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第一章 发酵工程
第二节 微生物的培养技术及应用
人教版（2019）选择性必修三
（一）微生物的基本培养技术
学习目标
1.掌握通过配制培养基，了解配制培养基的基本步骤，以及培养基中各类营养物质的配比。(生命观念)
2.通过对培养皿和培养基进行灭菌，了解消毒和灭菌的原理及方法。（科学思维、科学探究）
3.通过对酵母菌进行纯培养，理解并掌握微生物接种、分离和培养的基本原理和过程。(社会责任)
课前导入
向经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的细菌，再经过发酵就可以制成酸奶，由于制作工艺并不复杂，一些人会在家里自制酸奶，自制酸奶虽然方便，但是食用自制酸奶导致肠胃不适的事件屡见不鲜，主要原因是在制作过程中有杂菌混入。
怎样才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物中呢？
应该先对制作用具和原料进行灭菌处理，再接种纯的菌种，并控制发酵条件，避免杂菌进入
这需要应用无菌技术和微生物的培养技术
一、培养基的配制
1.培养基概念：
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
2.作用：
用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
无有 凝固剂琼脂
液体培养基
3.种类：
固体培养基
半固体培养基
扩大培养、工业生产
微生物的分离与鉴定，活菌计数，保藏菌种
观察微生物的运动、分类鉴定
一、培养基的配制
4.培养基的基本成分
基本成分：
碳源
氮源
水
无机盐
——水是微生物生长和代谢必不可少的营养物质。
NaCl、 K2HPO4、MgSO4等
——调节酸碱平衡、 维持渗透压
提供碳元素的物质
提供氮元素的物质
是微生物合成各有机物所必需的
除上述营养物质外，培养基是否还需要其他物质呢？
表1-1 1000mL牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成
注：牛肉膏和蛋白胨来源于动物，含有糖、维生素和蛋白质等营养物质。
基本成分：
碳源、氮源、水、无机盐
还需满足微生物对 pH、特殊营养物质、O2 的需求。
乳酸杆菌
霉菌
细菌
厌氧微生物
特殊营养物质：
维生素、氨基酸、生长因子等
培养基中添加维生素
培养基pH调至酸性
提供无氧的条件
培养基pH调至中性或弱碱性
组分 含量 提供的主要营养物质
牛肉膏 5g 碳源、磷酸盐和维生素等
蛋白胨 10g 氮源和维生素等
NaCl 5g 无机盐
H2O 定容至1000mL 水
4.培养基的基本成分
一、培养基的配制
微生物接种操作时为什么要“全副武装”和在专门的设备内进行？
获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染。
二、无菌技术
1.无菌技术：在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。
2.方法：
①消毒
②灭菌
二、无菌技术
3.无菌操作的对象：
①实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒
② 培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌
无菌操作过程中，应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。实验操作应在超净工作台并在酒精灯火焰附近进行。
消毒
使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。
煮沸消毒法
巴氏消毒法
化学药物消毒法
紫外线消毒
100℃煮沸5～6min。
可杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢。
62～65℃煮30min或80～90℃下处理0.5～1min。可杀死绝大部分微生物，不破坏食物的营养成分。
用70%酒精擦拭双手、
用氯气消毒水源等。
对接种室、接种箱或超净工作台用紫外线照射30min，以杀死物体表面或空气中的微生物。
二、无菌技术
灭菌
湿热灭菌
干热灭菌
灼烧灭菌
高压蒸汽灭菌锅
干热灭菌箱
接种环灼烧灭菌
注意：
①使用前必须先把锅内的水加热煮沸，将锅内冷空气排尽，才能达到预设的压力和温度。
②灭菌完成时，待锅内压力自然降到０时，再打开气阀。
无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？
还能有效避免操作者自身被微生物感染！！
用强烈的理化方法杀死物体内外的所有的微生物，包括芽孢和孢子。
二、无菌技术
二、无菌技术
项目 主要方法 应用范围
消毒 巴氏消毒法 ℃消毒30min 或 ℃处理15s 或 ℃处理10～15s 、啤酒、果酒和酱油等不耐高温的液体
煮沸消毒法 100℃煮沸 min 家庭餐具等生活用品
紫外线消毒 30W紫外灯照射 min (损伤细菌的DNA)
化学药物消毒 擦拭实验者双手
水源
牛奶
63～65
72～76
5～6
30
体积分数为70%～75%的酒精
氯气
接种室、接种箱或超净工作台
80～85
二、无菌技术
项目 主要方法 应用范围
灭菌 灼烧灭菌 直接在酒精灯火焰的 层灼烧
干热灭菌 干热灭菌箱中， ℃的热空气中维持 。
高压蒸汽灭菌 (湿热灭菌)
充分燃烧
接种工具，如涂布器、接种环、接种针或其他金属用具、试管口或瓶口等
160～170
1～2h
100 kPa、121 ℃的条件下，维持15～30 min
培养基等
耐高温的、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿、金属用具等
二、无菌技术
比较消毒和灭菌对微生物作用效果的差异
比较项 理化因素的作用强度 消灭微生物的数量 芽孢和孢子能否被消灭
消毒
灭菌
较为温和
部分微生物
一般不能
强烈
全部微生物
能
三、微生物的纯培养
微生物在固体培养基表面或内部生长，可以形成肉眼可见的菌落
菌落：是指由单个微生物细胞在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度，形成以母细胞为中心的一团肉眼可见的、有一定形态、构造等特征的子细胞集团。
念珠菌
霉菌
酵母菌
放线菌
形状、大小、光泽度、颜色、透明度等。
强调：不同种类微生物的菌落特征各有特点,但彼此之间存在一定的相似性;
同种微生物的菌落特征受培养时间、营养物质的含量与种类等影响也会有所差异。
菌落是鉴定菌种的重要依据
三、微生物的纯培养
（2）纯培养物：
（3）纯培养：
（1）培养物：
在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含有特定种类微生物的群体称为培养物。
由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物。
获得纯培养物的过程就是纯培养。
配制培养基
灭菌
接种
分离
培养
1.概念：
2.纯培养的步骤：
三、微生物的纯培养
3.酵母菌的纯培养
（1）实验原理
①分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。
念珠菌显色培养基
大肠杆菌培养基
酵母菌培养基
金黄色葡萄球菌和枯草杆菌培养基
注：菌落的大小、形状、颜色、透明度、光泽度等是鉴定菌种的重要依据。
三、微生物的纯培养
3.酵母菌的纯培养
（2）获得单菌落的方法：
平板划线法、稀释涂布平板法
平板划线法
稀释涂布平板法
三、微生物的纯培养
3.酵母菌的纯培养
（3）方法步骤：
①配制培养基
三、微生物的纯培养
3.酵母菌的纯培养
（3）方法步骤：
②灭菌
三、微生物的纯培养
3.酵母菌的纯培养
（3）方法步骤：
③倒平板：
注意：
①温度：50℃左右
②操作：在酒精灯火焰附近
③冷凝后平板倒置
防止瓶口微生物污染培养基
防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染
温度过高容易烫伤，低于50℃琼脂会凝固
避免杂菌污染。
三、微生物的纯培养
（3）方法步骤：
3.酵母菌的纯培养
④接种和分离酵母菌：
通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。经过数次划线后培养，可以分离到单菌落。
接种环
连续划线法
分区划线法
三、微生物的纯培养
3.酵母菌的纯培养
（3）方法步骤：
④接种和分离酵母菌：
平板划线法
①灼烧接种环，直至接种环金属丝烧红
⑥在火焰附近将皿盖打开一条缝隙，将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划3-5条平行线，盖上皿盖。
⑤试管口通过火焰，并塞上棉塞
②在火焰旁冷却接种环，拔出酵母菌培养液试管的棉塞
③试管口通过火焰
④在火焰附近用接种环蘸取一环菌液
⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。
划3个平板（重复实验）；1个不划线（空白对照）
三、微生物的纯培养
3.酵母菌的纯培养
（3）方法步骤：
④接种和分离酵母菌：
a.接种环只蘸一次菌液，但要在培养基不同位置连续划线多次；
b.划线首尾不能相接；
c.每次划线前灼烧接种环进行灭菌；
d.划线操作结束后，仍需灼烧接种环。
1
2
3
4
5
三、微生物的纯培养
3.酵母菌的纯培养
（3）方法步骤：
⑤培养酵母菌：
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右（培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异）的恒温培养箱中培养24～48h。
警示：在实验室中，切不可吃东西、喝水，离开实验室时一定要洗手，以防止被微生物感染。使用后的培养基在丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。
对照：说明培养基是否被杂菌污染
结果分析与评价
三、微生物的纯培养
3.酵母菌的纯培养
（4）结果分析与评价：
①在未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有，说明了什么？
未接种的培养基表面若有菌落生长，则说明培养基被污染或灭菌不彻底；若无，则说明培养基未被污染且已彻底灭菌，培养基可以使用
②你是如何记录实验结果的？
提示（可以在培养12h和24h后，观察菌落的大小、形状、颜色。培养24h后，菌落的大小、形状是否发生变化，菌落颜色是否加深，光泽度是否增加，等等）
三、微生物的纯培养
3.酵母菌的纯培养
（4）结果分析与评价：
③在接种酵母菌的培养基上，你是否观察到了单菌落？这些菌落的颜色、形状和大小是否一致？如果你观察到了不同形态的菌落，你能分析出可能是由哪些原因引起的吗？
在接种酵母菌的培养基上可观察到单菌落。如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合酵母菌菌落的特点， 则说明纯化酵母菌的操作成功；如果培养基上出现了其他形态的菌落，则说明在纯化过程中，无菌操作还未达到要求，可能所用菌液不纯，或者在实验操作过程中被杂菌污染
思维训练：评估论点的可信程度
有人说：吃水果“酵素”可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力。这一论点是否可信？
“酵素”制作就是利用微生物进行无氧呼吸的原理，进行像制作泡菜一样的发酵。这样制作的“酵素”中可能有糖类(包括一些简单的糖和膳食纤维等)、蛋白质(包括多种酶)、有机酸等成分，不存在它独有的、特殊的营养物质,其中其至可能含有微生物发酵产生的有毒物质，食用后可能会危害人体健康。因此，吃水果“酵素”可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力的论点是值得怀疑的。
知识总结
微生物的基本培养技术
无菌技术
煮沸消毒法
纯培养
培养基
固体培养基
接种分离
平板划线法
稀释涂布平板法
种类
液体培养基
营养
水、碳源、氮源、无机盐
消毒
巴氏消毒法
灭菌
湿热灭菌
干热灭菌
灼烧灭菌
课堂小测
1.下列有关培养基的叙述，错误的是( )
A.液体培养基要制成固体培养基，可在培养基中加入琼脂
B.细菌在固体培养基上生长，可以形成肉眼可见的菌落
C.每种培养基都含有水、碳源、氮源、无机盐等营养物质
D.培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质及O2的要求
C
解析：琼脂是凝固剂，所以液体培养基要制成固体培养基，可在培养基中加入琼脂，A正确；细菌在固体培养基上生长，可以形成肉眼可见的菌落，B正确；不同的微生物对营养物质的需求不同，如培养硝化细菌不需要加入碳源，培养固氮微生物不需要加入氮源，C错误；培养基还需满足微生物对pH、特殊营养物质及O2的要求，D正确。故选C。
课堂小测
2.培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手、空气、牛奶，上述内容所采用的灭菌或消毒方法依次是( )
①化学药物消毒 ②灼烧灭菌 ③干热灭菌
④紫外线消毒 ⑤高压蒸汽灭菌 ⑥巴氏消毒法
A.⑤②③①④⑥ B.③④②①⑥⑤ C.⑤③②①④⑥ D.⑥②③④①⑤
C
解析：培养基需用湿热灭菌（高压蒸汽灭菌）；培养皿能耐高温，需用干热灭菌；接种环可用灼烧灭菌达到迅速彻底的灭菌效果；实验操作者的双手可用化学药剂进行消毒，如用酒精擦拭双手；空气可用紫外线消毒；为不破坏其营养成分，对牛奶可采用巴氏消毒法。故选C。
课堂小测
3.在分离、纯化细菌的实验中，划线接种（甲）、培养结果（乙）如下图，a、b、c、d是划线的四个区域。下列叙述错误的是( )
A.连续划线的目的是获得由单个细菌形成的单菌落
B.蘸取菌液和划线要在酒精灯火焰旁进行
C.甲图中的a区域为划线的起始区域
D.接种过程中至少需要对接种环灼烧5次
D
解析：制酱要用到霉菌，A正确。利用酵母菌发酵可以蒸馒头，B正确。用醋酸菌制作米醋，泡菜要用乳酸菌，C错误。用乳酸菌制作酸奶，乳酸菌是一种厌氧菌在无氧的条件下，乳酸菌能将牛奶中的乳糖分解为乳酸而使牛奶变成酸奶，D正确。
课堂小测
4.下列关于微生物纯化培养的叙述，正确的是( )
A.用稀释涂布平板法统计的样品活菌数目往往比实际数目多
B.用平板划线法时，每次划线后都需要重新灼烧接种环
C.在培养细菌时，一般需要将培养基调至中性或者弱酸性
D.涂布平板时应先将培养皿盖置于实验操作台上
B
解析：用稀释涂布平板法统计的样品活菌数目往往比实际数目少，A错误；用平板划线法时，每次划线后都需要重新灼烧接种环，B正确；在培养细菌时，一般需要将培养基调至中性或者弱碱性，C错误；涂布平板时应将培养皿盖打开一条缝隙，不能完全打开，D错误。故选B。
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