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实验突破二
DNA片段的扩增及电泳鉴定
第3章 基因工程
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一、DNA片段的扩增
1.实验原理
解聚与结合
2.实验步骤
微量移液器
微量离心
管
离心机
反应液
二、PCR扩增产物的电泳鉴定
1.实验原理
琼脂糖凝胶电泳
凝胶的浓度
DNA
分子的大小和构象
紫外灯
2.实验步骤
琼脂糖
核
酸染料
加样孔
电泳缓冲液
加样孔
指示分子大小的标准参
照物
指示剂
紫外灯
三、操作提示
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行 处理。在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
2.缓冲液和酶应分装成小份，并在 储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上 融化。
高压灭菌
－20℃
缓慢
四、关键点拨
1.PCR扩增目的基因时，复性温度的设定是成败的关键。复性温度过高会破坏引物与模板的碱基配对，复性温度过低又会造成引物不能与DNA模板链的特定部位结合。复性温度的设定与 、 有关，假设引物的长度相同，在G、C含量高时，设定的复性温度要 一些。因为DNA分子中G—C之间有 个氢键，A—T之间有 个氢键。
引物长度
碱基组成
高
三
两
2.未出现扩增条带的主要原因
(1)TaqDNA聚合酶失活。
(2)引物出现质量问题。
(3)Mg2＋浓度过低。
(4)变性时的温度 ，变性时间短。
3.出现非特异性扩增条带的主要原因
(1)模板DNA出现 。
(2)引物特异性不强或形成引物二聚体。
(3)Mg2＋浓度 。
(4)复性时的温度 等。
低
污染
过高
过低
例1　(2023·沧州高二月考)关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列相关叙述正确的是
A.PCR仪实质上就是一台能自动调控温度的仪器，但在使用时需根据扩
增的DNA片段以及引物的情况人工设定合适的温度
B.PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶主要在复性过程中
起作用
C.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、
蒸馏水和移液器等在使用前都必须进行高压灭菌处理
D.电泳时，电泳缓冲液不能没过凝胶，以免凝胶加样孔中的电泳样液流出
√
PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶主要在延伸过程中起作用，B错误；
为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前都必须进行高压灭菌处理，移液器不需要高压灭菌处理，C错误；
电泳时，电泳缓冲液以没过凝胶1 mm为宜，D错误。
例2　用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为无菌蒸馏水，PCR时加入的模板DNA如图所示。据此作出的分析，不合理的是
A.PCR产物的分子大小
在250～500 bp之间
B.3号样品为不含目的
基因的载体DNA
C.9号样品对应植株不
是所需的转基因植株
D.10号确定反应体系等对结果没有干扰
√
PCR过程中，可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段，4～9号是转基因植株，理论上应包含目的基因，结合2号野生型和10号蒸馏水组的结果，推测包含目的基因的片段大小应为250～500 bp，A合理；
3号PCR结果包含250～
500 bp片段，应包含目
的基因，B不合理；
9号PCR结果不包含250
～500 bp片段，所以不是所需转基因植株，C合理；
10号放入蒸馏水，可排除反应体系等对结果的干扰，D合理。
将PCR所用缓冲液和酶从冰箱拿出，需放在冰块上缓慢融化，C错误。
1.下列关于PCR操作过程的叙述，错误的是
A.在进行操作时，一定要戴好一次性手套
B.PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，在－20 ℃储存
C.将PCR所用缓冲液和酶从冰箱拿出，需放在高温环境中迅速融化
D.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的
枪头都必须更换
√
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2.(2023·兰州高二期中)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少非特异条带的产生，以下措施中有效的是
A.增加模板DNA的量
B.延长热变性的时间
C.延长延伸的时间
D.提高复性的温度
√
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增加模板DNA的量可以提高反应速度，但不能有效减少非特异性条带的产生，A错误；
延长热变性的时间和延长延伸的时间会影响变性延伸过程，但对于延伸中的配对影响不大，故不能有效减少产生非特异性条带，B、C错误；
非特异性条带增加的原因可能是复性温度过低而造成引物与模板的错配，故可通过提高复性的温度来减少非特异性条带的产生，D正确。
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3.下列有关电泳的叙述，不正确的是
A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
B.待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电
泳中的迁移速率
C.进行电泳时，带电分子会向着与其所带电荷相同的电极移动
D.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
√
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由于同性相斥、异性相吸，带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动，C错误。
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4.为优化目的基因(700 bp)的PCR条件，研究者设计不同的复性温度进行实验，产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图所示。据图分析，下列有关说法错误的是
A.对照组可用无菌蒸馏水代替模板，
其他成分相同
B.电泳条带的宽度、亮度与扩增产
物大小呈正相关
C.复性温度的高低会影响PCR扩增
产物的纯度
D.58 ℃是本实验中扩增该基因的最佳复性温度
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√
实验设计应遵循对照原则与单一变量原则，故对照组可用无菌蒸馏水代替模板，其他成分相同，A正确；
PCR技术中，反应最终的电泳
条带的宽度、亮度与PCR起始
状态的模板DNA(或者模板)含
量呈正相关，B错误；
据图可知，58 ℃条件下条带宽
度最大，故该温度是本实验中扩增该基因的最佳复性温度，D正确。
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5.(2023·北海高二期末)在基因工程操作中，科研人员利用两种限制酶(R1和R2)处理基因载体，进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图所示。下列相关叙述不正确的是
A.电泳时，核酸的移动方向是从负极到正极的
B.该载体最可能为环状DNA分子
C.限制酶R1与R2的切点最长相距约600 bp
D.两种限制酶在载体上识别的序列可能相同
√
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根据图示可知，200 bp的DNA分子量小，800 bp的DNA分子量较大，200 bp的DNA移动速度快，所以在电泳时，
核酸的移动方向是从负极到正极的，A正确；
当仅用一种限制酶切割载体时，仅产生一种
长度的DNA片段，因此该载体最有可能为环
状DNA分子，B正确；
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两种限制酶同时切割时产生600 bp和200 bp两种长度的DNA片段，所以两种限制酶的切点最长相距约600 bp，
C正确；
当仅用一种限制酶切割载体时，两种限
制酶切割产生的DNA片段等长，而两种
限制酶同时切割时则产生两种不同长度
的DNA片段，所以两种限制酶在载体上
各有一个酶切位点，二者识别的序列不相同，D错误。
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6.(2023·江苏，22节选)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：
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(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有___________，扩增程序中最主要的不同是___________。
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模板、引物
引物的设计
PCR反应进行的条件：引物、耐高温的DNA聚合酶、4种脱氧核苷酸、模板和缓冲液(其中需要Mg2＋)。分别进行
PCR扩增片段F1与片段F2时，配
制的两个反应体系中不同的有模
板(片段F1、片段F2)、引物。PCR
过程需要两种引物，能分别与目
的基因两条链的3′端通过碱基互
补配对结合。引物设计是决定PCR
反应成败的最重要因素，因此扩增程序中最主要的不同是引物的设计。
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(2)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，不需要使用的酶主要有____________________。
限制酶、DNA连接酶
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传统重组质粒构建需要使用限制酶切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连
接酶将目的基因和质粒连接成
重组质粒。将PCR产物片段与
线性质粒载体混合后，在重组
酶的作用下可形成环化质粒，
不需要使用限制酶和DNA连接酶。
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(3)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板、用引物F1－F和F2－R进行了PCR扩增，质粒P1～P4的扩增产物电泳结果如图2。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有________。
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P3、P4
EGFP为720 bp，AnB1为390 bp，二者的总大小为720 bp＋390 bp＝1 110 bp，用引物F1－F和F2－R进行了PCR扩增，其大小接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。
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(4)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是_____________________________________。
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电泳只能测大小(长度)，不知道具体序列
琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列，因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。
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6一、DNA片段的扩增
1．实验原理
2．实验步骤
二、PCR扩增产物的电泳鉴定
1．实验原理
2．实验步骤
三、操作提示
1．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行__________处理。在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
2．缓冲液和酶应分装成小份，并在__________储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上______融化。
四、关键点拨
1．PCR扩增目的基因时，复性温度的设定是成败的关键。复性温度过高会破坏引物与模板的碱基配对，复性温度过低又会造成引物不能与DNA模板链的特定部位结合。复性温度的设定与__________、___________有关，假设引物的长度相同，在G、C含量高时，设定的复性温度要______一些。因为DNA分子中G—C之间有____个氢键，A—T之间有____个氢键。
2．未出现扩增条带的主要原因
(1)TaqDNA聚合酶失活。
(2)引物出现质量问题。
(3)Mg2＋浓度过低。
(4)变性时的温度____，变性时间短。
3．出现非特异性扩增条带的主要原因
(1)模板DNA出现__________。
(2)引物特异性不强或形成引物二聚体。
(3)Mg2＋浓度______。
(4)复性时的温度______等。
例1　(2023·沧州高二月考)关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列相关叙述正确的是(　　)
A．PCR仪实质上就是一台能自动调控温度的仪器，但在使用时需根据扩增的DNA片段以及引物的情况人工设定合适的温度
B．PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶主要在复性过程中起作用
C．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水和移液器等在使用前都必须进行高压灭菌处理
D．电泳时，电泳缓冲液不能没过凝胶，以免凝胶加样孔中的电泳样液流出
例2　用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为无菌蒸馏水，PCR时加入的模板DNA如图所示。据此作出的分析，不合理的是(　　)
A．PCR产物的分子大小在250～500 bp之间
B．3号样品为不含目的基因的载体DNA
C．9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D．10号确定反应体系等对结果没有干扰
1．下列关于PCR操作过程的叙述，错误的是(　　)
A．在进行操作时，一定要戴好一次性手套
B．PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，在－20 ℃储存
C．将PCR所用缓冲液和酶从冰箱拿出，需放在高温环境中迅速融化
D．在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换
2．(2023·兰州高二期中)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少非特异条带的产生，以下措施中有效的是(　　)
A．增加模板DNA的量
B．延长热变性的时间
C．延长延伸的时间
D．提高复性的温度
3．下列有关电泳的叙述，不正确的是(　　)
A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
B．待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电泳中的迁移速率
C．进行电泳时，带电分子会向着与其所带电荷相同的电极移动
D．PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
4．为优化目的基因(700 bp)的PCR条件，研究者设计不同的复性温度进行实验，产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图所示。据图分析，下列有关说法错误的是(　　)
A．对照组可用无菌蒸馏水代替模板，其他成分相同
B．电泳条带的宽度、亮度与扩增产物大小呈正相关
C．复性温度的高低会影响PCR扩增产物的纯度
D．58 ℃是本实验中扩增该基因的最佳复性温度
5．(2023·北海高二期末)在基因工程操作中，科研人员利用两种限制酶(R1和R2)处理基因载体，进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图所示。下列相关叙述不正确的是(　　)
A．电泳时，核酸的移动方向是从负极到正极的
B．该载体最可能为环状DNA分子
C．限制酶R1与R2的切点最长相距约600 bp
D．两种限制酶在载体上识别的序列可能相同
6．(2023·江苏，22节选)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：
(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有______________，扩增程序中最主要的不同是________________。
(2)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，不需要使用的酶主要有_________________
_______________________________________________________________________。
(3)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板、用引物F1－F和F2－R进行了PCR扩增，质粒P1～P4的扩增产物电泳结果如图2。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有______________________________________________________。
(4)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是________________________________________________________________________。
答案精析
一、
1．解聚与结合
2．微量移液器　微量离心管　离心机　反应液
二、
1．琼脂糖凝胶电泳　凝胶的浓度　DNA分子的大小和构象　紫外灯
2．琼脂糖　核酸染料　加样孔　电泳缓冲液　加样孔　指示分子大小的标准参照物　指示剂　紫外灯
三、
1．高压灭菌　
2．－20 ℃　缓慢
四、
1．引物长度　碱基组成　高　三　两
2．(4)低
3．(1)污染　(3)过高　(4)过低
例1　A　[PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶主要在延伸过程中起作用，B错误；为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前都必须进行高压灭菌处理，移液器不需要高压灭菌处理，C错误；电泳时，电泳缓冲液以没过凝胶1 mm为宜，D错误。]
例2　B　[PCR过程中，可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段，4～9号是转基因植株，理论上应包含目的基因，结合2号野生型和10号蒸馏水组的结果，推测包含目的基因的片段大小应为250～500 bp，A合理；3号PCR结果包含250～500 bp片段，应包含目的基因，B不合理；9号PCR结果不包含250～500 bp片段，所以不是所需转基因植株，C合理；10号放入蒸馏水，可排除反应体系等对结果的干扰，D合理。]
跟踪训练
1．C　[将PCR所用缓冲液和酶从冰箱拿出，需放在冰块上缓慢融化，C错误。]
2．D　[增加模板DNA的量可以提高反应速度，但不能有效减少非特异性条带的产生，A错误；延长热变性的时间和延长延伸的时间会影响变性延伸过程，但对于延伸中的配对影响不大，故不能有效减少产生非特异性条带，B、C错误；非特异性条带增加的原因可能是复性温度过低而造成引物与模板的错配，故可通过提高复性的温度来减少非特异性条带的产生，D正确。]
3．C　[由于同性相斥、异性相吸，带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动，C错误。]
4．B　[实验设计应遵循对照原则与单一变量原则，故对照组可用无菌蒸馏水代替模板，其他成分相同，A正确；PCR技术中，反应最终的电泳条带的宽度、亮度与 PCR 起始状态的模板DNA(或者模板)含量呈正相关，B错误；据图可知，58 ℃条件下条带宽度最大，故该温度是本实验中扩增该基因的最佳复性温度，D正确。]
5．D　[根据图示可知，200 bp的DNA分子量小，800 bp的DNA分子量较大，200 bp的DNA移动速度快，所以在电泳时，核酸的移动方向是从负极到正极的，A正确；当仅用一种限制酶切割载体时，仅产生一种长度的DNA片段，因此该载体最有可能为环状DNA分子，B正确；两种限制酶同时切割时产生600 bp和200 bp两种长度的DNA片段，所以两种限制酶的切点最长相距约600 bp，C正确；当仅用一种限制酶切割载体时，两种限制酶切割产生的DNA片段等长，而两种限制酶同时切割时则产生两种不同长度的DNA片段，所以两种限制酶在载体上各有一个酶切位点，二者识别的序列不相同，D错误。]
6．(1)模板、引物　引物的设计　(2)限制酶、DNA连接酶　(3)P3、P4　(4)电泳只能测大小(长度)，不知道具体序列
解析　(1)PCR反应进行的条件：引物、耐高温的DNA聚合酶、4种脱氧核苷酸、模板和缓冲液(其中需要Mg2＋)。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有模板(片段F1、片段F2)、引物。PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3′端通过碱基互补配对结合。引物设计是决定PCR反应成败的最重要因素，因此扩增程序中最主要的不同是引物的设计。(2)传统重组质粒构建需要使用限制酶切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶的作用下可形成环化质粒，不需要使用限制酶和DNA连接酶。(3)EGFP为720 bp，AnB1为390 bp，二者的总大小为720 bp＋390 bp＝1 110 bp，用引物F1－F和F2－R进行了PCR扩增，其大小接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。(4)琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列，因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。

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