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(共32张PPT)
第3章 基因工程
第1节 重组DNA技术的基本工具
【从社会中来】
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒侵染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，运用基因工程技术进行育种，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。
转基因“华农1号”番木瓜
非转基因番木瓜
基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
（1）原理：
（2）操作水平：
（3）操作环境：
（4）操作对象：
（5）结果：
什么是基因工程？
基因重组
分子水平
生物体外
基因
赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。
【问题探究】基因工程理论基础的分析
【问题探究1】为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？
（1）DNA的基本组成单位都是 。
（2）DNA分子都遵循 配对原则。
（3）双链DNA分子的空间结构都是 。
【问题探究2】为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？
（1） 是控制生物性状的独立遗传单位。
（2）遗传信息的传递和表达都遵循 。
（3）生物界共用一套 。
四种脱氧核苷酸
规则的双螺旋结构
基因
中心法则
遗传密码
碱基互补
基因工程的操作对象为基因，而DNA双螺旋的直径只有2nm，对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。
那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？
2024/12/23
培育转基因番木瓜
“分子手术刀”
准确切割DNA分子
“分子缝合针”
“分子运输车”
将DNA片段连接起来
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞
1
一、限制性内切核酸酶
——“分子手术刀”
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
自主学习
阅读课本p71-72，
完成导学案问题
来源：主要是从__________中分离纯化出来的。
作用：
作用部位：__________，限制酶只切割两个核苷酸之间的__________。
命名原则（阅读课本）：
原核生物
识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
磷酸二酯键
磷酸二酯键
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
磷酸二酯键
动画演示
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
【思考】你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？
原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全。
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
【思考】观察下面几种限制酶的特定识别序列，它们有何特点？
EcoRⅠ
5’…G-A-A-T-T-C…3’
3’…C-T-T-A-A-G…5’
SmaⅠ
5’…C-C-C-G-G-G…3’
3’…G-G-G-C-C-C…5’
BamHⅠ
5’…G-G-A-T-C-C…3’
3’…C-C-T-A-G-G…5’
TaqⅠ
5’……T-C-G-A……3’
3’……A-G-C-T……5’
5.识别序列：大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列。
黏性末端
黏性末端
（1）实例1—EcoRⅠ限制酶：EcoRⅠ识别序列为GAATTC，EcoRⅠ切割部位为GA之间的磷酸二酯键。
（2）实例2——SmaⅠ限制酶：SmaⅠ识别序列为CCCGGG，SmaⅠ切割部位为CG之间的磷酸二酯键。
形成黏性末端
平末端
形成平末端
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
6.切割结果：DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端。
动画演示
【小组合作】如图为限制酶BamH I的识别序列，每组有一环状DNA分子，一直链DNA分子，尝试用“分子手术刀”对它进行剪切
剪刀代表限制酶
纸片代表DNA片段
【思考】想要获得某个特定性状的目的基因必须用限制酶切几个切口？断几个磷酸二酯键？产生几个黏性（平）末端？
要切2个切口，断4个磷酸二酯键，产生4个黏性（平）末端？
【练习1】：写出下列限制酶切割形成的黏性末端
BamHⅠ________ EcoRⅠ________ HindⅢ________ BglⅡ________
GATC
AATT
AGCT
GATC
思考：同种限制酶切割的黏性末端一定相同吗？不同种限制酶切出的黏性末端一定不同吗？
不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端
2
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
1.作用：
2.分类：
种类 E·coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源
功能特性
相同点
自主学习
阅读课本p72，
完成导学案问题
将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。注意：不是连接氢键（氢键的形成不需要酶的催化）。
大肠杆菌
T4噬菌体
只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接具有平末端的DNA片段
既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端，又可以连接双链DNA片段的平末端（但连接平末端的效率相对较低）
恢复的都是磷酸二酯键
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
用DNA连接酶连接两个片段之间的磷酸二酯键
2024/12/23
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
2024/12/23
【新旧衔接】DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
种类 DNA聚合酶 DNA连接酶
不同点 作用实质
作用结果
模板
相同点
催化单个核苷酸加到已有核苷酸片段的3’末端的羟基上，形成磷酸二酯键
催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
催化形成与模板链互补的DNA链，形成新的双链DNA分子
催化具有互补黏性末端或平末端的DNA片段连接起来，形成重组DNA分子
需要
不需要
①化学本质都是蛋白质②都是催化形成磷酸二酯键
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
【小组合作】拿出刚才“剪开”的两段DNA片段，尝试用“分子缝合针”把它们缝合起来
胶带代表DNA连接酶
纸片代表DNA片段
3
三、基因导入受体细胞的载体——“分子运输车”
三、基因导入受体细胞的载体——“分子运输车”
自主学习
阅读课本p72，
完成导学案问题
携带目的基因导入受体细胞中，使之在受体细胞内稳定存在并表达。
载体种类：
什么是质粒？
【注意】真正被用作载体的质粒，都是经过
载体种类：
质粒、噬菌体、动植物病毒等
质粒：一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
【注意】真正被用作载体的质粒，都是经过过人工改造的。
最常用的载体——质粒
终止子: 转录的终点，在转录过程中起调控作用。
启动子: RNA聚合酶识别、结合和开始转录的序列
复制原点: DNA复制的起始位点
标记基因: 便于重组DNA的筛选与鉴定
其基因属于细胞质基因
【问题探究】分析归纳载体需要具备的条件
问题1：载体要与外源基因连接，需要具备什么条件？
问题2：要使携带的外源基因在受体细胞中稳定存在，载体需要具备什么条件？
问题3：我们用肉眼看不到载体是否进入受体细胞，为了便于筛选重组DNA分子，载体需要具备什么条件？
条件①：具有一个或多个限制酶切割位点；
条件②：能在受体细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制；
条件③：具有标记基因，便于重组DNA分子的筛选。
条件④：载体DNA必须是安全的，不会对受体细胞有害。
观察手中已连接在一起的片段，实际上你刚才就成功构建了一个重组载体！
限制酶
DNA连接酶
载体
①对受体细胞无害；
②有一个至多个限制酶切割位点；
③有特殊的标记基因；
④能自我复制或能整合到宿主DNA上。
质粒、 噬菌体、动植物病毒
小结
基因工程的基本工具
作为载体的条件
种类:
磷酸二酯键
来源：
主要来源于原核生物
特点：
作用部位：
具有专一性
结果：
形成黏性末端或平末端
连接部位：磷酸二酯键
种类： E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶
作用： 把两条双链DNA片段拼接起来
1．已知限制酶BamHI和BglⅡ的识别位点分别是-G↓GATCC-、-A↓GATCT-。下列有关说法错误的是（ ）
A．上述两种限制酶切割出的末端只能用E.coliDNA连接酶进行“缝合”
B．限制酶的识别序列可能由4个、6个、8个或其他数目的核苷酸组成
C．若用两种限制酶同时切割目的基因和质粒，可提高重组质粒构建的成功率
D．上述两种限制酶切割出的末端之间相互连接后可能不会再被两种限制酶识别
练习：
A
2．下列有关限制性核酸内切酶的说法，正确的是（　　）
A．简称限制酶，化学本质是DNA
B．一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列
C．一种限制酶能在不同的切点上切割DNA分子
D．作用位点是碱基之间的化学键
练习：
B
3．CRISPR/Cas9是一种基因编辑技术，Cas9蛋白能与人工设计的sgRNA形成复合体（如图）。利用该技术可以对DNA进行一系列的定向改造（向导RNA即sgRNA）。下列相关叙述错误的是（ ）
A．Cas9蛋白属于限制酶，能切割目的基因的特定碱基序列
B．CRISPR/Cas9系统可应用于对人类遗传病的治疗
C．向导RNA识别序列发生错配可能会导致基因被错误剪辑
D．通过基因编辑技术引起的变异属于广义的基因重组
练习：
D
4．下列有关限制酶和DNA连接酶的叙述正确的是（　　）
A．用限制酶酶切获得一个外源基因时得到两个切口，有2个磷酸二酯键被断开
B．T4DNA连接酶和E．coliDNA连接酶都能催化平末端和黏性末端的连接
C．序列—CATG↓—和—G↓GATCC—被限制酶切出的黏性末端碱基数不同
D．限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大
练习：
D
5．下列关于质粒的叙述，正确的是（　　）
A．细菌质粒的复制过程一定是在宿主细胞外独立进行的
B．质粒只有在导入宿主细胞后才能在宿主细胞内复制
C．质粒是细菌细胞质中能够自主复制的小型环状DNA分子
D．质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器
练习：
C
6．DNA连接酶是重组DNA技术中常用的一种工具酶。下列错误的是（ ）
A．T4DNA连接酶既可连接互补的黏性末端，也可以连接平末端
B．能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端
C．能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D．化学本质是蛋白质，可被蛋白酶破坏
练习：
B

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