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(共85张PPT)
第1课时
目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建
第3章 基因工程
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学习目标
1.简述PCR的原理、条件及过程。
2.简述基因表达载体的组成及构建过程。
内容索引
一、目的基因的筛选与获取
二、基因表达载体的构建
课时对点练
目的基因的筛选与获取
一
1.培育转基因抗虫棉的四个步骤
(1)目的基因的 。
(2) 的构建。
(3)将目的基因导入 。
(4)目的基因的 。
筛选与获取
梳理　教材新知
基因表达载体
受体细胞
检测与鉴定
2.目的基因
(1)概念：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期 等的基因就是目的基因。
(2)作用：根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指__________
的基因。
(3)类型：与 、 、 和工业用酶等相关的基因，如培育转基因抗虫棉用到的 ，即Bt基因。
表达产物
编码蛋白质
生物抗逆性
生产药物
毒物降解
Bt抗虫蛋白基因
3.筛选合适的目的基因：从 的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
4.获取目的基因的方法
(1)人工合成目的基因。
(2)常用 特异性地快速扩增目的基因。
(3)通过构建基因文库来获取目的基因。
相关的已知结构和功能清晰
PCR
5.利用PCR获取和扩增目的基因
(1)含义：PCR是 的缩写。它是一项在体外提供参与DNA复制的 与 ，对目的基因的 进行大量复制的技术。
(2)原理： 。
(3)基本条件
①场所：在一定的 液中进行，其中一般要添加Mg2＋。
②模板：DNA母链。
③原料：4种 。
④酶： 的DNA聚合酶。
⑤引物：使DNA聚合酶能够从引物的 端开始连接脱氧核苷酸。
聚合酶链式反应
各种组分
反应条件
核苷酸序列
DNA半保留复制
缓冲
脱氧核苷酸
耐高温
3′
(4)过程
①变性：当温度超过 ℃时，双链DNA 为单链。
②复性：当温度下降到 ℃左右时， 通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
③延伸：当温度上升到 ℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在_______
的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
(5)上一轮循环的产物可以作为下一个循环的 ，因而每一次循环后目的基因的量可以 ，即成 形式扩增(约为2n，其中n为扩增循环的次数)。
(6)鉴定：常采用 来鉴定PCR的产物。
90
解聚
50
两种引物
72
耐高温
的DNA聚合酶
模板
增加一倍
指数
琼脂糖凝胶电泳
(1)PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应(　　)
提示　PCR反应中温度的周期性改变是为了变性、复性、延伸，DNA聚合酶催化子链的延伸。
(2)PCR扩增技术中，需用解旋酶使双链DNA解聚(　　)
提示　PCR扩增技术中，高温使双链DNA解聚。
(3)PCR过程使用的DNA聚合酶的特点是耐高温(　　)
(4)PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就越高(　　)
×
×
√
√
任务一：PCR扩增技术
图1、图2分别是PCR扩增技术相关过程，请思考回答下列问题：
探究　核心知识
1.PCR扩增的 (填“是”或“不是”)完整的模板DNA分子，理由是
。
不是
PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段
2.图1所示利用PCR技术扩增目的基因，在第 轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段，这种DNA所占的比例是 。
3.如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是______
__________________________
。
3
1/4
根据目
的基因两端的核苷酸序列设计
引物
4.图2是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理，第1组不合理的原因是 。第2组不合理的原因是______________________________________________
。
引物Ⅰ和引物Ⅱ会因局部发生碱基互补配对而失效
引物Ⅰ′自身折叠后会因出现局部碱基互补配对而
失效
5.要保证目的基因能与载体相连接，要在两种引物的 分别添加上
。
6.如果循环n次，则共需消耗 对引物。
5′端
限制酶的识别序列
2n－1
PCR中的数量关系
核心归纳
(1)引物与DNA分子中间部位结合时
复制次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含引物的DNA分子数 2 4 8 2n
含其中一种引物的DNA分子数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1
同时含两种引物的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2
共消耗引物的对数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1
含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数 0＝21－2 0＝22－4 2＝23－6 2n－2n
PCR中的数量关系
核心归纳
(2)引物与DNA分子端部结合时
①若一条引物从DNA分子端部结合，另一条引物从DNA分子中间部位结合，则第二轮PCR循环结束时出现两条单链等长的目的片段(如图)。②若两条引物均从 DNA分子端部结合，则第一轮PCR循环结束时出现两条单链等长的目的片段。
目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子，A错误。
1.(2023·太原高二诊断)下列有关获取目的基因的叙述，错误的是
A.目的基因就是编码蛋白质的基因
B.获取目的基因是基因工程的第一步
C.来自苏云金杆菌的Bt抗虫蛋白基因可作为转基因抗虫棉的目的基因
D.序列比对工具的应用为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会
√
落实　思维方法
2.如图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。下列有关叙述错误的是
A.耐高温的DNA聚合酶总将游
离的脱氧核苷酸连接到3′端
B.在第三轮循环产物中开始出
现两条脱氧核苷酸链等长的
DNA片段
C.引物之间或引物自身发生碱
基互补配对，则不能有效扩增目的基因
D.从理论上推测，第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占3/4
√
由题图可知，以原来的每条母链为模板经第一轮合成的两个DNA分子中，只含有引物A或引物B，而以新合成的子链为模板合成新DNA分子时，两种引物都含有，故第三轮循环共产生
8个DNA分子，其中含有引物A的DNA分子是7个，即占7/8，D错误。
二
基因表达载体的构建
1.基因表达载体构建的目的
让目的基因在受体细胞中 ，并且遗传给下一代，同时使目的基因能够 和 。
2.基因表达载体的组成
梳理　教材新知
上游
稳定存在
表达
发挥作用
启动子
RNA聚合酶
终止子
下游
转录
标记
特别提醒
目的基因插入位点不是随意的。目的基因的表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子和终止子之间的部位，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原有的功能。
3.基因表达载体的构建过程
(1)首先用一定的 切割载体。
(2)然后用 限制酶或能产生
相同末端的限制酶切割含有目的
基因的DNA片段。
(3)再利用 将含目的
基因的DNA片段拼接到载体的
切口处(如图所示)。
限制酶
同种
DNA连接酶
(1)基因工程操作程序的核心步骤是目的基因的获取(　　)
提示　基因工程操作程序的核心步骤是基因表达载体的构建。
(2)基因表达载体中有的含有启动子和终止密码子(　　)
提示　基因表达载体中有的含有启动子和终止子，终止密码子位于mRNA上。
(3)标记基因不一定是抗生素抗性基因(　　)
×
×
√
任务二：分析基因表达载体构建的目的和方法
1.获取Bt基因后不能直接将它导入受体细胞，是因为游离的DNA进入受体细胞，一般会 ，即使可以转录翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着 而进行复制，导致子代细胞中_____________
。因此，获取Bt基因后，还需要 ，才能使棉花植株获得抗虫特性。
2.构建基因表达载体时目的基因插入的位置应该在___________________
，因为 。
探究　核心知识
直接被分解
细胞分裂
不再含有目的
基因
借助载体将其导入棉花细胞
启动子下游和终止子
上游
只有插入在启动子和终止子之间，目的基因才可以正常表达
3.请结合图示，回答下列问题：
(1)构建基因表达载体时， (填“能”或“不能”)用SmaⅠ酶切割质粒，因为_______________________________________________________
。
不能
SmaⅠ会破坏质粒的抗生素抗性基因(标记基因)，不利于重组
DNA分子的筛选
(2)与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和Hind Ⅲ 两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是________________________________________
。
可以防止载体和目的基因的自身环化以及目的
基因与载体的反向连接
核心归纳
1.区分启动子和终止子与起始密码子和终止密码子
启动子和终止子位于DNA上，是基因表达载体必需的部分，而起始密码子和终止密码子位于mRNA上，决定翻译的开始和结束。
2.图解限制酶的选择原则
核心归纳
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。若载体上有两个及以上的标记基因，则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏，从而达到比1个标记基因更高的筛选成功率，防止只有1个标记基因时出现的“假阳性”(即未成功导入目的基因的载体也
能正常表达标记基因，
造成无效筛选)。
核心归纳
(3)善用“双酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时，一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶，对目的基因所在序列和载体进行剪切，即“双酶切法”。其优点和作用是：①防止目的基因环化；②避免目的基因与载体反向连接，即DNA连接酶连接后形成的重组DNA分子上，目的基因和载体启动子的方向(或描述为“RNA聚合酶的移动方向”)必须是相同的。否则目的基因导入后无法正常转录、
表达。如图甲、乙也可选择PstⅠ
和EcoRⅠ两种限制酶。
核心归纳
(4)巧用“同尾酶”：同尾酶指来源不同，但能产生相同黏性末端的限制酶。当不适合选择某种限制酶时，可用其同尾酶替换，以获得相同的黏性末端。
拓展延伸
1.启动子的类型
根据启动子的转录模式，可分为：①组成型启动子，能够调控基因的表达，使其基本恒定在一定程度上，从而使基因在不同部位或组织中的表达水平不存在明显差异。这类启动子一般来自管家基因，可连续不断地启动基因的表达。②组织特异性启动子，其调控作用使得基因往往只在某些特定器官或组织中表达，且表现出发育调节的特性。其最大的优势是其启动的外源基因在受体中仅在需要的部位特异表达，克服了组成型启动子启动的外源基因在受体植物中非特异、持续、高效表达所造成的浪费，增加了转基因的效果。③诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。
拓展延伸
2.真、原核细胞基因的结构和表达
(1)基因的结构
拓展延伸
(2)基因表达遗传信息
①原核生物基因
拓展延伸
②真核生物基因
3.(2023·新课标，6改编)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的
识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以
构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是
落实　思维方法
A.质粒和目的基因都用酶3切割，常用E.coli DNA连接酶连接
B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA
连接酶连接
D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA
连接酶连接
√
酶3切割后得到的是平末端，常用T4 DNA连接酶连接，A不符合题意；
质粒用酶3切割后得到的是平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B不符合题意；
质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C符合题意；
若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D不符合题意。
4.(2023·湖北，4改编)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是
A.若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C.若用ScaⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含
Tet(四环素)的培养基中能形成菌落
D.若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含
Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
√
若用Hind Ⅲ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确；
若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；
SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因(TetR)中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，
因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨
苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在含
Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。
网络构建
课时对点练
三
题组一　目的基因的筛选与获取
1.下列关于PCR技术的叙述，正确的是
A.PCR技术建立在对扩增的目的基因序列完全已知的基础上
B.该技术需要解旋酶和耐高温的DNA聚合酶
C.该技术需要一对特异性的引物，要求一对引物的序列是互补的
D.该技术应用DNA半保留复制原理，也需要模板、原料、能量、酶等条件
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PCR技术扩增的目的基因序列不一定完全是已知的，A错误；
该技术是通过高温来使DNA解旋的，不需要解旋酶，B错误；
该技术需要的一对引物，分别能与模板DNA的两条链进行碱基互补配对，其序列不是互补的，C错误。
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2.用PCR扩增下面的DNA片段：
5′GACCTGTGGAAGC……CATACGGGATTG3′
3′CTGGACACCTTCG……GTATGCCCTAAC5′
供选择的引物有：
①5′GACCTGTGGAAGC3′ ②5′CATACGGGATTG3′
③5′GTATGCCCTAAC3′ ④5′CAATCCCGTATG3′
共四种，应选择
A.①② B.②③ C.③④ D.①④
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用PCR扩增DNA片段的过程中，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3′端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5′端至3′端延伸的，故引物的碱基序列应与每条模板链5′端的一段核苷酸链的碱基序列相同，即应以模板链5′端的一段脱氧核苷酸单链片段作为引物；由题干信息分析可知，5′端的碱基序列是5′GACCTGTGGAAGC和
5′CAATCCCGTATG，故对应的引物为①④，D正确。
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3.(2023·邢台高二月考)用PCR技术特异性地拷贝
“X基因”，经四轮循环后产物中有五种不同的
DNA分子。下列有关叙述错误的是
A.第一轮循环得到2个DNA分子，
即①②各一个
B.第二轮循环得到4个DNA分子，
即①②③④各一个
C.第三轮循环得到8个DNA分子，其中有2个是等长的，也就是有2个⑤
D.第四轮循环得到16个DNA分子，其中有4个⑤
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第四轮循环得到的16个DNA分子中，两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段有24－2×4＝8(个)，即有8个⑤，D错误。
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4.(2024·福州高二调研)PCR引物的3′端为结合模板DNA的关键碱基，5′端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列。下列叙述正确的是
A.该图表示PCR循环中的变性环节
B.PCR第四次循环要消耗15对引物
C.耐高温的DNA聚合酶催化相邻的两个游离的脱氧核苷酸之间形成磷酸
二酯键
D.用图中引物扩增两个循环后即可获得添加限制酶切点的目的产物
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该图表示PCR循环中的复性环节，A错误；
PCR第四次循环要消耗8对引物，B错误；
耐高温的DNA聚合酶只能将游离的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上，C错误。
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5.RT－PCR是以提取的RNA为模板，经逆转录获得与之互补的DNA(cDNA)序列，再以cDNA序列为模板进行目的片段的扩增，具体过程如图所示。下列有关RT－PCR的叙述，正确的是
A.过程1需要使用耐高温的DNA聚合酶
B.过程2中的引物B可与mRNA互补配对
C.游离的脱氧核苷酸只能加到引物的
5′端
D.RT－PCR可用于对RNA病毒的检测与鉴定
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过程1是由mRNA形成单链DNA的过程，为逆转录，该过程需要逆转录酶，A错误；
过程2中的引物B可与cDNA互补配
对，而mRNA与cDNA碱基互补配
对，则引物B和mRNA除碱基T和
U的区别外，其余序列相同，不能互补配对，B错误；
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游离的脱氧核苷酸只能加到引物的3′端，C错误；
利用RT－PCR技术对某些微量
RNA病毒进行检测，并可提高
检测的灵敏度(因为增加了待测
RNA逆转录产生的DNA的数量，
因此便于检测)，D正确。
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题组二　基因表达载体的构建
6.下列关于基因表达载体的说法，不正确的是
A.基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤
B.基因表达载体包含启动子、目的基因、终止子、标记基因等
C.终止子位于目的基因的下游，能够终止翻译过程
D.不同的目的基因所需的启动子不一定相同
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基因表达载体包括启动子、终止子、目的基因、标记基因等，其中启动子位于目的基因的上游，是启动转录的一段DNA片段，终止子位于目的基因的下游，能够终止转录过程，B正确，C错误；
不同的目的基因具有不同的核苷酸序列，其启动子也不尽相同，D正确。
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7.(2023·保定高二阶段考)科学家利用质粒(如图)成功构建了蛛丝蛋白基因的重组质粒，并在家蚕丝腺细胞中获得大量蛛丝蛋白。下列有关说法错误的是
A.为防止目的基因自身环化，可以用限制酶XbaⅠ和SacⅠ来切割目的基因
B.构建基因表达载体时选用蚕丝蛋白
基因的启动子利于基因在家蚕丝腺
细胞中表达
C.启动子是DNA聚合酶的识别和结合
部位，可以驱动遗传信息的转录
D.基因表达载体中的标记基因可以用
来鉴别与选择含有蛛丝蛋白基因的受体细胞
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启动子是RNA聚合酶的识别和结合部位，C错误。
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8.(2023·南通高二期中)如图表示pBR322质粒和人生长激素基因所在片段的结构信息，将二者构建的重组质粒导入受体菌并进行筛选。下列有关叙述正确的是
注：AmpR为氨苄青霉素抗性基
因，TetR为四环素抗性基因。
A.可选择的限制酶组合是酶E和
酶G
B.所选用的受体菌不能含有AmpR
和TetR基因
C.用含氨苄青霉素的培养基就能筛选出含重组质粒的受体菌
D.同时用三种限制酶处理图中质粒，电泳后可得到3个条带
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酶E会破坏质粒上的两种标记基因，为避免切割后DNA片段的自身环化，又保留质粒上的标记基因，切割时应选择的限制酶组合是酶F和酶G，A错误；
重组质粒上的TetR基因被
破坏，而重组质粒上的
AmpR基因能表达，用含
氨苄青霉素的培养基筛
选出的有导入重组质粒的受体菌和导入普通质粒的受体菌，C错误；
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据题图可知，因酶E有两个作用位点，同时用三种限制酶处理图中质粒，能将质粒切割成4个DNA片段，电泳后可得到4个条带，D错误。
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9.当目的基因和质粒都用Hind Ⅲ处理、连接后，目的基因可能正向插入载体，也可能反向插入载体，为判断目的基因的插入方向，可使用限制酶处理，并进行电泳检测(如图)。下列选项中能判断目的基因插入方向的限制酶是
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注：EcoRⅠ、BamHⅠ和Hind Ⅲ的识别序列、切割位点均不同，数字表示相邻两个限制酶切点之间的碱基对数(bp)，质粒全长20 000 bp。
A.Hind Ⅲ B.EcoRⅠ
C.BamHⅠ D.EcoRⅠ和HindⅢ
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由题图分析可知，图中质粒用限制酶EcoRⅠ处理，并进行电泳后，正向插入的质粒切割后会出现的DNA片段为：1 000＋2 000＋5 000＝8 000 (bp)和5 000＋4 000＋3 000＝12 000 (bp)，而反向插入的质粒切割后会出现的DNA片段为：1 000＋
2 000＋4 000＝7 000 (bp)和5 000＋3 000＋5 000＝13 000 (bp)，因此正向插入和反向插入用限制酶EcoRⅠ
处理电泳后得到的DNA
片段大小不同，可以判
断目的基因的插入方向，
B正确。
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10.研究人员用如图1中质粒和图2中含目的基因的片段构建重组质粒(图中标注了相关限制酶切割位点)，将重组质粒导入大肠杆菌后进行筛选及PCR鉴定。下列叙述不正确的是
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A.构建重组质粒的过程应选用BclⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶
B.使用DNA连接酶将酶切后的质粒和目的基因片段进行重组
C.能在添加四环素的培养基上生存的一定是含有重组质粒的大肠杆菌
D.利用PCR鉴定含目的基因的大肠杆菌时应选用引物甲和引物丙
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选择的限制酶应在目的基因两端存在识别位点，但BamHⅠ可能使质粒中的两种标记基因都被破坏，因此只能选BclⅠ和HindⅢ两种限制酶切割，A正确；
酶切后的质
粒和目的基
因片段要用
DNA连接酶
连接，构建重组载体，B正确；
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能在添加四环素的培养基上生存的也可能是只含有质粒的大肠杆菌，C错误；
PCR技术要
求两种引物
分别和目的
基因的两条
单链结合，沿相反的方向合成子链，故所用的引物组成为图2中引物甲和引物丙，D正确。
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11.(2023·焦作高二期末)下列有关PCR的叙述，正确的是
A.PCR的原理是DNA半保留复制，解旋和复制是同时进行的
B.PCR的过程主要包括变性→延伸→复性，温度逐渐降低
C.PCR技术扩增时，一个DNA分子经过n轮复制共需引物2n对
D.常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物
√
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PCR的原理是DNA半保留复制，PCR技术是在较高温度条件下打开双链后进行扩增的，是先解旋后复制，A错误；
PCR的过程主要包括高温变性→低温复性→中温延伸，可见该过程中温度不是逐渐降低，B错误；
PCR技术扩增时，一个DNA分子经过n轮复制共需引物2n－1对，C错误。
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12.聚合酶链式反应(PCR)是一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术。下列关于PCR引物的叙述，错误的是
A.为保证模板链与引物结合的效率，两种引物之间尽量避免存在互补序列
B.为了便于将扩增的DNA片段与载体连接，可在引物的3′端加上限制
酶识别序列
C.在两种引物上设计加入不同的限制酶识别序列，主要目的是使目的基
因定向插入载体并可避免目的基因自身环化
D.复性所需的温度、时长和延伸所需的温度、时长均与引物有关
√
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引物自身不应存在互补序列，否则会出现引物与自身配对、引物跟引物配对的情况，降低PCR的效率，A正确；
引物引导子链合成的方向是5′端→3′端，因此为了便于扩增的DNA片段与载体连接，需要在引物的5′端加上限制酶识别序列，B错误；
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为了便于扩增的DNA片段与载体连接，常在两条引物上设计加入不同的限制酶识别序列，主要目的是使目的基因能定向插入表达载体，避免目的基因自身环化，C正确；
复性所需的温度、时长和延伸所需的温度、时长均与引物有关，如引物中G与C含量高，需要设定更高的复性和延伸温度，D正确。
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13.科研人员想利用发绿色荧光的大肠杆菌来快捷检测出水中的毒物，将毒物诱导型启动子S插入图示质粒的P区，构建基因表达载体前需要利用PCR技术扩增启动子S。据图分析，下列叙述不正确的是
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A.扩增启动子S时，所用引物Ⅰ上最好有限制酶XhoⅠ的识别序列
B.若该重组质粒能在大肠杆菌中稳定遗传，则图示质粒还应有复制原点
C.为了便于筛选，所选用大肠杆菌原本不能具有抗氨苄青霉素的特性
D.启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，两者的结合不受外因影响
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启动子S是毒物诱导型启动子，说明RNA聚合酶与启动子的结合受外界因素的影响，D错误。
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14.基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题：
(1)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是_______________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的______。
(2)目前在PCR反应中不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是_________
__________________________。
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解旋酶
加热至90 ℃以上
氢键
DNA聚合酶在高温下会失活
大肠杆菌
(3)含有限制酶的细胞中通常还具有相应的甲基化酶，这两种酶对DNA分子有相同的作用序列，但具有不同的催化功能。甲基化酶可以对DNA序列进行修饰，使限制酶不能对这一序列进行识别和切割。含有某种限制酶的细胞，可以利用限制酶切割外源DNA，但不破坏细胞自身的DNA，其原因可能有：①_______________________________________________；②________________________________________。
(4)利用PCR扩增目的基因的过程由高温变性(90 ℃以上)、低温复性(50 ℃左右)、适温延伸(72 ℃左右)三个步骤构成一个循环，为使得DNA聚合酶能够重复利用，选用的酶应在_______________处理后仍然具备催化活性。
90 ℃以上高温
细胞自身的DNA分子没有该限制酶的识别序列
甲基化酶对细胞自身的DNA分子进行了修饰
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15.某质粒上有SalⅠ、HindⅢ、BamHⅠ三种限制酶切割位点，同时还含有四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程如图1所示，请回答下列问题：
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(1)将抗盐基因导入烟草细胞内，使烟草植株产生抗盐性状，这种新性状(变异性状)的来源属于_________。
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基因重组
(2)如果将抗盐基因直接导入烟草细胞，一般情况下，烟草不会具有抗盐特性，原因是抗盐基因在烟草细胞中不能_____，也不能______________
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复制
盐基因的mRNA)
表达(或合成抗
(3)在构建重组质粒时，应选用________________两种酶对质粒和含抗盐基因的DNA进行切割，以保证重组DNA序列的唯一性。
SalⅠ和HindⅢ
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(4)如图2表示运用影印培养法(使一系列培养皿的相同位置上能出现相同菌落的一种接种培养方法)检测基因表达载体是否导入了农杆菌。
培养基除了含有细菌生长繁殖必需的成分外，培养基A和培养基B分别还含有____________、_____________________________。从检测筛选的结果分析，含有目的基因的是______(填图2中的数字)菌落中的细菌。
氨苄青霉素
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四环素(或氨苄青霉素和四环素)
4和6第2节　基因工程的基本操作程序
第1课时　目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建
[学习目标]　1.简述PCR的原理、条件及过程。2.简述基因表达载体的组成及构建过程。
一、目的基因的筛选与获取
1．培育转基因抗虫棉的四个步骤
(1)目的基因的____________。
(2)______________的构建。
(3)将目的基因导入__________。
(4)目的基因的____________。
2．目的基因
(1)概念：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期__________等的基因就是目的基因。
(2)作用：根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指____________的基因。
(3)类型：与______________、__________、__________和工业用酶等相关的基因，如培育转基因抗虫棉用到的______________________，即Bt基因。
3．筛选合适的目的基因：从__________________________的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
4．获取目的基因的方法
(1)人工合成目的基因。
(2)常用______特异性地快速扩增目的基因。
(3)通过构建基因文库来获取目的基因。
5．利用PCR获取和扩增目的基因
(1)含义：PCR是________________的缩写。它是一项在体外提供参与DNA复制的__________与____________，对目的基因的____________进行大量复制的技术。
(2)原理：________________。
(3)基本条件
①场所：在一定的______液中进行，其中一般要添加Mg2＋。
②模板：DNA母链。
③原料：4种____________。
④酶：________的DNA聚合酶。
⑤引物：使DNA聚合酶能够从引物的____端开始连接脱氧核苷酸。
(4)过程
①变性：当温度超过____ ℃时，双链DNA______为单链。
②复性：当温度下降到________℃左右时，__________通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
③延伸：当温度上升到____℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在____________________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
(5)上一轮循环的产物可以作为下一个循环的______，因而每一次循环后目的基因的量可以__________，即成______形式扩增(约为2n，其中n为扩增循环的次数)。
(6)鉴定：常采用______________________来鉴定PCR的产物。
判断正误
(1)PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应(　　)
(2)PCR扩增技术中，需用解旋酶使双链DNA解聚(　　)
(3)PCR过程使用的DNA聚合酶的特点是耐高温(　　)
(4)PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就越高(　　)
任务一：PCR扩增技术
图1、图2分别是PCR扩增技术相关过程，请思考回答下列问题：
1．PCR扩增的______(填“是”或“不是”)完整的模板DNA分子，理由是_______________。
2．图1所示利用PCR技术扩增目的基因，在第____轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段，这种DNA所占的比例是______。
3．如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是__________________________________。
4．图2是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理，第1组不合理的原因是___________________________。第2组不合理的原因是______________________。
5．要保证目的基因能与载体相连接，要在两种引物的______分别添加上_____________。
6．如果循环n次，则共需消耗______________对引物。
　PCR中的数量关系
(1)引物与DNA分子中间部位结合时
复制次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含引物的DNA分子数 2 4 8 2n
含其中一种引物的DNA分子数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1
同时含两种引物的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2
共消耗引物的对数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1
含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数 0＝21－2 0＝22－4 2＝23－6 2n－2n
(2)引物与DNA分子端部结合时
①若一条引物从DNA分子端部结合，另一条引物从DNA分子中间部位结合，则第二轮PCR循环结束时出现两条单链等长的目的片段(如图)。②若两条引物均从 DNA分子端部结合，则第一轮PCR循环结束时出现两条单链等长的目的片段。
1．(2023·太原高二诊断)下列有关获取目的基因的叙述，错误的是(　　)
A．目的基因就是编码蛋白质的基因
B．获取目的基因是基因工程的第一步
C．来自苏云金杆菌的Bt抗虫蛋白基因可作为转基因抗虫棉的目的基因
D．序列比对工具的应用为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会
2．如图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。下列有关叙述错误的是(　　)
A．耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到3′端
B．在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段
C．引物之间或引物自身发生碱基互补配对，则不能有效扩增目的基因
D．从理论上推测，第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占3/4
二、基因表达载体的构建
1．基因表达载体构建的目的
让目的基因在受体细胞中__________，并且遗传给下一代，同时使目的基因能够______和__________。
2．基因表达载体的组成
[特别提醒]　目的基因插入位点不是随意的。目的基因的表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子和终止子之间的部位，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原有的功能。
3．基因表达载体的构建过程
(1)首先用一定的________切割载体。
(2)然后用______限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。
(3)再利用__________将含目的基因的DNA片段拼接到载体的切口处(如图所示)。
判断正误
(1)基因工程操作程序的核心步骤是目的基因的获取(　　)
(2)基因表达载体中有的含有启动子和终止密码子(　　)
(3)标记基因不一定是抗生素抗性基因(　　)
任务二：分析基因表达载体构建的目的和方法
1．获取Bt基因后不能直接将它导入受体细胞，是因为游离的DNA进入受体细胞，一般会________，即使可以转录翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着__________而进行复制，导致子代细胞中__________________。因此，获取Bt基因后，还需要__________________，才能使棉花植株获得抗虫特性。
2．构建基因表达载体时目的基因插入的位置应该在______________________________，因为________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
3．请结合图示，回答下列问题：
(1)构建基因表达载体时，______(填“能”或“不能”)用SmaⅠ酶切割质粒，因为________
______________________________________________________________________________。
(2)与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
1．区分启动子和终止子与起始密码子和终止密码子
启动子和终止子位于DNA上，是基因表达载体必需的部分，而起始密码子和终止密码子位于mRNA上，决定翻译的开始和结束。
2．图解限制酶的选择原则
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。若载体上有两个及以上的标记基因，则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏，从而达到比1个标记基因更高的筛选成功率，防止只有1个标记基因时出现的“假阳性”(即未成功导入目的基因的载体也能正常表达标记基因，造成无效筛选)。
(3)善用“双酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时，一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶，对目的基因所在序列和载体进行剪切，即“双酶切法”。其优点和作用是：①防止目的基因环化；②避免目的基因与载体反向连接，即DNA连接酶连接后形成的重组DNA分子上，目的基因和载体启动子的方向(或描述为“RNA聚合酶的移动方向”)必须是相同的。否则目的基因导入后无法正常转录、表达。如图甲、乙也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
(4)巧用“同尾酶”：同尾酶指来源不同，但能产生相同黏性末端的限制酶。当不适合选择某种限制酶时，可用其同尾酶替换，以获得相同的黏性末端。
拓展延伸
1．启动子的类型
根据启动子的转录模式，可分为：①组成型启动子，能够调控基因的表达，使其基本恒定在一定程度上，从而使基因在不同部位或组织中的表达水平不存在明显差异。这类启动子一般来自管家基因，可连续不断地启动基因的表达。②组织特异性启动子，其调控作用使得基因往往只在某些特定器官或组织中表达，且表现出发育调节的特性。其最大的优势是其启动的外源基因在受体中仅在需要的部位特异表达，克服了组成型启动子启动的外源基因在受体植物中非特异、持续、高效表达所造成的浪费，增加了转基因的效果。③诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。
2．真、原核细胞基因的结构和表达
(1)基因的结构
(2)基因表达遗传信息
①原核生物基因
②真核生物基因
3．(2023·新课标，6改编)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(　　)
A．质粒和目的基因都用酶3切割，常用E.coli DNA连接酶连接
B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接
4．(2023·湖北，4改编)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　)
A．若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用ScaⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Tet(四环素)的培养基中能形成菌落
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
答案精析
一、
梳理教材新知
1．(1)筛选与获取　(2)基因表达载体　(3)受体细胞　(4)检测与鉴定
2．(1)表达产物　(2)编码蛋白质　(3)生物抗逆性　生产药物　毒物降解　Bt抗虫蛋白基因
3．相关的已知结构和功能清晰
4．(2)PCR
5．(1)聚合酶链式反应　各种组分　反应条件　核苷酸序列　(2)DNA半保留复制　(3)①缓冲　③脱氧核苷酸　④耐高温　⑤3′　(4)①90　解聚　②50　两种引物　③72　耐高温的DNA聚合酶　(5)模板　增加一倍　指数　(6)琼脂糖凝胶电泳
判断正误
(1)×　(2)×　(3)√　(4)√
提示　(1)PCR反应中温度的周期性改变是为了变性、复性、延伸，DNA聚合酶催化子链的延伸。(2)PCR扩增技术中，高温使双链DNA解聚。
探究核心知识
任务一
1．不是　PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段
2．3　1/4
3．根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物
4．引物Ⅰ和引物Ⅱ会因局部发生碱基互补配对而失效　引物Ⅰ′自身折叠后会因出现局部碱基互补配对而失效
5．5′端　限制酶的识别序列
6．2n－1
落实思维方法
1．A　[目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子，A错误。]
2．D　[由题图可知，以原来的每条母链为模板经第一轮合成的两个DNA分子中，只含有引物A或引物B，而以新合成的子链为模板合成新DNA分子时，两种引物都含有，故第三轮循环共产生8个DNA分子，其中含有引物A的DNA分子是7个，即占7/8，D错误。]
二、
梳理教材新知
1．稳定存在　表达　发挥作用
2．启动子　上游　RNA聚合酶　终止子　下游　转录　标记
3．(1)限制酶　(2)同种　(3)DNA连接酶
判断正误
(1)×　(2)×　(3)√
提示　(1)基因工程操作程序的核心步骤是基因表达载体的构建。(2)基因表达载体中有的含有启动子和终止子，终止密码子位于mRNA上。
探究核心知识
任务二
1．直接被分解　细胞分裂　不再含有目的基因　借助载体将其导入棉花细胞
2．启动子下游和终止子上游　只有插入在启动子和终止子之间，目的基因才可以正常表达
3．(1)不能　SmaⅠ会破坏质粒的抗生素抗性基因(标记基因)，不利于重组DNA分子的筛选　(2)可以防止载体和目的基因的自身环化以及目的基因与载体的反向连接
落实思维方法
3．C　[酶3切割后得到的是平末端，常用T4 DNA连接酶连接，A不符合题意；质粒用酶3切割后得到的是平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B不符合题意；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C符合题意；若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D不符合题意。]
4．D　[若用Hind Ⅲ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确；若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因(TetR)中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。]

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