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第一章 发酵工程
第二节 微生物的培养技术及应用
人教版（2019）选择性必修三
（二）微生物的选择培养和计数
学习目标
1.过分析选择培养的原理，形成生物与环境相适应的观点。(生命观念)
2.通过归纳总结微生物的分离及计数的常用方法，培养归纳与概括、分析与综合的科学方法。（科学思维）
3.运用微生物分离及计数的常用方法，设计从土壤中分离分解尿素的细菌并进行计数的实验方案。(社会责任)
4.运用微生物的选择培养与计数的方法，解决生产生活中的相关问题。(社会责任)
课前导入
自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，更难实现。那么我们又如何达成这一目标呢？
一、选择培养基
1.自然界中目的菌的筛选
(1)实例：聚合酶链式反应(PCR)中用到的耐高温的DNA聚合酶，就是从热泉中筛选出来的　　　　　　中提取出来的。
(2)依据：水生栖热菌能在　　　 　　的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
水生栖热菌
70～80 ℃
那么，如何从众多的微生物中筛选出单一菌种？
启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
一、选择培养基
2.实验室中目的菌的筛选
(1)原理：人为提供有利于　　　　　生长的条件(包括营养、温度和pH等)，同时　　　 　　其他微生物的生长。
(2)方法：利用选择培养基分离。
选择培养基：允许　　　　　 的微生物生长，同时　　　　　 　其他种类微生物生长的培养基。
目的菌
抑制或阻止
特定种类
抑制或阻止
一、选择培养基
2.选择培养基
（1）概念：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。
（2）举例：
①加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌；
②缺乏氮源的培养基，可分离自生固氮微生物；
③缺乏有机碳源的培养基，可分离自养微生物；
④石油为唯一碳源的培养基，分离出能降解石油的微生物；
⑤高盐培养基，可分离耐盐微生物。
一、选择培养基
尿素施入土壤后，会被某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。这些细菌能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。通常1g土壤中有几亿到几百亿个土壤微生物，其中细菌的数量最多，能分解尿素的细菌只是其中的一部分。
结合材料思考
1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
在选择培养基中，以尿素作为唯一氮源，只有能合成脲酶的细菌才能生长发育繁殖。
一、选择培养基
尿素施入土壤后，会被某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。这些细菌能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。通常1g土壤中有几亿到几百亿个土壤微生物，其中细菌的数量最多，能分解尿素的细菌只是其中的一部分。
结合材料思考
2.怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？
应该设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照，若对照培养基中生长的菌落数多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。
二、微生物的选择培养
1.选择培养基的作用：
分离并计数某种微生物的数量（例如，能分解尿素的细菌）。
2.微生物选择培养获取纯培养物的方法：
由于土壤中细菌的数量庞大，要想得到能分解尿素的细菌的纯培养物，必须要对土样进行充分稀释，然后再将菌液涂布到制备好的培养基上，也就是要采用稀释涂布平板法。
选择培养基
+
稀释涂布平板
单菌落
二、微生物的选择培养
3.稀释涂布平板法的操作过程：
梯度稀释+涂布平板
①铲取土壤，将样品装入纸袋中。
②将10g土壤加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的是试管中，依次等比稀释。
1mL
1ⅹ107
1ⅹ105
1ⅹ106
1ⅹ103
1ⅹ102
1ⅹ104
1mL
1mL
1mL
1mL
9mL无菌水
1mL
1mL
90mL无菌水
10g
依次稀释10倍
二、微生物的选择培养
3.取0.1mL菌液， 加到培养基表面。
4.将涂布器 在盛有酒精的烧杯中。
5.将涂布器放在火焰上 ，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
6.用涂布器将菌液均匀地 在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
滴
浸
涂布
灼烧
二、微生物的选择培养
4.培养：
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30-37℃的温度下培养1-2d。在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落。
二、微生物的选择培养
与平板划线法相比，为什么稀释涂布平板法可以用于细菌的计数？
平板划线法最开始的划线很可能菌类会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环的时候也会杀死一部分菌类。
二、微生物的选择培养
注意事项三
注意事项四
注意事项一
注意事项二
涂布器从酒精中取出时要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
过程中所有操作都应在酒精灯火焰旁进行
10g土样加入盛有90mL无菌水中后，已稀释10倍，在计算时，不要忽略。
由于使用的是选择培养基，所以一般情况下，获得的单菌落即目的菌，但因为有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖，所以还需要进一步验证。
三、微生物的数量测定
①分离微生物
②统计样品中活菌的数目
1.稀释涂布平板法
②计数原则：
①原理：
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个______。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少______。
活菌
活菌
选择30-300个菌落的平板进行计数；
每个稀释度至少取3个平板取其平均值；
统计的结果一般用菌落数而不是活菌数；
统计的菌落往往比活菌的实际数目低；
恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。
因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
三、微生物的数量测定
M：代表稀释倍数；
C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；
V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)
4号试管的结果表明每克土壤中的活菌数约为________个
③ 计算公式：
每g样品中的菌落数＝(C÷V)×M
1.1×108
——间接计数法
1.稀释涂布平板法
三、微生物的数量测定
常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数
利用特定的____________或 ______________在________下观察、计数，然后再计算 __________的样品中微生物的数量；
①原理：
细菌计数板
血细胞计数板
显微镜
一定体积
②优点：
③缺点：
快速、直观
①不能区分死菌和活菌→偏大
②不适于对运动细菌的计数。
③个体小的细菌在显微镜下难以观察。
台盼蓝染液染色，可以通过统计无色细胞的个数来对活菌进行计数。
对细菌等较小的细胞进行观察和计数
2.显微镜直接计数法
——直接计数法
三、微生物的数量测定
计数区
放大后的计数室
④计数方法：
每毫升原液所含细菌数＝
每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数
2.显微镜直接计数法
——直接计数法
三、微生物的数量测定
3.比较稀释涂布平板法和显微镜直接计数法
项目 显微镜直接计数法 稀释涂布平板法
主要用具 显微镜、_____________ 　　　　　　 等 培养基等
计数依据 菌株本身 培养基上的　 　数
优点 计数方便、操作简单 计数的都是活菌
缺点 死菌、活菌都计数在内 操作复杂、有一定误差
血细胞计数板
或细菌计数板
菌落
探究·实践——土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
探究实践
实验目的
（1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌
（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌
实验原理
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
探究·实践——土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1.提出问题：
（1）土壤中含有能分解尿素的细菌，我们如何分离它们？
（2）每克土壤样品究竟含有多少这样的细菌？
利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以分离。
2.做出假设：
3.实验原理：
土壤
取样
制备
培养基
样品稀释
与取样涂布
微生物的
培养与观察
菌落计数
4.实验步骤：
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
探究·实践——土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
探究·实践——土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
操作提示：
①无菌操作:
②做好标记:
③规划时间:
本实验使用的平板和试管较多，为避免混淆，最好在使用前做好标记。
对于耗时较长的生物实验，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。
如
在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。
取土样的用具在使用前都需要灭菌。
探究·实践——土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
5.结果分析与评价：
①结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落？
如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。如果接种后的完全培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。
②你是否获得了某一稀释度下菌落数 为30～300的平板？在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近？
如果得到了两个或多个菌落数为30～300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。
探究·实践——土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
5.结果分析与评价：
③你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学统计的结果接近吗？如果差异很大，可能是什么原因引起的？
如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因
得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？
探究·实践——土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
6.进一步探究——分解尿素细菌的进一步鉴定
本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌,对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。你可以查阅相关资料,进一步设计实验来鉴定自己分离的菌种。
需要用“鉴别培养基”
①原理：
细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌。
CO(NH2)2 + H2O 2NH3 + CO2
脲酶
呈碱性，遇酚红指示剂呈红色。
探究·实践——土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
6.进一步探究——分解尿素细菌的进一步鉴定
②方法：
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红：
可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。
液体培养基：
可以直接看液体的变色情况。
固体培养基：
探究·实践——土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
6.进一步探究——分解尿素细菌的进一步鉴定
鉴别培养基：在培养基中加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应。从而达到鉴定的作用。
伊红和美蓝培养基鉴别大肠杆菌
刚果红培养基鉴别纤维素分解菌
项目 选择培养基 鉴别培养基
原理 加入不影响甚至促进目标微生物生长，而抑制或阻止其他种类微生物生长的化学物质 加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应
用途 培养、分离出目标微生物 鉴别目标微生物
举例 培养酵母菌和霉菌时，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌的生长；利用以尿素为唯一氮源的培养基来培养可分解尿素的细菌 可用伊红美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否含有大肠杆菌(若有，则菌落呈黑色)
图示
尿素分解菌
大肠杆菌
知识总结
微生物的选择培养
选择培养基
（和鉴别培养基的区别？两者按照什么依据分类）
获取纯培养物的方法：
。
稀释涂布平板法（间接计数法）
培养基的制备
实验设计
分析与评价
微生物的数量测定
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
（1）土壤取样
（2）样品的稀释
（3）稀释涂布平板法接种
（4）微生物的培养与观察
稀释涂布平板法
显微镜直接计数
关键步骤
系列梯度稀释
涂布平板
微
生
物
的
选
择
培
养
和
计
数
知识总结
微生物的数量测定
选择培养基的作用
微生物选择培养获取纯培养物的方法——稀释涂布平板法
微
生
物
的
选
择
培
养
和
计
数
选择培养基
微生物的选择培养
科学实例
筛选原则
选择培养基的概念及举例
稀释涂布平板法的操作过程
间接计数法——稀释涂布平板法
直接计数——计数板计数法
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
培养基的制备
实验设计
（1）土壤取样
（2）样品的稀释
（3）稀释涂布平板法接种
（4）微生物的培养与观察
实验设计
课堂小测
1.下列关于选择培养基的叙述，错误的是( )
A.选择培养基可允许特定种类的微生物在其上生长
B.制备选择培养基时，应根据所选微生物的特点确定培养基的配方
C.筛选能分解尿素的细菌时，应以尿素作为唯一的氮源
D.与普通培养基相比，选择培养基上生长的微生物的数量一般较多
D
解析：普通培养基可满足多数微生物的生长需求，而选择培养基上只能生长特定种类的微生物，因此与普通培养基相比，选择培养基上生长的微生物的数量一般较少，D错误。
课堂小测
2.稀释涂布平板法是分离菌种常用的方法，下列相关叙述不恰当的是( )
A.倒好的平板冷却后需立即使用，以免表面干燥，影响菌种的生长
B.不同稀释度的菌液在固体培养基表面不一定都能形成单个的菌落
C.稀释涂布平板法分离到的单菌落需进一步纯化鉴定后方可用于生产应用
D.稀释涂布平板法既可用于微生物的分离，也可用于微生物的计数
A
解析：倒好的平板冷却后不一定要立即使用，未使用的平板可以冷藏保存，A错误；稀释度较低的菌液不一定能在培养基表面形成单个的菌落，B正确；稀释涂布平板法分离到的单菌落仍需进一步纯化鉴定后，才能用于生产应用或者菌种保藏，C正确；稀释涂布平板法既可用于微生物的分离，也可用于微生物的计数，D正确。
课堂小测
3.下列关于土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验的叙述，正确的是( )
A.统计菌落数应注意选择菌落数在30-100的平板进行计数
B.判断选择培养基是否起选择作用，需设置未接种的牛肉膏蛋白胨培养基作对照
C.将未接种的培养基置于恒温培养箱中培养24～48h，以检验培养基灭菌是否合格
D.以尿素为唯一氮源且加入酚红的培养基上长出的菌落周围可能会出现紫色区域
C
解析：统计菌落数应注意选择菌落数在30-300的平板进行计数，A错误；判断选择培养基是否起到选择作用，需将菌液稀释相同的倍数后接种在牛肉膏蛋白胨培养基上作为对照，若在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目明显多于选择培养基上的数目，则说明选择培养基起到了选择作用，B错误；将未接种的培养基置于恒温培养箱中培养24～48h，可以检验培养基灭菌是否合格，若灭菌合格，则培养基上应没有任何菌落出现，C正确；用以尿素为唯一氮源且加入酚红指示剂的培养基培养该细菌后能产生脲酶，使尿素分解成氨，导致酚红指示剂变红，故菌落周围可能会出现红色区域，D错误。
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