点时取样、蛋白胨氮源培养基
D．c点时取样、角蛋白氮源培养基
2．如图是纯化微生物时采用的两种接种方法接种后培养的效果图，下列相关叙述正确的是(　　)
A．图甲三个平板中所用培养液的稀释倍数相同
B．图甲、乙均适合分离微生物，但乙不适合对微生物进行计数
C．图甲、图乙所用的接种工具分别是接种环和涂布器
D．图乙每次划线应从同一起点开始，以便使聚集的菌种逐步稀释获得单菌落
二、探究·实践——土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1．实验设计
(1)土壤取样
①土壤要求：酸碱度接近中性且潮湿。
②取样部位：距地表约_____________________________________________的土壤层。
(2)样品的稀释
测定土壤中细菌的数量，一般选用____________________________倍稀释的稀释液进行平板培养，当第一次做这个实验时可以将稀释的范围放____一点。
(3)微生物的培养与观察
①培养：根据不同微生物的需要，控制适宜的培养________和培养时间。细菌一般在______ ℃的温度下培养______ d。
②观察
a．观察方法：每隔____ h统计一次菌落数目，选取______________时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而遗漏部分菌落。
b．记录菌落的特征：包括菌落的________、______和______等。
2．操作提示
(1)无菌操作：取土样的用具在使用前都需要______。
(2)做好标记：本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的________等。
(3)制定计划：对于耗时较长的生物实验，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。
判断正误
(1)测定不同微生物数量时，接种的土壤稀释液的稀释度相同(　　)
(2)利用稀释涂布平板法统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数(　　)
(3)菌落特征是鉴别菌种的重要依据(　　)
任务二：土壤中分解尿素的细菌的分离、计数与鉴定
1．测定土壤中细菌的总量和能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？为什么？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
2．甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
(1)甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230，该同学的统计结果_________(填“可靠”或“不可靠”)。若不可靠，应如何改进？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
(2)乙同学在该浓度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学将21舍去，然后取平均值。该同学对实验结果的处理__________(填“合理”或“不合理”)。微生物计数时，如果实验中出现重复实验的结果差别很大的情况，应________________________
_______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________。
3．尝试完成下表中对微生物的分离与计数实验结果的分析。
目的 现象 结论
是否有杂菌污染的判断 未被杂菌污染
培养物中菌落形态多样，菌落数偏高 培养物中混入其他杂菌
选择培养基是否起筛选作用 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目_____选择培养基上的数目 选择培养基具有筛选作用
4.利用尿素作为唯一氮源的培养基分离出的微生物都是能分解尿素的微生物吗？并说明理由。
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
5．细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解菌。依据以上原理，如何对分离得到的微生物是否是分解尿素的细菌作进一步鉴定？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
　选择培养基与鉴别培养基
项目 选择培养基 鉴别培养基
特殊成分 加入某种化学物质 加入某种指示剂或化学药品
目的 抑制或阻止其他微生物生长，促进目的微生物生长 与微生物的代谢物或培养基中的成分发生特定反应
用途 培养、分离出特定微生物 鉴别不同的微生物
举例 培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌生长；用以尿素作为唯一氮源的培养基来培养尿素分解菌 可用伊红—亚甲蓝琼脂培养基鉴定饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，菌落呈深紫色，并有金属光泽)
3．下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验操作的叙述，不正确的是(　　)
A．利用稀释涂布平板法准确估计菌落数目的关键是有恰当的稀释度
B．若要判断选择培养基是否起到了选择作用，需要设置未接种的牛肉膏蛋白胨培养基作为对照
C．该实验应采用稀释涂布平板法
D．用以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基来培养该细菌后不会使酚红指示剂变红
4．(2023·平顶山高二期末)在做“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”的实验时，甲同学从对应稀释倍数为106的培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只筛选出大约50个菌落。下列有关叙述错误的是(　　)
A．甲同学出现这种结果的原因可能是土样不同，也可能是操作过程出了问题
B．将甲同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养作为空白对照，可以证明培养基是否受到污染
C．让其他同学用与甲同学一样的土壤进行实验，如果结果与甲同学一致，则可以证明甲同学无误
D．B、C选项的实验思路都遵循了实验的对照原则
答案精析
一、
梳理教材新知
1．(1)①水生栖热菌　②70～80 ℃　(2)①目的菌　抑制或阻止　②特定种类　抑制或阻止
2．(1)菌液　选择　(2)①a.无菌水　b．10　②培养基　酒精　冷却　菌液　(3)倒置　恒温培养箱
3．(1)①活菌　活菌　②30～300　3　平均值　(2)活菌数和死菌数
判断正误
(1)√　(2)×　(3)×
提示　(2)分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解成氨(NH3)，氨可作为细菌生长的氮源。(3)利用显微镜直接计数法统计的细菌数量无法区分死菌和活菌。
探究核心知识
任务一
1．以尿素作为唯一氮源
2．不能；平板划线法最开始的划线很可能菌类会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环的时候也会杀死一部分菌类。
3．稀释涂布平板法会进行等比稀释，在合适的稀释倍数下，均匀涂布得到的菌落互不接触，可以确定菌落的密度，再通过计算可以得知原液中的活细菌数。
4．1.1×108
5．少　当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
6．血细胞计数板或细菌计数板　菌落
落实思维方法
1．D　[研究目的是筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌，因此目标菌既要耐高温，又要能够高效降解角蛋白，所以应在c点取样，并且用角蛋白氮源培养基进行选择培养，D正确。]
2．B　[根据图甲中三个平板的菌落密度可知，三个平板中所用培养液的稀释倍数不同，A错误；图甲、乙中若均为选择培养基，均可用于分离微生物，图乙是平板划线法接种后的结果，不适合对微生物进行计数，B正确；稀释涂布平板法接种工具为涂布器，平板划线法接种工具为接种环，C错误；图乙每次划线应从上一次划线的末端开始，以便使聚集的菌种逐步稀释获得单菌落，D错误。]
二、
梳理教材新知
1．(1)②3～8 cm　(2)1×104、1×105和1×106　宽　(3)①温度　30～37　1～2　②a.24　菌落数目稳定　b．形状　大小　颜色
2．(1)灭菌　(2)稀释度
判断正误
(1)×　(2)×　(3)√
提示　(1)土壤中各种微生物的数量不同，因此分离不同的微生物要采用不同的稀释度。(2)当两个或多个菌落连在一起时，只能观察计为一个菌落，因此利用稀释涂布平板法统计的菌落数目往往比活菌的实际数目少。
探究核心知识
任务二
1．不相同；因为土壤中能分解尿素的细菌的数量比细菌的总量要少。
2．(1)不可靠　为增加实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下至少涂布3个平板，统计结果后计算平均值。
(2)不合理　分析实验过程中可能的影响因素，从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因
3．对照组的培养基中无菌落生长　大于
4．不一定；因为有些微生物可以利用能分解尿素的细菌的代谢物进行生长繁殖。
5．在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，接种并培养初步筛选的菌种，若菌落周围出现红色环带，则可说明该菌种能够分解尿素。
落实思维方法
3．B　[利用稀释涂布平板法估算菌落数目的关键是有恰当的稀释度，若稀释倍数太低、菌落数目太多，会连在一起，稀释倍数太高，平板上菌落数目过少，都不宜进行计数，A正确；若要判断选择培养基是否起到了选择作用，需设置接种在没有选择作用的细菌通用的牛肉膏蛋白胨培养基上培养作为对照，B错误；分解尿素的细菌能合成脲酶，将尿素分解产生氨，使培养基的碱性增强，用以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基来培养该细菌，能维持pH稳定，不会使酚红指示剂变红，D正确。]
4．D　[B选项的实验思路遵循了实验的对照原则，C选项的实验思路遵循了实验的重复原则，D错误。]

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