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考向14　发酵工程
【考教衔接】
1.制作泡菜时用水密封泡菜坛的目的是　　　　　　　　　　　　　　。泡菜坛只能装八成满,原因之一是　 　。
2.培养基冷凝后,皿盖上会凝结水珠,凝固后的培养基表面的湿度也比较高,将培养皿倒置,既可以避免　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　,又可以防止　 　。
3.选择培养基是指　 。
4.用稀释涂布平板法计数时,统计的菌落数往往比活菌的实际数目少,这是因为 　。
5.判断培养基是否被杂菌污染的方法是 　。
6.在筛选纤维素分解菌时,采用　　　　染色法,当纤维素被纤维素分解菌分解后,在培养基中会　 　。
7.甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中,得到两种统计结果。回答下列问题:
(1)甲同学在该浓度下涂布了一个平板,统计的菌落数为230,该同学的统计结果是否可靠 为什么
(2)乙同学在该浓度下涂布了三个平板,统计的菌落数分别为21、212、256,该同学将21舍去,然后取平均值。该同学对实验结果的处理是否合理 为什么
(3)为什么要选取菌落数目稳定时的记录作为结果
(4)某同学在三种稀释度下分别吸取0.1 mL的菌液涂布平板,统计菌落数,得到了以下数据,试计算1 g样品的活菌数(单位:个)。
稀释度 平板
平板1 平板2 平板3
1×104 320 360 356
1×105 212 234 287
1×106 21 23 18
【考点分析】
高频考点1　传统发酵技术的应用与现代
发酵工程
真题引领1　(2024·河北高考改编)中国传统白酒多以泥窖为发酵基础,素有“千年老窖万年糟”“以窖养糟,以糟养泥”之说。多年反复利用的老窖池内壁窖泥中含有大量与酿酒相关的微生物。下列叙述错误的是()。
A.传统白酒的酿造是在以酿酒酵母为主的多种微生物共同作用下完成的
B.窖池内各种微生物形成了相对稳定的体系,使酿造过程不易被杂菌污染
C.对从窖泥中分离的酿酒酵母进行扩大培养时,需在CO2或N2环境中进行
D.从谷物原料发酵形成的酒糟中,可分离出产淀粉酶的微生物
1.在发酵过程中不同微生物分泌的酶不同,它们所发挥的作用就不同,因此传统白酒的酿造不仅需要酵母菌,还要有其他菌种。
2.酒曲中微生物(如曲霉)分泌的淀粉酶可将谷物中的淀粉转变成单糖等,从而使米酒具有甜味,在酵母菌的作用下单糖等进一步被转化产生酒精。
3.酵母菌是兼性厌氧微生物,在有氧条件下,酵母菌进行有氧呼吸,大量繁殖,把糖分解成CO2和水;在无氧条件下,酵母菌能进行酒精发酵。
真题引领2　(2024·山东高考)在发酵过程中,多个黑曲霉菌体常聚集成团形成菌球体,菌球体大小仅由菌体数量决定。黑曲霉利用糖类发酵产生柠檬酸时需要充足的氧。菌体内铵离子浓度升高时,可解除柠檬酸对其合成途径的反馈抑制。下列说法错误的是()。
A.相同菌体密度下,菌球体越大柠檬酸产生速率越慢
B.发酵中期添加一定量的硫酸铵可提高柠檬酸产量
C.发酵过程中pH下降可抑制大部分细菌的生长
D.发酵结束后,将过滤所得的固体物质进行干燥即可获得柠檬酸产品
1.发酵工程的定义:利用微生物的特定功能,规模化生产人类所需产品的综合性生物工程。发酵产品主要为微生物细胞本身或者其代谢物。
2.分离、提纯产物:若发酵产品是微生物细胞本身,则可在发酵结束后,采用过滤、沉淀等方法将菌体分离和干燥;若发酵产品是微生物细胞的代谢物,则可根据产物的性质采取适当的提取、分离和纯化措施。
真题改编1　(2023·山东高考改编)果酒、果醋等传统发酵技术在人们的日常生活中得到了广泛的应用。以下是以泡菜坛为容器制作泡菜时的4个处理:①沸盐水冷却后再倒入坛中;②盐水需要浸没全部菜料;③盖好坛盖后,向坛盖边沿的水槽中注满水;④检测泡菜中亚硝酸盐的含量。下列说法错误的是()。
A.果酒与啤酒制作都利用了酵母菌无氧呼吸产生酒精的原理
B.果醋、泡菜制作都需要控制无氧环境以促进酸性物质的产生
C.③是为了使气体只能从泡菜坛排出而不能进入
D.泡菜制作过程中需检测亚硝酸盐的含量,以便安全取食
真题改编2　(2023·河北高考改编)乳酸链球菌素(Nisin)是乳酸链球菌分泌的一种抗菌肽。研究者对Nisin发酵生产过程相关指标进行了检测,结果如图。下列叙述错误的是()。
A.发酵的中后期适量补加蔗糖溶液可促进菌体生长
B.Nisin发酵过程中发酵罐内pH会下降
C.向发酵罐内适时适量添加酸溶液可提高Nisin产量
D.发酵结束后可从发酵液中分离获得Nisin产品
高频考点2　微生物的培养技术及应用
真题引领3　(2024·黑吉辽高考改编)某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病,其筛选流程及抗性检测如图。下列操作正确的是()。
A.在大量感染香蕉枯萎病的香蕉种植园内,从感病植株上采集样品
B.将采集的样品充分消毒后,用蒸馏水冲洗,收集冲洗液进行无菌检测
C.将无菌检测合格的样品研磨,经稀释涂布平板法分离得到内生菌的单菌落
D.判断内生菌的抗性效果只需观察平板上病原菌菌斑大小即可
真题改编3　(2023·山东高考改编)平板接种常用在微生物培养中。下列说法正确的是()。
A.分离并纯化硝化细菌时,培养基中无须添加氮源
B.平板划线时接种环使用前要消毒,随后的每次划线后都要灭菌
C.空白平板使用前需进行无菌鉴定,接种后未长出菌落的培养基可以直接丢弃
D.稀释涂布平板法可用于统计样品中的活菌数
真题改编4(2023·广东高考改编)研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌。根据堆肥温度变化曲线(如图)和选择培养基筛选原理来判断,下列相关分析错误的是()。
A.可使用以角蛋白为唯一氮源的选择培养基筛选该嗜热菌
B.在c点时进行取样,更容易获得所需菌种
C.随着时间的推移,堆肥温度逐渐升高是微生物的呼吸作用导致的
D.对取样获得的原液进行适当稀释后进行平板划线可分离该微生物
【最新模拟】
(1~9,每题3分,第10题13分,共40分)
1.很多生活实例中蕴含着生物学原理,下列实例和生物学原理对应不正确的是()。
A.长时间存放的剩菜一般不宜食用——剩菜中的硝酸盐会被微生物还原成亚硝酸盐,危害人体健康
B.夏天开瓶后的红酒容易变酸——醋酸菌将乙醇变成乙醛,再将乙醛变为乙酸
C.用巴氏消毒法对牛奶消毒——既杀死牛奶中的微生物,又不破坏牛奶中的营养成分
D.泡菜坛内有时会长一层白膜——大量乳酸菌聚集在发酵液表面形成一层白膜
2.利用发酵工程生产蓝莓酒需经过“清洗、破碎→酶解→过滤→调整成分→接种→主发酵→倒灌过滤→后发酵→消毒→终止”等主要环节。下列叙述正确的是()。
A.酶解环节需要添加胰蛋白酶和纤维素酶并控制酶解温度
B.在蓝莓酒发酵旺盛时,醋酸菌能将果汁中的糖发酵为乙酸
C.若发酵装置中初始糖浓度过高,所制得的蓝莓酒酒精浓度反而偏低
D.后发酵时需搅拌处理,以便菌种充分接触营养物质并增加溶解氧的含量
3.鲁菜是中国八大菜系之一,其十分讲究配料和调料的搭配,烹饪中常使用酱油、腐乳、味精、白酒、醋和泡菜进行调味。下列说法正确的是()。
A.白酒、味精和醋发酵生产过程中所需要的微生物均为真核生物
B.在发酵生产酱油的过程中,蛋白质被分解为小分子肽和氨基酸
C.腐乳发酵过程中起主要作用的微生物是黑曲霉
D.泡菜发酵后期,尽管乳酸菌占优势,但仍有产气菌繁殖,需开盖放气
4.亚硒酸钠对细菌的生长有明显的毒害作用,土壤中的富硒细菌可将其还原为红色单质硒,下图表示土壤中富硒细菌的筛选和纯化过程,①~⑤为相应步骤。下列相关叙述错误的是()。
A.培养富硒细菌时,培养基应调至酸性并添加维生素
B.步骤②中可将10 mL菌液加入90 mL无菌水中,得到稀释10倍的稀释液
C.步骤④中可以根据菌落周围是否出现红色区域对目的菌株进行筛选
D.随机取若干灭菌的空白平板培养一段时间,可检测培养基灭菌是否合格
5.烟草的多糖含量偏高是造成烟叶原料品质不高的重要因素,微生物在烟叶醇化阶段可有效降低烟草的多糖含量。为提高烟叶质量,科研人员筛选出S1~S5微生物菌株,并测定其相关酶活力,结果如图所示。下列说法正确的是()。
A.筛选获得S1~S5微生物菌株时,应以淀粉为唯一碳源
B.用平板划线法分离单菌落前需对培养液进行稀释
C.用S1单菌落培养获得的纯培养物对烟叶进行醇化的效果最好
D.烟叶醇化发酵应在低温下进行,以抑制杂菌繁殖
6.谷氨酰胺酶(PG酶)是一种催化L-β-谷氨酰胺水解成L-谷氨酸和氨的酶,能增大蛋白质的溶解性,提高食品工业中蛋白质的利用率。研究人员以谷氨酰胺—甘氨酸(遇热易分解)为唯一氮源,从土壤中筛选产PG酶的金黄杆菌,实验过程如下图。下列有关叙述错误的是()。
A.经过程③接种后的培养皿不能立即倒置
B.培养基Ⅱ可用于土壤中能产生PG酶的金黄杆菌的分离
C.培养基Ⅲ可用于金黄杆菌的发酵培养以获得PG酶
D.对培养基Ⅰ进行灭菌时应选择高压蒸汽灭菌法
7.(原创)微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到后代的过程,称为纯培养。发酵是指人们借助微生物来制备微生物细胞本身或获得其直接代谢物或次级代谢物的过程,通常可分为混合发酵和纯种发酵,前者是指以成分复杂的谷物等为原料,有多种微生物分泌的酶系参与,将原料成分转化成多种具有不同风味的营养物质的过程;后者是指仅接入一种微生物,通过对该微生物的培养,得到纯度较高的单一性产物的过程。下列叙述错误的是()。
A.灭菌和分离是纯培养成功的重要措施
B.生产抗生素的过程为纯种发酵
C.混合发酵属于传统发酵,酱油、腐乳等的生产过程为混合发酵
D.酵母菌的纯培养只能用平板划线法,不能用稀释涂布平板法
8.(改编)研究人员为分离出产酒精能力强的酵母菌菌株,进行了如下图所示的实验,甲、乙、丙、丁锥形瓶内分别加入100 mL完全培养基。下列相关叙述正确的是()。
A.过程②涂布器蘸取酒精后立即置于酒精灯火焰上灼烧,以防酒精挥发
B.根据涂布后菌落的数目计算出葡萄酒过滤液的酵母菌密度约为6.8×109个/L
C.后续还需对甲、乙、丙、丁瓶中的酒精浓度和活菌数量进行检测
D.分离出的优质酵母菌菌株可用于白酒酿造,能耐受酒精度40% vol以上的发酵液
9.(改编)纤维素酶能分解秸秆生产酒精,在牛的瘤胃中可以分离纤维素分解菌,相关筛选过程如图1所示。已知刚果红可以与纤维素反应形成红色复合物,将分离出来的菌落在刚果红培养基平板上进行筛选,筛选结果如图2所示。下列叙述错误的是()。
A.该过程分离出来的纤维素分解菌为厌氧菌,因此培养基表面加入一层石蜡
B.甲、乙、丙培养基中只有乙培养基为选择培养基,以纤维素作为唯一碳源
C.透明圈出现的原因是纤维素被分解,菌落周围不能形成红色复合物
D.菌落①的纤维素分解菌比菌落②③的更适用于生产实践
10.(13分)(原创)塑料(聚乙烯)因其经济方便和稳定性好而被广泛应用,但同时也造成了严重的“白色污染”。为解决聚乙烯在自然环境中难降解的问题,科研团队致力于从土壤中分离出能高效降解聚乙烯的菌株用于塑料生物降解的研究。聚乙烯降解菌的分离、筛选主要包括以下步骤:
回答下列问题:
(1)本实验取样地的特点是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。土壤是微生物的大本营,土壤环境能为微生物提供　　　　　　　　　　等营养成分。大多数微生物培养中,为了获得纯培养物,通常利用　　　　　　　　　　　　　　　　法将菌种接种在固体培养基上,培养获得　　　　后,再接种到特定液体培养基中扩大培养,而为了从土壤中分离出聚乙烯降解菌,可以将制备的土壤悬液进行富集培养。
(2)图中的物质A为　　　　　　　,物质B为　　　　　　　　,必须加入物质B的原因是　 　。
(3)图中分离聚乙烯降解菌时,在选择培养基上进行连续划线,则连续划线时需要注意 　(答出三点)。
(4)上述过程必须严格无菌操作,培养基无菌处理的方法是　　　　　　　　,培养皿、锥形瓶无菌处理的方法是　。
参考答案
1.隔绝空气　装完菜料后还需要加入冷却好的盐水,留有一定空间,便于盐水没过全部菜料
2.培养基表面的水分过快地挥发　皿盖上的水珠落入培养基,造成污染
3.在微生物学中允许特定种类的微生物生长,同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基
4.当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落
5.设置未接种(或接种等量无菌水)的培养基作为空白对照
6.刚果红　出现以纤维素分解菌为中心的透明圈
7.(1)不可靠。为增强实验的说服力与准确性,应设置重复实验,在同一稀释度下涂布至少3个平板,统计结果后计算平均值。　(2)不合理。在进行微生物计数时,如果实验中出现重复实验结果相差很大的情况,应分析实验过程中可能的影响因素,找出结果相差很大的原因,再重新实验,而不能简单地舍弃相差大的结果。　(3)尽量缩小统计的菌落数与实际活菌数之间的差异,因为繁殖慢的菌体起初难以形成明显的菌落,从而可能影响统计结果的准确性。　(4)稀释度为1×105时,涂布的三个平板上的菌落数在30~300,计算其平均值,即(212+234+287)÷3≈244,则1 g样品中活菌数约为244÷0.1×105=2.44×108个。
真题引领1　C　解析　白酒的酿造主要依靠酿酒酵母,由于窖泥中含有大量与酿酒相关的微生物,故传统白酒的酿造是在以酿酒酵母为主的多种微生物共同作用下完成的,A正确;窖池内各种微生物形成了相对稳定的体系,且酿造过程产生的酒精也会抑制杂菌的生长与繁殖,使酿造过程不易被杂菌污染,B正确;酵母菌是兼性厌氧微生物,与无氧呼吸相比,细胞有氧呼吸产生的能量更多,更能满足酵母菌大量繁殖时的需求,因此,对分离的酿酒酵母进行扩大培养时,需要在有氧的条件下进行,C错误;谷物原料如高粱、玉米、大米等富含淀粉,因此从谷物原料发酵形成的酒糟中可分离出产淀粉酶的微生物,D正确。
真题引领2　D　解析　黑曲霉利用糖类发酵产生柠檬酸时需要充足的氧,相同菌体密度下,菌球体越大,越不利于菌体与氧气接触,柠檬酸产生速率就越慢,A正确;菌体内铵离子浓度升高时,可解除柠檬酸对其合成途径的反馈抑制,因此发酵中期添加一定量的硫酸铵,提高菌体内铵离子浓度,可提高柠檬酸产量,B正确;发酵过程中pH下降会导致细菌生命活动所必需的酶活性降低或失活,可抑制大部分细菌的生长,C正确;发酵结束后,将过滤所得的固体物质进行分离、纯化、浓缩、干燥等一系列操作后才能获得柠檬酸产品,D错误。
真题改编1　B　解析　醋酸菌是好氧细菌,制作果醋不需要控制无氧环境,B错误。
真题改编2　C　解析　蔗糖是乳酸链球菌的营养物质,由题图可知,随着发酵的进行,发酵液中蔗糖含量逐渐降低,因此发酵的中后期补加适量的蔗糖溶液利于菌体生长,A正确;Nisin发酵过程中产生乳酸,从而使发酵罐内pH下降,因此在发酵过程中向发酵罐内适时适量添加碱溶液,可以创造适于Nisin产生的pH条件,B正确,C错误;Nisin为乳酸链球菌的分泌产物,主要存在于发酵液中,发酵结束后可从发酵液中分离获得Nisin产品,D正确。
真题引领3　C　解析　由题干信息可知,某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病,故应在大量感染香蕉枯萎病的香蕉种植园内,从未感病植株上采集样品,A错误;获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染,故应将采集的样品充分消毒后,用无菌水冲洗,收集冲洗液进行无菌检测,B错误;由题图抗性检测可知,判断内生菌的抗性效果需设置对照组和实验组,对照组不接种内生菌,实验组接种内生菌,然后比较对照组和实验组的病原菌菌斑大小,实验组病原菌菌斑越小表明内生菌抗性效果越好,D错误。
真题改编3　D　解析　硝化细菌的纯化过程中需要添加氮源,A错误;平板划线时,接种环使用前必须进行灭菌,随后的每次划线后也都要进行灭菌,B错误;接种后未长出菌落的培养基需要经过高压蒸汽灭菌后才能丢弃,防止污染环境,C错误。
真题改编4　D　解析　采用平板划线法分离微生物,不需要对原液进行适当稀释,通过连续多次划线即可达到分离微生物的目的,D错误。
1.D　解析　泡菜坛内长的一层白膜是大量酵母菌聚集在发酵液表面形成的,D不正确。
2.C　解析　在酶解环节添加果胶酶和纤维素酶可以分解细胞壁,促进细胞内容物的释放,酶的活性受温度的影响,所以酶解环节需要控制酶解温度,A错误;在蓝莓酒发酵旺盛时是无氧环境,此时接种醋酸菌,无充足的氧气供应,不能将果汁中的糖发酵为乙酸,B错误;若发酵装置中初始糖浓度过高,会造成酵母菌失水,活力下降,无氧呼吸减弱,甚至大量死亡,所制得的蓝莓酒酒精浓度反而偏低,C正确;后发酵时需搅拌处理,以便菌种充分接触营养物质,但酒精发酵是在无氧条件下进行的,所以溶解氧的含量不会增加,D错误。
3.B　解析　生产味精用的菌种是谷氨酸棒状杆菌,酿醋使用的菌种是醋酸菌,这两种菌为原核生物,A错误;腐乳发酵过程中起主要作用的微生物是毛霉,C错误;乳酸菌属于厌氧菌,开盖放气会影响乳酸菌发酵,因此不能开盖放气,D错误。
4.A　解析　培养细菌时,培养基应该调至中性或弱碱性,培养某些细菌(如乳酸杆菌)时才需要在培养基中添加维生素,A错误。
5.C　解析　根据题图信息可知,科研人员筛选出的S1~S5微生物菌株均能降低烟草的多糖含量,但不能确定这些微生物是否以淀粉为碳源,A错误;用平板划线法分离单菌落时,直接使用未经稀释的微生物样本进行划线操作即可达到分离的目的,B错误;分析题图可知,S1微生物菌株相比其他四种微生物菌株的多糖酶活力更高,在降低烟草的多糖含量方面表现更优,故用S1单菌落培养获得的纯培养物对烟叶的醇化效果最好,C正确;酶催化化学反应需要适宜的温度,烟叶醇化发酵应在适宜的温度下进行,D错误。
6.D　解析　如果接种后立即将培养皿倒置,可能会造成培养液滴落,所以为防止培养液滴落,接种后的培养皿不能立即倒置,A正确;分析题图可知,培养基Ⅱ是固体培养基,可用于土壤中能产生PG酶的金黄杆菌的分离,B正确;培养基Ⅲ是液体培养基,可用于金黄杆菌的发酵培养以获得PG酶,C正确;谷氨酰胺—甘氨酸遇热易分解,对培养基Ⅰ进行灭菌时温度不宜过高,不能选择高压蒸汽灭菌法,D错误。
7.D　解析　酵母菌的纯培养可以用稀释涂布平板法和平板划线法,D错误。
8.C　解析　过程②涂布器蘸取酒精后应立即置于酒精灯火焰上灼烧,以防止残留酒精影响微生物生长,且应冷却后再用于涂布,A错误;用稀释涂布平板法对样品中的微生物进行计数时,需选取菌落数处于30~300的培养皿,据题图相关数据可知,葡萄酒过滤液中的菌种密度为(62+68+74)÷3÷0.1×104×103=6.8×109个/L,但该数值是1 L葡萄酒过滤液中所有菌种的数目,不只是酵母菌,B错误;分离出的优质酵母菌菌株可用于白酒酿造,还需要进一步通过实验才能确定能耐受的酒精度,D错误。
9.B　解析　甲、乙、丙培养基都是以纤维素作为唯一碳源的选择培养基,B错误;据题干信息可知,刚果红可以与纤维素反应形成红色复合物,而当纤维素被纤维素分解菌分解后,复合物就无法形成,培养基中就会出现以这些菌为中心的透明圈,C正确;纤维素分解菌能分解纤维素是因为其可以产生纤维素酶,纤维素酶的活性越高,对纤维素的分解效果越好,可通过比较以这些菌为中心的透明圈的直径与菌落直径的比值大小来判断降解纤维素的能力强弱,据图2可知,与菌落②③相比,菌落①的降解能力更强,更适用于生产实践,D正确。
10.(除标注外,每空1分,共13分)(1)聚乙烯废弃物较多(合理即可)　碳源、氮源、水和无机盐　平板划线法或稀释涂布平板　单菌落　(2)无菌水　聚乙烯(粉末)　在以聚乙烯为唯一碳源的培养基中,只有能利用聚乙烯的微生物才能生长繁殖,而其他微生物的生长繁殖则受到抑制(2分)　(3)不能划破培养基,从第一次划线的末端开始作第二次划线,划线前后要灼烧接种环,最后一次的划线不能与第一次的划线相连等(3分)　(4)湿热灭菌(或高压蒸汽灭菌)　干热灭菌
解析　(1)本实验要到聚乙烯废弃物较多的土壤中取样,该环境中聚乙烯降解菌含量较多。土壤环境能为微生物提供碳源、氮源、水和无机盐等营养成分。大多数微生物培养中,为了获得纯培养物,通常利用平板划线法或稀释涂布平板法将菌种接种在固体培养基上,培养获得单菌落后,再接种到特定液体培养基中扩大培养。(2)题图中的物质A为无菌水,物质B为聚乙烯(粉末),必须加入聚乙烯(粉末)的原因是在以聚乙烯为唯一碳源的培养基中,只有能利用聚乙烯的微生物才能生长繁殖,而其他微生物的生长繁殖则受到抑制。(3)(4)略。

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