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(共76张PPT)
第1节
重组DNA技术的基本工具
第3章 基因工程
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学习目标
阐明重组DNA技术所需的三种基本工具及其作用。
内容索引
一、基因工程的概念和工具酶
二、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
课时对点练
基因工程的概念和工具酶
一
1.基因工程：指按照人们的愿望，通过 等技术，赋予生物______
，创造出更符合人们需要的 。由于基因工程是在 水平上进行设计和施工的，因此又叫作_________
。
转基因
梳理　教材新知
新的遗
传特性
新的生物类型和生物产品
DNA分子
重组DNA
技术
来源 主要来自________
种类 数千种
作用 识别双链DNA分子的 ，并且使每一条链中
的 断开
结果 产生 或平末端
2.基因工程的工具酶
(1)限制性内切核酸酶(限制酶)——“分子手术刀”
原核生物
特定核苷酸序列
特定部位
磷酸二酯键
黏性末端
种类 来源 特点
DNA连接酶 _________ E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶
T4 DNA连接酶 T4噬菌体
(2)DNA连接酶——“分子缝合针”
①作用：将 连接起来，恢复被 切开的两个核苷酸之间的 。
②种类
两个DNA片段
限制酶
磷酸二酯键
E.coli
大肠杆菌
特别提醒
DNA连接酶无识别的特异性，对于相同(或互补)的黏性末端以及平末端都能连接。所以，限制酶种类多，DNA连接酶种类少。
(1)基因工程可以实现遗传物质在不同物种间的转移，人们可以定向选育新品种(　　)
(2)限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列(　　)
提示　大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
(3)DNA连接酶能将两碱基通过氢键连接起来(　　)
提示　DNA连接酶能将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
×
×
√
(4)限制酶和解旋酶的作用部位相同(　　)
提示　限制酶和解旋酶的作用部位不同，限制酶作用于磷酸二酯键，解旋酶作用于氢键。
×
任务一：基因工程的理论基础
1.基因工程操作导致的基因重组与有性生殖中的基因重组的主要区别：有性生殖中的基因重组是随机的，并且只能在 间进行重组；基因工程可以实现遗传物质在 间进行重组，并且方向性强，可以
改变生物的性状。
2.为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？
探究　核心知识
提示　(1)DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。
(2)双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。
同一物种
不同物种
定向地
3.为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？
提示　(1)基因是控制生物性状的独立遗传单位。
(2)遗传信息的传递都遵循中心法则。
(3)生物界共用一套遗传密码。
任务二：限制性内切核酸酶(限制酶)
1.请结合限制酶的作用特点，回答以下问题：
(1)限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？
提示　不能。
(2)请结合图示推断，限制酶切割一次可断开 个磷酸二酯键；产生 个游离的磷酸基团；产生 个黏性末端；消耗 分子水。
2
2
2
2
2.推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？
提示　限制酶是原核生物的一种防御工具，用来切割侵入细胞的外源DNA，以保证自身安全。
3.限制酶不切割细菌本身的DNA分子的可能原因是___________________
_______________________________________________________________
_________________________________________________(答出两点)。
含某种限制酶的细菌
的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开
4.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ进行切割，B片段分别用限制酶Hind Ⅲ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如图。
(1)请写出限制酶SpeⅠ、HindⅢ、XbaⅠ和XhoⅠ切割形成的黏性末端。
提示　SpeⅠ： 　HindⅢ：
XbaⅠ： 　 XhoⅠ：
(2)不同限制酶切割 (填“可能”或“不可能”)产生相同的黏性末端。
(3)限制酶________切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeⅠ切割A片段产生的DNA片段相连接，因为__________________________________
；连接完成后，该重组DNA分子的新连接处 (填“能”或“不能”)再被所用的限制酶切割，因为________________________________
___________________________________。
可能
XbaⅠ
XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性
末端
不能
所用的两种限制酶均不能识别该重组
DNA分子的新连接处的脱氧核苷酸序列
与DNA相关的几种酶的比较
核心归纳
项目 DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶
作用部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 氢键
作用对象 DNA片段 DNA 单个的脱氧核苷酸 DNA
作用结果 将两个DNA片段连接成完整的DNA分子 切割DNA分子 将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端 将双链DNA分子局部解旋为单链
拓展延伸
1.回文序列
限制酶特异性识别和切割的部位具有回文序列，即在切割部位，一条链正向读的碱基顺序，与另一条链反向读的顺序完全一致。例如：EcoRⅠ限制酶识别的DNA序列为 ，为回文序列。
拓展延伸
2.同尾酶
识别DNA 分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA 片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶(目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列)来获取目的基因。
1.如图是几种不同限制酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列叙述正确的是
A.以上DNA片段是由4种限制酶切割后产生的
B.②片段是在识别序列为 的限制酶作用下形成的
C.①和④两个片段在DNA聚合酶的作用下可形成重组DNA分子
D.限制酶和DNA连接酶作用的部位都是磷酸二酯键
√
落实　思维方法
图中①④是同一种限制酶切割形成的，因此以上DNA片段是由3种限制酶切割后产生的，A错误；
②片段是在识别序列为 的限制酶作用下形成的，B错误；
①④连接形成重组DNA分子需要的是DNA连接酶，C错误。
DNA连接酶可以连接平末端或互补配对的黏性末端，而非任意的两个DNA片段，A错误。
2.DNA连接酶是基因工程的必需工具。下列有关DNA连接酶的叙述，错误的是
A.DNA连接酶可以将任意的两个DNA片段连接成一个重组DNA分子
B.DNA连接酶发挥作用时不需要识别特定的脱氧核苷酸序列
C.DNA连接酶可以催化两个脱氧核苷酸之间磷酸二酯键的形成
D.有些DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端
√
二
基因进入受体细胞的载体
——“分子运输车”
1.种类：质粒、 、动植物病毒等。
2.常用载体——质粒
(1)本质：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有 能力的环状双链DNA分子。
梳理　教材新知
噬菌体
自我复制
条件 原因
具有 ，供外源DNA片段插入其中 载体要与外源DNA片段连接
____________________________________________________________________ 能使携带的外源DNA片段在受体细胞中稳定存在
具有特殊的_________ 便于重组DNA分子的_____
无毒害作用 对受体细胞无毒害作用，避免受体细胞受到损伤
(2)质粒作为载体所具备的条件及原因
一个至多个限制酶切割位点
能在受体细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制
标记基因
筛选
(3)作用
①作为运输工具，将外源基因导入 。
②质粒携带 在细胞内大量复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
细胞
外源DNA片段
(1)作为载体的质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因(　　)
提示　作为载体的质粒通常采用抗生素抗性基因作为筛选标记基因。
(2)质粒是环状双链DNA分子，是基因工程常用的载体(　　)
(3)载体(如质粒)和细胞膜上的载体蛋白的成分相同(　　)
提示　载体(如质粒)的成分是DNA，细胞膜上的载体的主要成分是蛋白质。
(4)DNA重组技术所需要的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体(　　)
提示　DNA重组技术所需要的工具酶有限制酶、DNA连接酶，载体不属于工具酶。
×
√
×
×
任务三：载体需具备的条件和载体的选择
1.根据标记基因的作用，有同学认为在含有某种抗生素的培养基中筛选存活的受体细胞 (填“一定”或“不一定”)是导入目的基因的受体细胞，理由是_________________________________________________
_________________。
2.若用家蚕细胞作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用 作为载体，原因是______________________
。
探究　核心知识
不一定
仅导入空载体的和导入含目的基因载体的受体细胞均能在该培养基中存活
噬菌体
噬菌体的宿主细胞是细菌
等微生物，而不是家蚕
核心归纳
1.标记基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的
培养基上，能够生
存的是被导入了载
体的受体细胞。如
图所示：
核心归纳
2.如何提高筛选的准确性
当质粒上有两个标记基因时，可将目的基因插入其中一个标记基因中，也就是重组质粒上只含有一个标记基因，普通质粒上含有两个标记基因。则没有导入质粒的受体细胞不具有标记基因控制的性状，导入普通质粒的受体细胞具有两个标记基因控制的性状，导入重组质粒的受体细胞只具有一个标记基因控制的性状。这样可根据标记基因控制的性状准确筛选出含有重组质粒的受体细胞。
3.(2023·广州高二联考)质粒是基因工程中最常用的目的基因运载工具。下列有关叙述正确的是
A.质粒是只存在于细菌细胞质中能自我复制的小型环状双链DNA分子
B.在所有的质粒上总能找到一个或多个限制酶切割位点
C.携带目的基因的重组质粒只有整合到受体细胞的染色体DNA上才会随
后者的复制而复制
D.质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA的筛选
√
落实　思维方法
质粒不只分布于原核生物中，在真核生物如酵母菌细胞内也有分布，A错误；
并不是所有的质粒上都能找到限制酶的切割位点而成为适合运载目的基因的工具，B错误；
重组质粒进入受体细胞后，可以在细胞内自我复制，或整合到受体细胞染色体DNA上后复制，C错误。
4.某细菌质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)示意图。请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是
插入点 细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况 细菌在含四环素的培养基上的生长状况
① 能生长 能生长
② 能生长 不能生长
③ 不能生长 能生长
A.①是c；②是b；③是a
B.①是a和b；②是a；③是b
C.①是a和b；②是b；③是a
D.①是c；②是a；③是b
√
插入点 细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况 细菌在含四环素的培养基上的生长状况
① 能生长 能生长
② 能生长 不能生长
③ 不能生长 能生长
网络构建
课时对点练
三
题组一　基因工程的概念和工具酶
1.玉米的PEPC酶固定CO2的能力较水稻的强60倍。我国科学家正致力于将玉米的PEPC基因导入水稻中，以提高水稻产量。下列有关该应用技术的叙述，不正确的是
A.该技术是在DNA水平上进行设计和施工的
B.该技术的操作环境是生物体内
C.该技术的原理是基因重组
D.该技术的优点是定向产生人类需要的生物类型
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由题意可知，该应用技术为基因工程，是在生物体外进行的操作。
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2.科学家把兔子血红蛋白基因导入大肠杆菌细胞中，在大肠杆菌细胞中合成了兔子的血红蛋白。下列关于这一先进技术的理论依据，不正确的是
A.所有生物共用一套遗传密码
B.基因能控制蛋白质的合成
C.兔子血红蛋白基因与大肠杆菌的DNA都是由四种脱氧核苷酸构成，都
遵循相同的碱基互补配对原则
D.兔子与大肠杆菌有共同的原始祖先
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题干表述的是目的基因导入受体细胞并得以表达的过程，目的基因在不同生物细胞中能够表达出相同的蛋白质，说明控制其合成的mRNA上的密码子是共用的，相同的密码子决定相同的氨基酸，A正确；
基因通过转录获得mRNA，进而控制蛋白质的合成，B正确；
基因通常是有遗传效应的DNA片段，只要是双链DNA都遵循碱基互补配对原则，其组成原料都是四种脱氧核苷酸，C正确；
生物之间是否有共同的原始祖先与转基因技术之间没有必然关系，D错误。
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3.据图所示，下列有关工具酶功能的叙述，
不正确的是
A.限制性内切核酸酶可以切断a处
B.DNA聚合酶可以连接a处
C.解旋酶可以使b处解开
D.DNA连接酶可以连接c处
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限制酶可以切断脱氧核苷酸之间的磷酸
二酯键，即a处，A正确；
DNA聚合酶可以连接脱氧核苷酸形成磷
酸二酯键，即a处，B正确；
解旋酶可以使氢键断裂，即b处，C正确；
DNA连接酶可以连接DNA片段形成磷酸
二酯键，即a处，D错误。
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4.限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，下列有关说法正确的是
A.DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键
B.限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸
C.E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远高于T4
DNA连接酶
D.限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，所以也能剪切自身的DNA
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DNA连接酶连接的是两个DNA片段，A错误；
限制酶只能切割DNA分子，烟草花叶病毒的核酸是RNA，限制酶不能切割，B正确；
E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶，C错误；
限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，但是不会剪切自身的DNA，D错误。
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5.(2024·珠海高二期中)重组DNA技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶。下列相关叙述正确的是
A.限制酶主要是从病毒中分离纯化而来的
B.真核细胞中任意一个DNA片段都能被限制酶切割
C.被SmaⅠ酶切割后的DNA可以用T4 DNA连接酶连接
D.限制酶在外源DNA上切开一个切口暴露出一个游离的磷酸基团
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限制酶主要是从原核生物中分离纯化而来的，A错误；
限制酶需要识别特定的核苷酸序列进行切割，并非任意一个DNA片段都能被限制酶切割，B错误；
被SmaⅠ酶切割后的DNA片段为平末端，T4 DNA连接酶既可以连接黏性末端，又可以连接平末端，C正确；
限制酶在外源DNA上切开一个切口暴露出两个游离的磷酸基团，D错误。
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6.甲、乙、丙三种限制酶均识别6个核苷酸序列，下列有关说法错误的是
A.甲、乙、丙黏性末端分别是由不同的限制酶切割产生的
B.甲、乙具有相同的黏性末端，可形成重组DNA分子，但甲、丙之间不能
C.DNA连接酶的作用位点是b处
D.切割产生甲的限制酶不能识别由甲、乙黏性末端形成的重组DNA分子
片段
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DNA连接酶可以恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，而b处是氢键，C错误。
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题组二　“分子运输车”——载体
7.下列关于基因工程中载体的叙述，正确的是
A.载体是基因工程所需的三种工具酶之一
B.载体中必须有抗生素抗性基因
C.必须具有自我复制能力
D.具有一个至多个限制酶切割位点，以便目的基因的插入
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载体是基因工程必需的工具之一，但载体不属于工具酶，A错误；
载体中必须有标记基因，但不一定是抗生素抗性基因，B错误；
载体应具备自我复制的能力，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制，C错误。
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8.(2023·秦皇岛高二期末)下列有关基因工程中载体的说法，正确的是
A.基因工程中使用的载体只有质粒
B.质粒是细胞质中能够自我复制的环状DNA分子
C.噬菌体可以作为动物基因工程的载体
D.天然质粒均可以直接作为载体将目的基因送入受体细胞
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基因工程中常用的载体是质粒，此外还有噬菌体、动植物病毒等，A错误；
噬菌体是专门寄生在细菌等微生物体内的病毒，不可以作为动物基因工程的载体，C错误；
天然质粒往往不能直接作为载体，要根据不同的目的和需求进行人工改造，D错误。
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9.如表列举了几种限制酶的识别序列及其切割位点(箭头表示相关酶的切割位点)。如图是酶切后产生的几种末端。下列有关说法正确的是
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A.BamHⅠ切割的是氢键，AluⅠ切割的是磷酸二酯键
B.Sau3AⅠ和BamHⅠ切割的序列产生的片段能够相连，连接后的片段还
能被Sau3AⅠ切割
C.DNA连接酶能连
接②⑤，不能连
接②④
D.E.coli DNA连接
酶和T4 DNA连
接酶都能连接①③，且二者连接效率相等
√
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BamHⅠ与AluⅠ切割的均是磷酸二酯键，A错误；
BamHⅠ切割 ，Sau3AⅠ切割 ，故二者切割后产生
的黏性末端是相同的，因此二者切割后产生的黏性末端能够相连，连接后的片段能被Sau3AⅠ切割，B正确；
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②⑤的黏性末端相同，②④的黏性末端也相同，因此DNA连接酶能连接②⑤，也能连接②④，C错误；
图中①③属于平末端，E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶，D错误。
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10.在噬菌体和宿主漫长的“军备竞赛”中，为抵御噬菌体的入侵，细菌进化出了多种系统进行防御，其中一类为“限制—修饰”系统，如图所示。下列说法不正确的是
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A.该噬菌体侵染细菌的实验能说明噬菌体的遗传物质是DNA
B.细菌A的DNA序列可能不含限制酶的识别序列而使自身DNA得以保护
C.若极少数噬菌体发生了这种
防御逃逸，噬菌体的DNA可
能被甲基化修饰
D.发生了这种防御逃逸的噬菌
体，对治疗具有多药耐药性
的致病细菌引起的疾病是不
利的
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细菌的限制—修饰作用使侵入的外源DNA被切割，使噬菌体失去繁殖能力，说明了噬菌体的遗
传物质是DNA，A正确；
发生了这种防御逃逸的噬菌
体能侵染细菌，因而可用于
治疗具有多药耐药性的致病
细菌引起的疾病，D错误。
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11.下列有关限制性内切核酸酶的叙述，错误的是
A.用限制酶酶切获得一个外源基因时得到两个切口，有4个磷酸二酯键被
断开
B.限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大
C.—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制酶切出的黏性末端不能用
DNA连接酶连接
D.只有用相同的限制酶处理含目的基因的片段和质粒，才能形成重组质粒
√
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—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制酶切出的黏性末端不同，分别为—CATG和—CTAG，因此不能用DNA连接酶连接，C正确；
用不同的限制酶处理含目的基因的DNA片段和质粒，若产生的黏性末端相同，则也能形成重组质粒，D错误。
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12.如表为常用的限制性内切核酸酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法，错误的是
限制酶名称 识别序列和切割位点 限制酶名称 识别序列和切割位点
BamHⅠ KpnⅠ
EcoRⅠ Sau3AⅠ
HindⅡ SmaⅠ
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注：Y＝C或T，R＝A或G。
A.限制酶SmaⅠ切割后形成的末端可用T4 DNA连接酶连接
B.Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部
C.BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成相同的黏性末端
D.一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列
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一种限制酶只能识别特定的脱氧核苷酸序列，并在特定位点切割DNA分子，并非只能识别一种核苷酸序列，如表格中限制酶HindⅡ识别的核苷酸序列不止一种，D错误。
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限制酶 BamH Ⅰ Bcl Ⅰ
识别序列及切割位点
(1)限制酶______(填“能”或“不能”)切割原核细胞自身的DNA，推测其理由是_______________________________________________________
______。
不能
原核细胞DNA中不存在限制酶的识别序列或能被识别的序列被修饰了
13.BamHⅠ和BclⅠ是两种限制酶，其识别序列及切割位点如表所示。探究下列问题：
1
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限制酶 BamH Ⅰ Bcl Ⅰ
识别序列及切割位点
(2)若某链状DNA分子中含有两个BamHⅠ的识别序列，该DNA分子将被切成_____个片段，共断裂______个磷酸二酯键。
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若某链状DNA分子中含有两个BamHⅠ的识别序列，若用限制酶BamHⅠ识别并切割，则该DNA分子将被切成3个片段，每切割一次会断裂2个磷酸二酯键，共断裂4个磷酸二酯键。
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限制酶 BamH Ⅰ Bcl Ⅰ
识别序列及切割位点
(3)请画出BclⅠ切割后产生的末端。
(4)BamHⅠ和BclⅠ切割后产生的黏性末端_____(填“能”或“不能”)被DNA连接酶连接，理由是______________________________。
答案　
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能
二者切割后产生的黏性末端相同
14.(2021·全国乙，38节选)用重组DNA技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。
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回答下列问题：
(1)常用的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶，题图中_______________酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接，题图中______________________________切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。
EcoRⅠ、PstⅠ
EcoRⅠ、PstⅠ、SmaⅠ和EcoRⅤ
限制酶EcoRⅠ和PstⅠ切割形成的是黏性末端，限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的是平末端，E.coli DNA连接酶来源于大肠杆菌，而T4 DNA连接酶来源于T4噬菌体，这两类酶都能将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键，但E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶。因此图中EcoRⅠ和PstⅠ切割后的DNA片段(黏性末端)可以用E.coli DNA连接酶连接，除了这两种限制酶切割的DNA片段，限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割后的DNA片段(平末端)也可以用T4 DNA连接酶连接。
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(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是____________。
磷酸二酯键
DNA连接酶将两个DNA片段连接，形成磷酸二酯键。
(3)重组DNA技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中_________；质粒DNA分子上有___________________________，便于外源DNA的插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是_____________________________________________
______________________________。
自我复制
一个至多个限制酶的切割位点
用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞
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质粒是小型环状的DNA分子，常作为基因工程中的载体，首先质粒上含有复制原点，能保证质粒在受体细胞中自我复制。质粒DNA分子上有一个至多个限制酶的切割位点，便于外源DNA的插入。质粒上的标记基因是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，具体做法是用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。
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14第1节　重组DNA技术的基本工具
[学习目标]　阐明重组DNA技术所需的三种基本工具及其作用。
一、基因工程的概念和工具酶
1．基因工程：指按照人们的愿望，通过________等技术，赋予生物____________，创造出更符合人们需要的____________________。由于基因工程是在________水平上进行设计和施工的，因此又叫作______________。
2．基因工程的工具酶
(1)限制性内切核酸酶(限制酶)——“分子手术刀”
来源 主要来自________
种类 数千种
作用 识别双链DNA分子的______，并且使每一条链中_____的__________断开
结果 产生__________或平末端
(2)DNA连接酶——“分子缝合针”
①作用：将____________连接起来，恢复被________切开的两个核苷酸之间的____________。
②种类
种类 来源 特点
____ DNA连接酶 E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶
T4 DNA连接酶 T4噬菌体
[特别提醒]　DNA连接酶无识别的特异性，对于相同(或互补)的黏性末端以及平末端都能连接。所以，限制酶种类多，DNA连接酶种类少。
判断正误
(1)基因工程可以实现遗传物质在不同物种间的转移，人们可以定向选育新品种(　　)
(2)限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列(　　)
(3)DNA连接酶能将两碱基通过氢键连接起来(　　)
(4)限制酶和解旋酶的作用部位相同(　　)
任务一：基因工程的理论基础
1．基因工程操作导致的基因重组与有性生殖中的基因重组的主要区别：有性生殖中的基因重组是随机的，并且只能在____________间进行重组；基因工程可以实现遗传物质在__________间进行重组，并且方向性强，可以________改变生物的性状。
2．为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
3．为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
任务二：限制性内切核酸酶(限制酶)
1．请结合限制酶的作用特点，回答以下问题：
(1)限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
(2)请结合图示推断，限制酶切割一次可断开____个磷酸二酯键；产生____个游离的磷酸基团；产生____个黏性末端；消耗______分子水。
2．推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
3．限制酶不切割细菌本身的DNA分子的可能原因是__________________________
________________________________________________________________________
_____________________________________________________________(答出两点)。
4．有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ进行切割，B片段分别用限制酶Hind Ⅲ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如图。
(1)请写出限制酶SpeⅠ、HindⅢ、XbaⅠ和XhoⅠ切割形成的黏性末端。
(2)不同限制酶切割______(填“可能”或“不可能”)产生相同的黏性末端。
(3)限制酶________切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeⅠ切割A片段产生的DNA片段相连接，因为________________________________________________；连接完成后，该重组DNA分子的新连接处______(填“能”或“不能”)再被所用的限制酶切割，因为________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
　与DNA相关的几种酶的比较
项目 DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶
作用部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 氢键
作用对象 DNA片段 DNA 单个的脱氧核苷酸 DNA
作用结果 将两个DNA片段连接成完整的DNA分子 切割DNA分子 将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端 将双链DNA分子局部解旋为单链
拓展延伸
1．回文序列
限制酶特异性识别和切割的部位具有回文序列，即在切割部位，一条链正向读的碱基顺序，与另一条链反向读的顺序完全一致。例如：EcoRⅠ限制酶识别的DNA序列为，为回文序列。
2．同尾酶
识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA 片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶(目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列)来获取目的基因。
1．如图是几种不同限制酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列叙述正确的是(　　)
A．以上DNA片段是由4种限制酶切割后产生的
B．②片段是在识别序列为的限制酶作用下形成的
C．①和④两个片段在DNA聚合酶的作用下可形成重组DNA分子
D．限制酶和DNA连接酶作用的部位都是磷酸二酯键
2．DNA连接酶是基因工程的必需工具。下列有关DNA连接酶的叙述，错误的是(　　)
A．DNA连接酶可以将任意的两个DNA片段连接成一个重组DNA分子
B．DNA连接酶发挥作用时不需要识别特定的脱氧核苷酸序列
C．DNA连接酶可以催化两个脱氧核苷酸之间磷酸二酯键的形成
D．有些DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端
二、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
1．种类：质粒、________、动植物病毒等。
2．常用载体——质粒
(1)本质：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有__________能力的环状双链DNA分子。
(2)质粒作为载体所具备的条件及原因
条件 原因
具有_______________________，供外源DNA片段插入其中 载体要与外源DNA片段连接
能使携带的外源DNA片段在受体细胞中稳定存在
具有特殊的____________ 便于重组DNA分子的______
无毒害作用 对受体细胞无毒害作用，避免受体细胞受到损伤
(3)作用
①作为运输工具，将外源基因导入______。
②质粒携带______________在细胞内大量复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
判断正误
(1)作为载体的质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因(　　)
(2)质粒是环状双链DNA分子，是基因工程常用的载体(　　)
(3)载体(如质粒)和细胞膜上的载体蛋白的成分相同(　　)
(4)DNA重组技术所需要的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体(　　)
任务三：载体需具备的条件和载体的选择
1．根据标记基因的作用，有同学认为在含有某种抗生素的培养基中筛选存活的受体细胞________(填“一定”或“不一定”)是导入目的基因的受体细胞，理由是_________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
2．若用家蚕细胞作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用________作为载体，原因是________________________________________________
________________________________________________________________________。
1．标记基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示：
2．如何提高筛选的准确性
当质粒上有两个标记基因时，可将目的基因插入其中一个标记基因中，也就是重组质粒上只含有一个标记基因，普通质粒上含有两个标记基因。则没有导入质粒的受体细胞不具有标记基因控制的性状，导入普通质粒的受体细胞具有两个标记基因控制的性状，导入重组质粒的受体细胞只具有一个标记基因控制的性状。这样可根据标记基因控制的性状准确筛选出含有重组质粒的受体细胞。
3．(2023·广州高二联考)质粒是基因工程中最常用的目的基因运载工具。下列有关叙述正确的是(　　)
A．质粒是只存在于细菌细胞质中能自我复制的小型环状双链DNA分子
B．在所有的质粒上总能找到一个或多个限制酶切割位点
C．携带目的基因的重组质粒只有整合到受体细胞的染色体DNA上才会随后者的复制而复制
D．质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA的筛选
4．某细菌质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)示意图。请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是(　　)
插入点 细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况 细菌在含四环素的培养基上的生长状况
① 能生长 能生长
② 能生长 不能生长
③ 不能生长 能生长
A.①是c；②是b；③是a
B．①是a和b；②是a；③是b
C．①是a和b；②是b；③是a
D．①是c；②是a；③是b
答案精析
一、
梳理教材新知
1．转基因　新的遗传特性　新的生物类型和生物产品　DNA分子　重组DNA技术
2．(1)原核生物　特定核苷酸序列　特定部位　磷酸二酯键　黏性末端　(2)①两个DNA片段　限制酶　磷酸二酯键　②E.coli　大肠杆菌
判断正误
(1)√　(2)×　(3)×　(4)×
提示　(2)大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。(3)DNA连接酶能将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。(4)限制酶和解旋酶的作用部位不同，限制酶作用于磷酸二酯键，解旋酶作用于氢键。
探究核心知识
任务一
1．同一物种　不同物种　定向地
2．(1)DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。(2)双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。
3．(1)基因是控制生物性状的独立遗传单位。(2)遗传信息的传递都遵循中心法则。(3)生物界共用一套遗传密码。
任务二
1．(1)不能。
(2)2　2　2　2
2．限制酶是原核生物的一种防御工具，用来切割侵入细胞的外源DNA，以保证自身安全。
3．含某种限制酶的细菌的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开
4．(1)SpeⅠ：　HindⅢ：
XbaⅠ：　XhoⅠ：
(2)可能　(3)XbaⅠ　XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端　不能　所用的两种限制酶均不能识别该重组DNA分子的新连接处的脱氧核苷酸序列
落实思维方法
1．D　[图中①④是同一种限制酶切割形成的，因此以上DNA片段是由3种限制酶切割后产生的，A错误；②片段是在识别序列为的限制酶作用下形成的，B错误；①④连接形成重组DNA分子需要的是DNA连接酶，C错误。]
2．A　[DNA连接酶可以连接平末端或互补配对的黏性末端，而非任意的两个DNA片段，A错误。]
二、
梳理教材新知
1．噬菌体
2．(1)自我复制　(2)一个至多个限制酶切割位点　能在受体细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制　标记基因　筛选　(3)①细胞　②外源DNA片段
判断正误
(1)×　(2)√　(3)×　(4)×
提示　(1)作为载体的质粒通常采用抗生素抗性基因作为筛选标记基因。(3)载体(如质粒)的成分是DNA，细胞膜上的载体的主要成分是蛋白质。(4)DNA重组技术所需要的工具酶有限制酶、DNA连接酶，载体不属于工具酶。
探究核心知识
任务三
1．不一定　仅导入空载体的和导入含目的基因载体的受体细胞均能在该培养基中存活
2．噬菌体　噬菌体的宿主细胞是细菌等微生物，而不是家蚕
落实思维方法
3．D　[质粒不只分布于原核生物中，在真核生物如酵母菌细胞内也有分布，A错误；并不是所有的质粒上都能找到限制酶的切割位点而成为适合运载目的基因的工具，B错误；重组质粒进入受体细胞后，可以在细胞内自我复制，或整合到受体细胞染色体DNA上后复制，C错误。]
4．A

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