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(共47张PPT)
重点突破练(三)
第3章 基因工程
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题组一　基因工程的工具
1.1972年，伯格首先在体外进行了DNA改造的研究，成功地构建了第一个体外重组DNA分子。下列相关叙述正确的是
A.不同的DNA分子必须用同一种限制酶切割，才能产生相同的黏性末端
B.DNA连接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆转录酶都能催化形成磷酸
二酯键
C.当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，
产生的是平末端
D.限制酶和DNA连接酶的作用部位不同
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有些限制酶的识别序列不同，但可以产生相同的黏性末端，A错误；
当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，C错误；
限制酶和DNA连接酶的作用部位相同，都是磷酸二酯键，D错误。
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2.(2023·乐山高二期末)限制酶a和b的识别序列与切割位点如图所示。下列叙述正确的是
A.相同DNA分子被a酶切割的概率
一般高于b酶
B.a酶、b酶均能切割氢键和磷酸二酯键
C.能被a酶识别并切割的序列也能被b酶切割
D.基因工程中同时用a酶、b酶两种酶切割质粒能防止其自身环化
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限制酶识别序列越短，则该序列在DNA分子中出现的概率就越大，故相同DNA分子被a酶切割的概率一般高于b酶，A正确；
a酶与b酶切断的化学键相同，都是磷酸二酯键，B错误；
a酶的识别序列是－GATC－，b酶
识别序列是－GGATCC－，能被b
酶识别并切割的序列也能被a酶切
割，但能被a酶识别并切割的序列不一定能被b酶切割，C错误；
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为防止限制酶切割后的质粒自身环化，在基因工程中通常使用能切出不同黏性末端的两种限制酶切割同一质粒，而a酶、b酶切割产生相同的黏性末端，D错误。
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3.质粒是基因工程中常用的目的基因运载工具。下列有关叙述正确的是
A.质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA的筛选
B.天然质粒均可以直接作为载体将目的基因送入受体细胞
C.在所有的质粒上都能找到一个至多个限制酶切割位点
D.携带目的基因的重组质粒只有整合到宿主细胞的染色体DNA上才会随
后者的复制而复制
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天然质粒往往不能直接作为载体，要根据不同的目的和需求进行人工改造后再使用，B错误；
并不是所有的质粒都能作为载体，所以也不是在所有的质粒上总能找到一个至多个限制酶切割位点，C错误；
携带目的基因的重组质粒进入受体细胞后，能在受体细胞中进行自我复制，或整合到受体细胞染色体DNA上，随受体细胞染色体DNA同步复制，D错误。
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4.若要利用某目的基因(图甲)和P1噬菌体载体(图乙)构建重组DNA(图丙)，限制性内切核酸酶的酶切位点分别是BglⅡ(A↓GATCT)、EcoRⅠ(G↓AATTC)
和Sau3A Ⅰ(↓GATC)。下列分析正确的是
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A.用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
B.用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
C.用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
D.用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
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解答本题的关键是要看清切割后目的基因插入的方向，只有用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体，才能保证构建的重组DNA中RNA聚合酶在插入的目的基因上的移动方向与图丙相同。
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5.如图是利用基因工程技术生产疫苗的部分过程，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性内切核酸酶。下列有关说法不正确的是
A.图示过程是基因工程的核心步骤，所需的限制性内切核酸酶一般来自原核生物
B.图示中构建基因表达载体时，需
用到EcoRⅠ、 Pst Ⅰ两种限制性
内切核酸酶
C.一种限制性内切核酸酶只能识别
一种特定的核糖核苷酸序列并在
特定的位点切割
D.卡那霉素抗性基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来
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图示表示基因表达载体的构建过程，这是基因工程的核心步骤，所需的限制性内切核酸酶一般来自原核生物，A正确；
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限制性内切核酸酶具有特异性，即一种限制性内切核酸酶只能识别某种特定的脱氧核苷酸序列并在特定的位点切割，C错误；
卡那霉素抗性基因作为标记基因，主要作用是筛选含有目的基因的受体细胞，D正确。
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题组二　基因工程的基本操作程序及应用
6.(2023·银川高二期末)下列关于基因工程技术的叙述，正确的是
A.当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的是黏性末端
B.用于PCR的引物长度通常为10～20个核苷酸
C.载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因
D.抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达
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当限制酶在它识别序列的中心轴线切开时，产生的是平末端，A错误；
用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸，B错误；
载体质粒通常采用抗生素抗性基因作为筛选标记基因，C错误；
抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达，需要进行检测和鉴定，D正确。
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7.科学研究发现Notch基因编码一类高度保守的细胞表面受体，通过与其相应的配体结合调控细胞增殖、分化和凋亡等。为了研究Notch基因表达产物的功能，科学家构建含Notch基因的重组质粒，并使其在大肠杆菌中表达。下列相关分析错误的是
A.表达是指在基因的指导下，经过转录和翻译，产生相应的蛋白质
B.重组质粒除含Notch基因外，还应具备启动子、终止子、标记基因等
C.可通过PCR技术检测Notch基因是否被成功表达
D.利用PCR技术扩增目的基因时，高温代替了解旋酶的功能
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判断导入的基因是否成功表达，需要用抗原—抗体杂交技术，C错误；
利用PCR技术扩增目的基因时，利用高温可使双链DNA中的氢键断裂，即可用高温代替解旋酶的功能，D正确。
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8.(2024·承德高二质检)荧光定量PCR是一种定量计算待测样品的初始模板量的方法。在PCR反应体系中加入特异性的荧光探针，荧光探针可以掺入新合成的DNA链中，每扩增一条
DNA链，就有一个荧光分子形成，通
过对扩增反应中的荧光强度进行实时
检测，最后通过标准曲线定量计算初
始模板量。如图为某荧光定量PCR的
标准曲线。下列说法错误的是
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A.一定范围内，荧光强度与扩增出
的DNA量呈正相关
B.每个反应管内荧光探针的量相同
C.样品甲的初始模板量大于样品乙
D.荧光强度不再变化时PCR反应停止
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荧光强度不再变化可能是因为荧光探针或原料等消耗尽，若为前者，此后PCR反应仍在进行，D错误。
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9.人乳铁蛋白是乳汁中主要的铁结合蛋白，可提高人体吸收铁的能力，增强免疫力。研究者通过生物工程技术制备山羊乳腺生物反应器，过程如图所示。下列相关叙述错误的是
A.①过程构建的表达载
体含有组织特异性启
动子
B.②过程通常在显微镜下进行去核、注入等操作
C.该过程培养的山羊所有组织细胞均能分泌人乳铁蛋白
D.该过程利用了转基因、核移植和胚胎移植等工程技术
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①过程构建的表达载体含有组织特异性启动子，即RNA聚合酶的结合部位，A正确；
②过程为核移植，通
常在显微镜下进行去
核、注入等操作，B正确；
该过程培养的山羊只有乳腺细胞能分泌人乳铁蛋白，C错误；
据题图分析可知，该过程利用了转基因、核移植和胚胎移植等工程技术，D正确。
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10.(2024·泉州高二联考)由于某目的基因酶切后的末端为平末端，载体E只有产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P 将目的基因接入载体E。据图分析，下列叙述错误的是
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A.将该目的基因接入载体P时，需用限制酶EcoRⅤ切割载体P
B.最后将该目的基因接入载体E，可用限制酶XhoⅠ和PstⅠ切割载体P
C.载体P不能作为基因表达
载体，是因为其没有表
达该目的基因的启动子
与终止子
D.若受体细胞表现出抗性
基因的相应性状，表明
重组载体成功导入了受体细胞
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据题图可知，中间载体P和载体E均含有限制酶XhoⅠ和PstⅠ的识别序列，故可选用限制酶XhoⅠ和PstⅠ切割载体P，载体P的这两种酶识别序列之间含有EcoRⅤ识别位点，并且其切割的产物为平末端，可以用于连接目的基因，
A正确；
受体细胞表现出抗性基
因的相应性状，也可能
是导入了空质粒(不含目
的基因的质粒)，D错误。
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题组三　蛋白质工程
11.下列有关蛋白质工程的叙述，错误的是
A.收集大量的蛋白质分子结构的信息，以便分析结构与功能之间的关系
B.蛋白质工程的基本途径是从预期的蛋白质功能出发最终推测出脱氧核
苷酸序列的过程
C.T4溶菌酶中引入二硫键提高了它的热稳定性是蛋白质工程的体现
D.蛋白质工程只能改造现有的蛋白质而不能制造新的蛋白质
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蛋白质结构的多样性决定蛋白质功能的多样性，在实施蛋白质工程的准备阶段，收集大量的蛋白质分子结构的信息，分析某一结构与预期的蛋白质功能之间的关系，从而据其构建出某一段氨基酸序列，此氨基酸序列成为构建脱氧核苷酸序列(即基因)的依据，A、B正确；
T4溶菌酶是蛋白质，对其改造属于蛋白质工程，C正确；
在蛋白质工程中，基因改造后可以表达出改造的蛋白质，也可以制造出新的蛋白质，D错误。
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12.(2024·开封高二期中)人体内的t－PA蛋白能高效降解由纤维蛋白凝聚而成的血栓，是心梗和
脑血栓的急救药，改造后的
t－PA蛋白能显著降低出血
副作用。如图表示构建含
t－PA改良基因重组质粒的
过程示意图。下列相关说
法不正确的是
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A.制备改良t－PA蛋白的过程属于蛋白质工程
B.构建重组质粒时，选用的
限制酶是XmaⅠ和BglⅡ
C.新霉素抗性基因的作用是
便于将导入质粒的大肠杆
菌筛选出来
D.在加入新霉素的培养基中
选择呈蓝色的菌落选育工程菌株
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重组质粒中的LacZ基因已被破坏，所以，在加入新霉素的培养基中应选择呈白色的菌落选育工程菌株，D错误。
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13.菊天牛是菊花的主要害虫之一。科研人员将抗虫基因转入菊花，培育出抗虫菊花。如图是获得转基因菊花的技术流程，请据图回答下列问题：
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注：卡那霉素抗性基因(KanR)作为标记基因，菊花叶片对卡那霉素高度敏感。
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(1)为了促进农杆菌吸收重组质粒，可用______处理农杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
Ca2＋
根据农杆菌的Ti质粒中的T－DNA可以整合到受体细胞的染色体DNA上的特点，通常用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞。
(2)将重组质粒导入农杆菌的目的是利用农杆菌能够__________________
_________________________________的特点，使目的基因进入受体细胞中，并插入到菊花细胞的___________上，最终形成转基因植株。
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侵染菊花(或植物)
细胞，并将T－DNA转移至受体细胞
染色体DNA
基因表达载体的构建中，需要标记基因，根据题意可知，该标记基因为卡那霉素抗性基因，因此需要在加入卡那霉素的培养基中选择出成功转入目的基因的菊花。
(3)将愈伤组织转移到添加一定浓度植物激素和________的培养基中，在适宜条件下进行培养，筛选转基因菊花。
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卡那霉素
(4)用PCR方法检测转基因菊花是否含有目的基因时，需根据___________
___________的核苷酸序列设计特异引物，以__________________为模板进行第一轮扩增。
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抗虫基因
(目的基因)
转基因菊花的DNA
(5)将转基因菊花嫩茎及叶片与人工饲料以适当比例混合后饲喂菊天牛
2龄幼虫，实验结果如表所示。
①对照组应饲喂等量的__________
_____________________________。
②据表分析，__________________
_____差异显著，说明转基因菊花对
菊天牛2龄幼虫有较强的毒杀作用。
组别 死亡率/%
实验组 转基因植株1 60.00
转基因植株2 53.33
对照组 13.33
非转基因菊
花嫩茎及叶片与人工饲料混合物
实验组与对照组死
亡率
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实验设计应遵循对照原则，因此对照组应该加入非转基因菊花嫩茎及叶片与人工饲料混合物；根据实验组比对照组的死亡率高，说明转基因菊花对菊天牛2龄幼虫有较强的毒杀作用。
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14.(2024·广州高二期中)经过不懈努力，我国科研人员从墨西哥野玉米“大刍草”中，成功找回玉米人工驯化过程中丢失的一个控制高蛋白含量的优良基因THP9，将此高蛋白基因克隆出来并转移到玉米细胞内，获得转基因高蛋白玉米新品种。回答下列问题：
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(1)THP9基因游离的磷酸基团侧为____(填“5′”或“3′”)端，已知图1中THP9基因转录方向为从左往右，则THP9基因转录时的模板链是____链。
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5′
乙
(2)构建基因表达载体时，若科研人员需将THP9基因整合到图中质粒上，应使用限制酶______________切割图中质粒，使用限制酶________________切割图中含THP9基因的DNA片段，以获得能正确表达THP9基因的重组质粒。
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MfeⅠ、HindⅢ
EcoRⅠ、HindⅢ
图中THP9基因转录方向为从左往右，即启动子位于左端，终止子位于右端，因为该基因下游只有一个酶切位点，故一定用HindⅢ切割质粒和目的基因，对于质粒来说，不能用EcoRⅠ进行切割(含两个切
割位点，会切掉外源基因的终止子)，不能用
BamHⅠ切割(会破坏启动子)，所以应使用限
制酶MfeⅠ、HindⅢ切割图1中质粒，而目的
基因不能用限制酶MfeⅠ切割，与MfeⅠ能形
成相同黏性末端的是EcoRⅠ，故用EcoRⅠ、
HindⅢ切割含THP9基因的DNA片段。
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(3)为了筛选出含重组质粒的受体细胞，应在添加___________的选择培养基上培养，培养后获得的菌落不能判定是否含有重组质粒，原因是__________________________
___________________。
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氨苄青霉素
含普通质粒的受体细胞在该培
养基中也能正常生长
(4)在扩增THP9基因时，需要预先设计引物。如图2所示THP9基因的引物是_______________。PCR扩增THP9基因时，应在目的基因上、下游引物的_____(填“5′”或“3′”)端分别添加相应的酶切位点。通常在两条引物上设计加入不同限制酶的酶切位点，主要目的是___________
_______________________________
_____________________。
引物①和引物④
5′
可以防止载体和目的基因的自身环化以及目的基因与载体的反向连接
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15.(2023·盐城高二月考)科学家通过利用PCR定点突变技术改造Rubisco酶基因，提高了光合作用过程中Rubisco酶对CO2的亲和力，从而显著提高了植物的光合作用速率。请回答下列问题：
(1)PCR过程所依据的原理是________________，该过程需要加入的酶是_____________________________________。利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有目的基因的一段已知核苷酸序列，以便根据这一序列合成______。
DNA半保留复制
耐高温的DNA聚合酶(或TaqDNA聚合酶)
引物
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(2)该技术不直接改造Rubisco酶，而通过对Rubisco酶基因进行改造，从而实现对Rubisco酶的改造，其原因是_________________________________
_____________________________________________________。和传统基因工程技术相比较，PCR定点突变技术在应用方面最突出的优点是______
________________________，PCR定点突变技术属于___________(填“基因工程”“细胞工程”或“蛋白质工程”)的范畴。
出自然界不存在的蛋白质
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蛋白质空间结构较为复杂，对其直接改造难以操作；直接改造蛋白质不能遗传，改造基因能遗传
能生产
蛋白质工程
(3)可利用定点突变的DNA构建基因表达载体，常用______________将基因表达载体导入植物细胞，将该细胞经植物组织培养技术培育成幼苗，从细胞水平分析所依据的原理是____________________。
农杆菌转化法
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植物细胞具有全能性作业19　重点突破练(三)
(分值：100分)
第1～10题，每题4分；第11～12题，每题5分，共50分。
题组一　基因工程的工具
1．1972年，伯格首先在体外进行了DNA改造的研究，成功地构建了第一个体外重组DNA分子。下列相关叙述正确的是(　　)
A．不同的DNA分子必须用同一种限制酶切割，才能产生相同的黏性末端
B．DNA连接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆转录酶都能催化形成磷酸二酯键
C．当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是平末端
D．限制酶和DNA连接酶的作用部位不同
2．(2023·乐山高二期末)限制酶a和b的识别序列与切割位点如图所示。下列叙述正确的是(　　)
A．相同DNA分子被a酶切割的概率一般高于b酶
B．a酶、b酶均能切割氢键和磷酸二酯键
C．能被a酶识别并切割的序列也能被b酶切割
D．基因工程中同时用a酶、b酶两种酶切割质粒能防止其自身环化
3．质粒是基因工程中常用的目的基因运载工具。下列有关叙述正确的是(　　)
A．质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA的筛选
B．天然质粒均可以直接作为载体将目的基因送入受体细胞
C．在所有的质粒上都能找到一个至多个限制酶切割位点
D．携带目的基因的重组质粒只有整合到宿主细胞的染色体DNA上才会随后者的复制而复制
4．若要利用某目的基因(图甲)和P1噬菌体载体(图乙)构建重组DNA(图丙)，限制性内切核酸酶的酶切位点分别是BglⅡ(A↓GATCT)、EcoRⅠ(G↓AATTC)和Sau3A Ⅰ(↓GATC)。下列分析正确的是(　　)
A．用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
B．用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
C．用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
D．用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
5．如图是利用基因工程技术生产疫苗的部分过程，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性内切核酸酶。下列有关说法不正确的是(　　)
A．图示过程是基因工程的核心步骤，所需的限制性内切核酸酶一般来自原核生物
B．图示中构建基因表达载体时，需用到EcoRⅠ、PstⅠ两种限制性内切核酸酶
C．一种限制性内切核酸酶只能识别一种特定的核糖核苷酸序列并在特定的位点切割
D．卡那霉素抗性基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来
题组二　基因工程的基本操作程序及应用
6．(2023·银川高二期末)下列关于基因工程技术的叙述，正确的是(　　)
A．当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的是黏性末端
B．用于PCR的引物长度通常为10～20个核苷酸
C．载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因
D．抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达
7．科学研究发现Notch基因编码一类高度保守的细胞表面受体，通过与其相应的配体结合调控细胞增殖、分化和凋亡等。为了研究Notch基因表达产物的功能，科学家构建含Notch基因的重组质粒，并使其在大肠杆菌中表达。下列相关分析错误的是(　　)
A．表达是指在基因的指导下，经过转录和翻译，产生相应的蛋白质
B．重组质粒除含Notch基因外，还应具备启动子、终止子、标记基因等
C．可通过PCR技术检测Notch基因是否被成功表达
D．利用PCR技术扩增目的基因时，高温代替了解旋酶的功能
8．(2024·承德高二质检)荧光定量PCR是一种定量计算待测样品的初始模板量的方法。在PCR反应体系中加入特异性的荧光探针，荧光探针可以掺入新合成的DNA链中，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，通过对扩增反应中的荧光强度进行实时检测，最后通过标准曲线定量计算初始模板量。如图为某荧光定量PCR的标准曲线。下列说法错误的是(　　)
A．一定范围内，荧光强度与扩增出的DNA量呈正相关
B．每个反应管内荧光探针的量相同
C．样品甲的初始模板量大于样品乙
D．荧光强度不再变化时PCR反应停止
9．人乳铁蛋白是乳汁中主要的铁结合蛋白，可提高人体吸收铁的能力，增强免疫力。研究者通过生物工程技术制备山羊乳腺生物反应器，过程如图所示。下列相关叙述错误的是(　　)
A．①过程构建的表达载体含有组织特异性启动子
B．②过程通常在显微镜下进行去核、注入等操作
C．该过程培养的山羊所有组织细胞均能分泌人乳铁蛋白
D．该过程利用了转基因、核移植和胚胎移植等工程技术
10．(2024·泉州高二联考)由于某目的基因酶切后的末端为平末端，载体E只有产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将目的基因接入载体E。据图分析，下列叙述错误的是(　　)
A．将该目的基因接入载体P时，需用限制酶EcoRⅤ切割载体P
B．最后将该目的基因接入载体E，可用限制酶XhoⅠ和PstⅠ切割载体P
C．载体P不能作为基因表达载体，是因为其没有表达该目的基因的启动子与终止子
D．若受体细胞表现出抗性基因的相应性状，表明重组载体成功导入了受体细胞
题组三　蛋白质工程
11．下列有关蛋白质工程的叙述，错误的是(　　)
A．收集大量的蛋白质分子结构的信息，以便分析结构与功能之间的关系
B．蛋白质工程的基本途径是从预期的蛋白质功能出发最终推测出脱氧核苷酸序列的过程
C．T4溶菌酶中引入二硫键提高了它的热稳定性是蛋白质工程的体现
D．蛋白质工程只能改造现有的蛋白质而不能制造新的蛋白质
12．(2024·开封高二期中)人体内的t－PA蛋白能高效降解由纤维蛋白凝聚而成的血栓，是心梗和脑血栓的急救药，改造后的t－PA蛋白能显著降低出血副作用。如图表示构建含t－PA改良基因重组质粒的过程示意图。下列相关说法不正确的是(　　)
A．制备改良t－PA蛋白的过程属于蛋白质工程
B．构建重组质粒时，选用的限制酶是XmaⅠ和BglⅡ
C．新霉素抗性基因的作用是便于将导入质粒的大肠杆菌筛选出来
D．在加入新霉素的培养基中选择呈蓝色的菌落选育工程菌株
13．(16分)菊天牛是菊花的主要害虫之一。科研人员将抗虫基因转入菊花，培育出抗虫菊花。如图是获得转基因菊花的技术流程，请据图回答下列问题：
注：卡那霉素抗性基因(KanR)作为标记基因，菊花叶片对卡那霉素高度敏感。
(1)为了促进农杆菌吸收重组质粒，可用__________处理农杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
(2)将重组质粒导入农杆菌的目的是利用农杆菌能够_________________________________的特点，使目的基因进入受体细胞中，并插入到菊花细胞的________________上，最终形成转基因植株。
(3)将愈伤组织转移到添加一定浓度植物激素和____________的培养基中，在适宜条件下进行培养，筛选转基因菊花。
(4)用PCR方法检测转基因菊花是否含有目的基因时，需根据____________________的核苷酸序列设计特异引物，以____________________为模板进行第一轮扩增。
(5)将转基因菊花嫩茎及叶片与人工饲料以适当比例混合后饲喂菊天牛2龄幼虫，实验结果如表所示。
组别 死亡率/%
实验组 转基因植株1 60.00
转基因植株2 53.33
对照组 13.33
①对照组应饲喂等量的__________________________________________________________。
②据表分析，________________________________差异显著，说明转基因菊花对菊天牛2龄幼虫有较强的毒杀作用。
14．(18分)(2024·广州高二期中)经过不懈努力，我国科研人员从墨西哥野玉米“大刍草”中，成功找回玉米人工驯化过程中丢失的一个控制高蛋白含量的优良基因THP9，将此高蛋白基因克隆出来并转移到玉米细胞内，获得转基因高蛋白玉米新品种。回答下列问题：
(1)THP9基因游离的磷酸基团侧为____________(填“5′”或“3′”)端，已知图1中THP9基因转录方向为从左往右，则THP9基因转录时的模板链是______链。
(2)构建基因表达载体时，若科研人员需将THP9基因整合到图中质粒上，应使用限制酶__________切割图中质粒，使用限制酶________________切割图中含THP9基因的DNA片段，以获得能正确表达THP9基因的重组质粒。
(3)为了筛选出含重组质粒的受体细胞，应在添加________________的选择培养基上培养，培养后获得的菌落不能判定是否含有重组质粒，原因是_________________________________。
(4)在扩增THP9基因时，需要预先设计引物。如图2所示THP9基因的引物是______________。PCR扩增THP9基因时，应在目的基因上、下游引物的______________(填“5′”或“3′”)端分别添加相应的酶切位点。通常在两条引物上设计加入不同限制酶的酶切位点，主要目的是_____________________________________________________________________________。
15．(16分)(2023·盐城高二月考)科学家通过利用PCR定点突变技术改造Rubisco酶基因，提高了光合作用过程中Rubisco酶对CO2的亲和力，从而显著提高了植物的光合作用速率。请回答下列问题：
(1)PCR过程所依据的原理是____________，该过程需要加入的酶是____________________。利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有目的基因的一段已知核苷酸序列，以便根据这一序列合成________。
(2)该技术不直接改造Rubisco酶，而通过对Rubisco酶基因进行改造，从而实现对Rubisco酶的改造，其原因是__________________________________________________________。和传统基因工程技术相比较，PCR定点突变技术在应用方面最突出的优点是_______________，PCR定点突变技术属于_________(填“基因工程”“细胞工程”或“蛋白质工程”)的范畴。
(3)可利用定点突变的DNA构建基因表达载体，常用________________将基因表达载体导入植物细胞，将该细胞经植物组织培养技术培育成幼苗，从细胞水平分析所依据的原理是________________。
答案精析
1．B　[有些限制酶的识别序列不同，但可以产生相同的黏性末端，A错误；当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，C错误；限制酶和DNA连接酶的作用部位相同，都是磷酸二酯键，D错误。]
2．A　[限制酶识别序列越短，则该序列在DNA分子中出现的概率就越大，故相同DNA分子被a酶切割的概率一般高于b酶，A正确；a酶与b酶切断的化学键相同，都是磷酸二酯键，B错误；a酶的识别序列是－GATC－，b酶识别序列是－GGATCC－，能被b酶识别并切割的序列也能被a酶切割，但能被a酶识别并切割的序列不一定能被b酶切割，C错误；为防止限制酶切割后的质粒自身环化，在基因工程中通常使用能切出不同黏性末端的两种限制酶切割同一质粒，而a酶、b酶切割产生相同的黏性末端，D错误。]
3．A　[天然质粒往往不能直接作为载体，要根据不同的目的和需求进行人工改造后再使用，B错误；并不是所有的质粒都能作为载体，所以也不是在所有的质粒上总能找到一个至多个限制酶切割位点，C错误；携带目的基因的重组质粒进入受体细胞后，能在受体细胞中进行自我复制，或整合到受体细胞染色体DNA上，随受体细胞染色体DNA同步复制，D错误。]
4．D　[解答本题的关键是要看清切割后目的基因插入的方向，只有用EcoR Ⅰ和Sau3A Ⅰ切割目的基因和P1噬菌体载体，才能保证构建的重组DNA中RNA聚合酶在插入的目的基因上的移动方向与图丙相同。]
5．C　[图示表示基因表达载体的构建过程，这是基因工程的核心步骤，所需的限制性内切核酸酶一般来自原核生物，A正确；限制性内切核酸酶具有特异性，即一种限制性内切核酸酶只能识别某种特定的脱氧核苷酸序列并在特定的位点切割，C错误；卡那霉素抗性基因作为标记基因，主要作用是筛选含有目的基因的受体细胞，D正确。]
6．D　[当限制酶在它识别序列的中心轴线切开时，产生的是平末端，A错误；用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸，B错误；载体质粒通常采用抗生素抗性基因作为筛选标记基因，C错误；抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达，需要进行检测和鉴定，D正确。]
7．C　[判断导入的基因是否成功表达，需要用抗原—抗体杂交技术，C错误；利用PCR技术扩增目的基因时，利用高温可使双链DNA中的氢键断裂，即可用高温代替解旋酶的功能，D正确。]
8．D　[荧光强度不再变化可能是因为荧光探针或原料等消耗尽，若为前者，此后PCR反应仍在进行，D错误。]
9．C　[①过程构建的表达载体含有组织特异性启动子，即RNA聚合酶的结合部位，A正确；②过程为核移植，通常在显微镜下进行去核、注入等操作，B正确；该过程培养的山羊只有乳腺细胞能分泌人乳铁蛋白，C错误；据题图分析可知，该过程利用了转基因、核移植和胚胎移植等工程技术，D正确。]
10．D　[据题图可知，中间载体P和载体E均含有限制酶XhoⅠ和PstⅠ的识别序列，故可选用限制酶XhoⅠ和PstⅠ切割载体P，载体P的这两种酶识别序列之间含有EcoRⅤ识别位点，并且其切割的产物为平末端，可以用于连接目的基因，A正确；受体细胞表现出抗性基因的相应性状，也可能是导入了空质粒(不含目的基因的质粒)，D错误。]
11．D　[蛋白质结构的多样性决定蛋白质功能的多样性，在实施蛋白质工程的准备阶段，收集大量的蛋白质分子结构的信息，分析某一结构与预期的蛋白质功能之间的关系，从而据其构建出某一段氨基酸序列，此氨基酸序列成为构建脱氧核苷酸序列(即基因)的依据，A、B正确；T4溶菌酶是蛋白质，对其改造属于蛋白质工程，C正确；在蛋白质工程中，基因改造后可以表达出改造的蛋白质，也可以制造出新的蛋白质，D错误。]
12．D　[重组质粒中的LacZ基因已被破坏，所以，在加入新霉素的培养基中应选择呈白色的菌落选育工程菌株，D错误。]
13．(1)Ca2＋　(2)侵染菊花(或植物)细胞，并将T－DNA转移至受体细胞　染色体DNA　
(3)卡那霉素　(4)抗虫基因(目的基因)　转基因菊花的DNA　(5)①非转基因菊花嫩茎及叶片与人工饲料混合物　②实验组与对照组死亡率
解析　(2)根据农杆菌的Ti质粒中的T－DNA可以整合到受体细胞的染色体DNA上的特点，通常用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞。(3)基因表达载体的构建中，需要标记基因，根据题意可知，该标记基因为卡那霉素抗性基因，因此需要在加入卡那霉素的培养基中选择出成功转入目的基因的菊花。(5)实验设计应遵循对照原则，因此对照组应该加入非转基因菊花嫩茎及叶片与人工饲料混合物；根据实验组比对照组的死亡率高，说明转基因菊花对菊天牛2龄幼虫有较强的毒杀作用。
14．(1)5′　乙　(2)MfeⅠ、HindⅢ　　EcoRⅠ、HindⅢ　(3)氨苄青霉素　含普通质粒的受体细胞在该培养基中也能正常生长　(4)引物①和引物④　5′　可以防止载体和目的基因的自身环化以及目的基因与载体的反向连接
解析　(2)图中THP9基因转录方向为从左往右，即启动子位于左端，终止子位于右端，因为该基因下游只有一个酶切位点，故一定用HindⅢ切割质粒和目的基因，对于质粒来说，不能用EcoRⅠ进行切割(含两个切割位点，会切掉外源基因的终止子)，不能用BamHⅠ切割(会破坏启动子)，所以应使用限制酶MfeⅠ、HindⅢ切割图1中质粒，而目的基因不能用限制酶MfeⅠ切割，与MfeⅠ能形成相同黏性末端的是EcoRⅠ，故用EcoRⅠ、HindⅢ切割含THP9基因的DNA片段。
15．(1)DNA半保留复制　耐高温的DNA聚合酶(或TaqDNA聚合酶)　引物　(2)蛋白质空间结构较为复杂，对其直接改造难以操作；直接改造蛋白质不能遗传，改造基因能遗传　能生产出自然界不存在的蛋白质　蛋白质工程
(3)农杆菌转化法　植物细胞具有全能性

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