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考向16　基因工程
【考教衔接】
1.艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验,不仅证明了遗传物质是DNA,还证明了　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
2.限制酶不能切割细菌自身DNA的原因:　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
3.真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此,　　　　　　中一般要添加Mg2+。引物是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。用于PCR的引物长度通常为　　　　　　。
4.农杆菌细胞内含有Ti质粒,当它侵染植物细胞后,能 　。
5.电泳鉴定时未出现特异性条带的原因有①模板DNA出现污染,②　　　　　　　　　,③　　　　　　　　　　　　　　　　　　,④复性时的温度过低,⑤　　　　　　　等。
6.干扰素是一种具有　　　　　　　　　　　,在临床上被广泛用于治疗　　　　　　　疾病,对治疗乳腺癌、淋巴瘤、多发性骨髓瘤和某些白血病等也有一定的疗效。
7.基因工程菌一般是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　的菌类。
8.利用转基因细菌不能直接生产糖蛋白类的产品,因为细菌中 　。
【考点分析】
高频考点1　基因工程的相关工具及技术
真题引领1　(2023·新课标卷)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具,将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接,以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是()。
A.质粒和目的基因都用酶3切割,用E.coli DNA连接酶连接
B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割,用T4 DNA连接酶连接
C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割,用T4 DNA连接酶连接
D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割,用E.coli DNA连接酶连接
解题关键 分析判断
在获取目的基因和切割载体时,最好选用同种类的限制酶 目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
防止载体或目的基因的黏性末端自身连接、环化 可用　　　　　　处理目的基因和载体
E.coli DNA连接酶(从大肠杆菌中分离)和T4 DNA连接酶(从T4噬菌体中分离) 这两类酶都能将双链DNA片段“缝合”起来,恢复被限制酶切开的　　　　　　　,但E.coli DNA连接酶不能连接具有　　　　　　　的DNA片段
标记基因的作用 便于　　　　　　　　
真题引领2　(2024·黑吉辽高考)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验,下列叙述正确的是()。
A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C.在同一电场作用下,DNA片段越长,向负极迁移速率越快
D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫外灯下被检测出来
真题改编1　(2024·山东高考改编)“DNA的粗提取与鉴定”实验的基本过程是裂解→分离→沉淀→鉴定,下列说法错误的是()。
A.裂解可使细胞破裂,释放出DNA等物质
B.研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后,应将上清液倒入烧杯中
C.DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,该原理可用于纯化DNA粗提物
D.将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应,可检测溶液中是否含有蛋白质杂质
真题改编2　(2023·浙江6月选考改编)紫外线引发的DNA损伤,可通过核苷酸切除修复(NER)方式(主要用于修复一些较大的DNA损伤,识别的是损伤造成的DNA螺旋结构扭曲)修复,机制如图所示。下列叙述错误的是()。
A.用NER方式修复DNA损伤时,需要准确识别损伤部位的碱基种类
B.损伤部位被清除需要用到限制酶
C.DNA有害损伤发生后,在细胞增殖时进行修复
D.修复缺损部位和完成连接分别利用DNA聚合酶和DNA连接酶
高频考点2　基因工程的基本操作程序及应用
真题引领3　(2023·湖北高考)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中。下列叙述错误的是()。
A.若用HindⅢ酶切,目的基因转录的产物可能不同
B.若用PvuⅠ酶切,在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因
C.若用SphⅠ酶切,可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D.若用SphⅠ酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
真题引领4　(2024·山东高考)制备荧光标记的DNA探针时,需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP)的反应管①~④中,分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则,且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有()。
反应管 加入的单链DNA
① 5'-GCCGATCTTTATA-3' 3'-GACCGGCTAGAAA-5'
② 5'-AGAGCCAATTGGC-3'
③ 5'-ATTTCCCGATCCG-3' 3'-AGGGCTAGGCATA-5'
④ 5'-TTCACTGGCCAGT-3'
A.①② B.②③ C.①④ D.③④
关键信息 分析论证
1.制备荧光标记的DNA探针时,需要　　　　　　　　　　　　　等 2.在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和　　　　　　　　　　　)的反应管①~④中,分别加入题表所示的适量单链DNA 3.已知形成的　　　　　　　　　　　原则,在本实验的温度条件下　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 得到带有荧光标记的DNA探针需满足的要求有: 1.加入的单链DNA能形成　　　　个以上的连续碱基对。 2.双链DNA区之外的　　　　端有模板,可以延伸。 3.延伸的DNA部分要有碱基　　　　才能产生荧光
选项 分析论证
A 1.　　　　形成双链DNA区。
2.　　　　延伸。
3.延伸部分的碱基为
B 1.　　　　形成双链DNA区。
2.　　　　延伸。
3.延伸部分的碱基为
C 1.　　　　形成双链DNA区。
2.　　　　延伸。
3.延伸部分的碱基为
D 1.　　　　形成双链DNA区。
2.　　　　延伸。
3.延伸部分的碱基为
真题改编3　(2023·重庆高考改编)某小组通过PCR(假设引物长度为8个碱基,短于实际长度)获得了含有目的基因的DNA片段,并用限制酶进行酶切(如下图),再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是()。
A.PCR技术中用到的一个引物的前8个碱基序列为5'-TGCGCAGT-3'
B.步骤①所用的酶是NheⅠ和CfoⅠ
C.可以使用不同于步骤①的酶对质粒进行酶切
D.构建重组质粒时只能使用E.coli DNA连接酶
高频考点3　蛋白质工程及生物技术的伦理
问题
真题改编4　利用AI(人工智能)破解蛋白质的结构和功能之谜,建立蛋白质数据库,并在此基础上进行蛋白质结构设计和优化,会给未来蛋白质工程的发展带来翻天覆地的变化。关于该技术的实施,下列说法正确的是()。
A.用AI预测新型蛋白质的结构和功能依据的原理是中心法则
B.可以通过改造或合成基因来获得AI设计的蛋白质
C.根据设计的某种蛋白质的氨基酸序列推测的基因序列中包含启动子和终止子
D.用蛋白质的氨基酸序列推测的基因编码序列是唯一的
真题改编5　(2023·浙江1月选考改编)人们利用生物技术对生物体进行不同层次的设计、控制、改造或模拟,产生巨大生产力的同时,也带来了多种涉及安全和伦理的问题。如今,公众从网络和自媒体获得的相关信息众多。请利用生物学知识判断,以下信息合理的是()。
A.试管婴儿技术应全面禁止
B.我们要合理利用和开发生物武器
C.消费者对转基因食品有知情权和选择权
D.生殖性克隆人能丰富人类基因的多样性
【最新模拟】
(1~7,9~11,每题3分,第8题10分,共40分)
1.科研人员将寒带地区海鱼中的抗冻基因转入千禧果细胞中,成功培育出抗冻千禧果。下图为培育过程中使用的Ti质粒示意图,其中Vir区的基因活化能促进T-DNA的加工和转移。下列叙述正确的是()。
A.构建基因表达载体时,最好选择限制酶Ⅱ和限制酶Ⅲ来切割质粒
B.利用PCR扩增抗冻基因时,需提前检测抗冻基因的全部碱基序列
C.Vir区的基因活化促进抗冻基因整合到千禧果细胞的染色体DNA上
D.利用含卡那霉素的培养基可筛选出成功导入抗冻基因的千禧果细胞
2.DNA分子的碱基具有吸收波长为260 nm光的特性。DNA两条链的碱基紧密连接时,吸光度偏低;两条链分离时,吸光度升高,因此DNA是否变性可通过DNA溶液对波长为260 nm光的吸光度来检测。肺炎链球菌DNA的变性曲线如图所示,吸光度达到最大值的50%时的温度称为熔解温度(Tm)。下列说法正确的是()。
A.加热会破坏脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键,使DNA变性
B.A、T碱基对所占比例越高的DNA,变性曲线中Tm值越大
C.加热至约70 ℃时,DNA两条链从一端向另一端逐渐分离
D.利用PCR检测目的基因时,需要先将DNA变性
3.下图表示构建苘麻抗除草剂基因A重组质粒的技术流程,其中NptⅡ是卡那霉素抗性基因,GUS基因仅在真核细胞中表达,表达产物可催化底物呈蓝色。下列说法错误的是()。
A.利用PCR扩增基因A时,可在引物中加入PstⅠ和XhoⅠ的酶切位点
B.在培养基中添加卡那霉素可初步筛选导入重组质粒的农杆菌
C.用农杆菌转化植物愈伤组织并选择呈现蓝色的组织进行培养
D.若启动子为除草剂诱导启动子,则将减少细胞物质和能量的浪费
4.CRISPR/Cas9基因编辑技术根据靶基因序列设计向导sgRNA,精确引导核酸酶Cas9切割与sgRNA配对的DNA,相关酶在修复断裂DNA的过程中会改变连接部位的碱基序列。科研人员通过删除编码PD-1蛋白基因的2、3、4片段造成蛋白质的功能缺失,制作PD-1基因敲除鼠的流程如图1所示,已知P1和P2是PCR的引物。将体外转录获得的Cas9 mRNA和sgRNA导入小鼠的受精卵中,获得了12只基因编辑小鼠。利用PCR鉴定小鼠的基因型,电泳结果如图2所示。下列相关分析正确的是()。
A.敲除2、3、4片段引起的变异属于染色体变异
B.敲除前,根据敲除的位置需要设计3个sgRNA
C.图2中,4和12个体杂交的子代均为敲除纯合子
D.图2中,3、5、7个体的体内均能检测到PD-1
5.(改编)科学家将某病毒抗原蛋白的部分编码序列(RBD)拼接成融合基因2RBD和3RBD,探究RBD的二聚体蛋白和三聚体蛋白能否模拟RBD的天然构象并获得高效的免疫原性。重组质粒构建流程如图1所示,NcoⅠ和SacⅠ是pNZ8149质粒上的限制酶识别位点,U-M为信号肽—细胞壁锚定蛋白序列。为鉴定重组质粒是否构建成功,将重组质粒用NcoⅠ和SacⅠ双酶切处理后电泳,结果如图2所示,其中泳道1表示双酶切pNZ8149-2RBD的结果,两条条带的大小分别为2 507 bp和2 020 bp。将构建好的重组质粒分别导入工程菌中进行表达产物的检测。下列说法不正确的是()。
A.利用PCR扩增融合基因时,在引物的3'端添加相应限制酶的识别序列
B.据图可知,融合基因3RBD的长度为2 686 bp
C.泳道2呈现一条条带的原因是双酶切pNZ8149-3RBD后产生的两个片段的大小相近
D.从工程菌细胞表面提取蛋白质进行检测,从而进一步比较两者的免疫原性
6.(改编)下图表示基因工程所用质粒和部分操作步骤,质粒的外侧链为a链,内侧链为b链。AmpR为氨芐青霉素抗性基因,TetR为四环素抗性基因,AmpR转录的模板链属于a链的片段。改造后的ALDH2基因编码区首端到末端(其中一条链)的序列为5'-ATCCATGCGCTC…(中间核苷酸序列)…CAGTGAGTAGCG-3'。四种限制酶的识别序列及切割位点见下表。下列说法正确的是()。
限制酶 BamH Ⅰ Pst Ⅰ Xho Ⅰ Xba Ⅰ
识别序列和切割位点(5'→3') ↓ GGATCC ↓ CTGCAG ↓ CTCGAG ↓ TCTAGA
A.质粒复制的模板链是a链和b链,TetR转录的模板链是a链的片段
B.过程③是基因工程的核心步骤,过程④的培养基具有选择性
C.为扩增目的基因,需选择的引物对为
5'-TCTAGACGCTACTCACTG-3'和
5'-GGATCCATCCATGCGCTC-3'
D.根据选定的引物,经过5次循环,即可获得32个符合要求的目的基因
7.(改编)自然界中很少出现蓝色的花,天然蓝色花产生的主要原因是花瓣细胞液泡中花青素在碱性条件下显蓝色。我国科学家利用链霉菌的靛蓝合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)构建基因表达载体(如下图,Pme Ⅰ、BamH Ⅰ、Spe Ⅰ、Sac Ⅰ为不同的限制酶),通过农杆菌转化法导入白玫瑰中,在细胞质基质中形成稳定显色的靛蓝。下列说法正确的是()。
A.上述获得蓝色玫瑰的方法中需要转入能调控液泡pH的基因
B.将sfp基因插入Ti质粒时使用的限制酶是PmeⅠ和BamHⅠ
C.sfp和idgS基因表达时分别以T-DNA的不同链为模板进行转录
D.农杆菌可将Ti质粒上的T-DNA整合到白玫瑰的细胞质基因组中,以防止基因扩散
8.(10分)镉(Cd)作为一种重金属元素,会严重威胁人体健康。科研人员将Cd响应启动子CadR与绿色荧光蛋白基因(EGFP)组合在一起并导入大肠杆菌中,构建能够检测环境中Cd污染的生物传感器。已知LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质,使菌落呈现蓝色,否则菌落为白色。相关信息如图所示,其中P1、P2、P3表示引物。
限制酶的识别序列及切割位点:
　　　　↓　　　　　　　　　↓
Mun Ⅰ:5'-CAATTG-3'　EcoR Ⅰ:5'-GAATTC-3'
　　　　↓　　　　　　　　　↓
Xho Ⅰ:5'-CTCGAG-3'　Sal Ⅰ:5'-GTCGAC-3'
(1)在构建重组质粒的过程中,需要用到E.coli DNA连接酶,该酶的作用是　　　　　　　　　　　　　。据图分析,应选用限制酶　　　　　　　　切割质粒,以保证质粒与目的基因高效重组。
(2)已知EGFP基因转录得到的RNA中缺乏起始密码子AUG。利用PCR获取EGFP基因时,为保证EGFP基因能正确插入载体且可以正常表达,除选择引物P1外,还需要选择引物　　　　　　,并在其5'端增加碱基序列5'-　　　　　　　　　-3'。
(3)通过琼脂糖凝胶电泳可将不同的DNA片段区分开来,该技术所依据的原理是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。对PCR产物进行电泳检测,结果显示除EGFP基因条带外,还有多条非特异性条带(由引物和模板不完全配对导致)。为减少非特异性条带的产生,可适当　　　　　(填“提高”或“降低”)PCR中复性过程的温度。
(4)为筛选出成功导入重组质粒的目标菌,需要将转化后的大肠杆菌接种到含有四环素和X-gal的培养基上,结果发现长出了蓝色和白色两种菌落。若需进一步鉴定该生物传感器是否制备成功,需要进行的操作是 　。
9.(原创)下列有关DNA的粗提取和鉴定实验、DNA片段的扩增及电泳鉴定实验的叙述,错误的是()。
A.将菜花研磨液放入塑料离心管中,取离心后的上清液放入烧杯中
B.在上清液中放入2 mol/L的NaCl溶液可代替预冷的95%酒精析出DNA
C.用于DNA片段扩增的PCR仪就是一台能够自动调控温度的仪器
D.在凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小和构象均有关
10.(原创)α-1抗胰蛋白酶(α-1-AT)的主要作用是保护机体的正常细胞和器官不受蛋白酶的损伤,抑制感染和炎症,维持机体内环境的稳定。下图表示限制酶的识别序列及切割位点、α-1-AT改良基因和质粒的结构。已知通过乳腺生物反应器生产α-1-AT,下列叙述错误的是()。
A.应选用限制酶EcoRⅤ和BamHⅠ切割质粒
B.应选用E.coli DNA连接酶连接目的基因和质粒
C.质粒上有四环素抗性基因,有利于重组DNA分子的筛选
D.应将重组质粒导入动物的受精卵,而不是导入乳腺细胞
11.(原创)在大肠杆菌中,PpsA和PckA基因分别编码糖代谢中心途径的磷酸烯醇式丙酮酸合成酶(PpsA)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PckA),对苯丙氨酸合成的重要前体物质——磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的积累起关键作用。研究表明,PpsA和PckA基因的串联表达有利于苯丙氨酸生物合成途径下游产物的生成。研究者拟构建高效筛选系统,将
改进的相关基因(用P1表示)整合到载体4,构建载体5,构建过程如下图所示,再将载体5导入链霉素不敏感(由RpsL基因突变造成)、卡那霉素敏感的受体菌,进一步筛选出高产苯丙氨酸的菌株。下列有关叙述错误的是()。
A.制备载体2的过程中,应选择引物1和引物4,产物经酶切、连接后环化成载体2
B.制备载体2的过程中应该在引物的3'端引入XhoⅠ的识别序列,并进行PCR扩增
C.PCR扩增载体3中筛选效率较高的标记基因RpsL时,引物应包含XhoⅠ的识别序列
D.为获得成功导入载体5的菌株,应采用含有卡那霉素的平板进行初步筛选
参考答案
1.DNA可以在同种生物的不同个体之间转移
2.原核生物的DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰
3.PCR反应缓冲液　一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸　20~30个核苷酸
4.将Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞,并且将其整合到该细胞的染色体DNA上
5.Taq DNA聚合酶出现质量问题　引物特异性不强(如与非目的基因的核苷酸序列有同源性)或形成引物二聚体　PCR循环次数过多
6.干扰病毒复制作用的糖蛋白　病毒感染性　
7.用基因工程的方法,使外源基因得到高效表达　
8.只有核糖体,没有内质网和高尔基体等其他细胞器
真题引领1　C　解题思路　使目的基因和载体具有相同的黏性末端　不同的限制酶　磷酸二酯键　平末端　重组DNA分子的筛选
真题引领2　A　解析　对于较大的DNA片段,如基因组DNA或质粒DNA,通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶,因为它们需要更大的孔径来有效迁移,而对于较小的DNA片段,如PCR产物或酶切片段,通常选择较高浓度的琼脂糖凝胶,以提供更好的分辨率和分离效果,A正确;凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料,可以作为电泳进度的指示分子,B错误;在琼脂糖凝胶电泳中,当电场作用时,DNA片段向正极迁移,而非负极,此外,DNA片段的迁移速率与其大小成反比,即DNA片段越长,其迁移速率越慢,C错误;琼脂糖凝胶中的DNA分子通过染色,才可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来,D错误。
真题改编1　.D　解析　在沸水浴的条件下,DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色,因此二苯胺试剂可用于鉴定DNA,D错误。
真题改编2　A　解析　NER方式识别的是损伤造成的DNA螺旋结构扭曲,用该方式修复DNA损伤时,不需要准确识别损伤部位的碱基种类,A错误;修复过程中需要将损伤部位的序列切断,因此需要限制酶参与,B正确;DNA有害损伤发生后,在细胞增殖时进行修复以保证DNA复制的正确进行,C正确。
真题引领3　D　解析　若用HindⅢ酶切,目的基因可能正向插入,也可能反向插入,转录的产物可能不同,A正确;若用PvuⅠ酶切,重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因,因此在含Tet的培养基中的菌落不一定含有目的基因,B正确;重组质粒与质粒的DNA片段大小不同,而DNA凝胶电泳技术可以用于分离不同大小的DNA片段,故DNA凝胶电泳技术能够用于鉴定重组质粒构建成功与否,C正确;SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中,若用SphⅠ酶切,重组质粒中仅含氨苄青霉素抗性基因,因此携带目的基因的受体菌在含Amp的培养基中能形成菌落,在含Tet的培养基中不能形成菌落,D错误。
真题引领4　D　解题思路　模板、引物、DNA聚合酶　碱基被荧光标记的dATP　双链DNA区遵循碱基互补配对　不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区　9　3'　A　能　无法　无　能　能　TCT　能　能　TAT和TAA　能　能　GAA和AAG
真题改编3　D　解析　引物只能引导子链由5'端→3'端延伸,根据碱基互补配对原则,其中一个引物的碱基序列为5'-TGCGCAGT-3',A正确;根据三种酶的酶切位点,题图中的黏性末端是使用NheⅠ和CfoⅠ切割形成的,B正确;步骤①中使用NheⅠ和CfoⅠ对目的基因进行酶切,获得了相应的黏性末端,可以使用与这两种酶不同的酶对质粒进行切割,只要形成的黏性末端与步骤①的酶切形成的黏性末端相同即可构建重组质粒,C正确;题图中形成的是黏性末端,E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶都可连接黏性末端,因此两种DNA连接酶都可以使用,D错误。
真题改编4　B　解析　AI对新型蛋白质的预测应从预期的蛋白质功能出发,设计预期的蛋白质结构,A错误;对蛋白质的改造是通过改造或合成基因来完成的,B正确;启动子和终止子为非编码区,故由氨基酸序列推测的基因序列中不包含启动子和终止子,C错误;因为一种氨基酸可能对应多种密码子,所以用蛋白质的氨基酸序列推测的RNA编码序列有多种可能,对应的基因编码序列就有多种可能,D错误。
真题改编5　C　解析　我国政府一再重申四不原则:不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验。我国政府同样重视治疗性克隆所涉及的伦理问题,主张对治疗性克隆进行有效监控和严格审查,A、D不合理。中美两国元首在关于《禁止生物武器公约》议定书的联合声明中,重申了在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器,并反对生物武器及其技术和设备的扩散,所以不允许利用和开发生物武器,B不合理。
1.C　解析　使用限制酶Ⅱ会破坏Vir区的基因,Vir区的基因是T-DNA整合到受体细胞的染色体DNA上必不可少的,不能选择限制酶Ⅱ来切割质粒,A错误;利用PCR扩增抗冻基因时,只需要知道抗冻基因两端的碱基序列,并据此设计引物,B错误;农杆菌侵染植物细胞后,能将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞,并将其整合到该细胞的染色体DNA上,所以Vir区的基因活化可促进抗冻基因整合到千禧果细胞的染色体DNA上,C正确;在添加了四环素的培养基中可以筛选出成功导入抗冻基因的千禧果细胞,D错误。
2.D　解析　加热会使DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂,导致DNA分子的双螺旋结构疏散,双链解开成单链,从而发生DNA变性,A错误;A、T碱基对间有两个氢键,C、G碱基对间有三个氢键,故A、T碱基对所占比例越高的DNA,变性时需要的温度越低,即变性曲线中Tm值越小,B错误;加热至约70 ℃时,DNA两条链同时分离,C错误。
3.C　解析　由题图可知,构建的重组质粒中无GUS基因,故转化时不会出现蓝色的组织,C错误;若启动子为除草剂诱导启动子,表达后具有除草剂的功能,则将减少细胞物质和能量的浪费,D正确。
4.C　解析　分析图1可知,将野生型基因内部的部分碱基对剪切,改变的是基因内部的碱基序列,该变异属于可遗传变异中的基因突变,A错误;分析图1可知,需要将基因的2、3、4共3个片段切除,需要设计片段2和片段4的2个sgRNA,B错误;基因敲除后,其核苷酸数量减少,电泳时移动速度快,距离点样孔远,4和12个体均为敲除纯合子,C正确;3个体的基因未敲除,5个体为敲除杂合子,7个体为敲除纯合子,因此3和5个体的体内均能检测到PD-1,7个体的体内检测不到PD-1,D错误。
5.A　解析　在DNA聚合酶的作用下,引物的3'端开始连接脱氧核苷酸,利用PCR扩增融合基因时,应在引物的5'端添加相应限制酶的识别序列,A不正确;由题意可知,pNZ8149-2RBD和pNZ8149-3RBD的碱基对数目分别为4527 bp和5193 bp,所以RBD的长度为5193-4 527=666 bp,由图1可知,泳道1表示双酶切pNZ8149-2RBD的结果,两条条带的大小分别为2507 bp和2020 bp,质粒pNZ8149的长度要大于2RBD,则2RBD的长度为2 020 bp,所以融合基因3RBD的长度为666+2020=2686 bp,B正确。
6.C　解析　质粒的a和b两条链都作为模板链进行复制,TetR的转录方向与AmpR的转录方向相反,说明TetR转录的模板链和AmpR转录的模板链不在一条链上,AmpR转录的模板链属于a链的片段,则TetR转录的模板链属于b链的片段,A错误。过程②表示基因表达载体的构建,是基因工程的核心步骤;过程④表示目的基因的检测与鉴定,所以该过程中的培养基具有鉴定作用,B错误。扩增目的基因需要两种引物,它们分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合,根据改造后的ALDH2基因编码区首端到末端的序列以及引物5'端需要添加BamHⅠ、XbaⅠ的识别序列可推测,需要选择的引物对为5'-TCTAGACGCTACTCACTG-3'和5'-GGATCCATCCATGCGCTC-3',C正确。根据DNA半保留复制的特点和PCR反应原理可知,经过前2次循环无法得到符合要求的目的基因,经过第3次循环可以得到等长双链,这样的双链DNA分子两端的两条链均有限制酶的识别序列,经过3次循环可以获得2个符合要求的目的基因,经过4次循环可以获得8个符合要求的目的基因,以此类推,要经过6次循环才可获得32个符合要求的目的基因,D错误。
7.C　解析　由题意可知,靛蓝能够稳定显色,不受pH的影响,故题述方法中无须转入能调控液泡pH的基因,A错误;结合题图可知,将sfp基因插入Ti质粒时若使用的限制酶是PmeⅠ和BamHⅠ,则会将终止子1一同切除,故使用的限制酶只能是BamHⅠ,B错误;sfp和idgS基因具有各自的启动子,表达是相互独立进行的,转录是以DNA的一条链为模板进行的,由题图中启动子方向可知,两个基因转录的模板链不同,C正确;将目的基因导入植物细胞可采用农杆菌转化法,农杆菌可将Ti质粒上的T-DNA整合到白玫瑰细胞的染色体DNA上,D错误。
8.(除标注外,每空1分,共10分)(1)将DNA片段连接起来　MunⅠ和XhoⅠ(2分)　(2)P2　GAATTCATG　(3)不同DNA分子的大小和构象不同,在凝胶中的迁移速率不同(2分)　提高　(4)选取白色菌落接种到含Cd的培养基上,观察是否有绿色荧光出现(2分)
解析　(1)在构建重组质粒的过程中,为了将DNA片段连接起来,需要使用E.coli DNA连接酶。为了将目的基因EGFP插入质粒启动子CadR和终止子之间,应选用XhoⅠ和MunⅠ切割质粒,以保证质粒和目的基因的高效重组。(2)分析题图中质粒、目的基因的位置和限制酶的识别序列及切割位点可知,采用XhoⅠ和SalⅠ切割目的基因可以产生相同的黏性末端,故利用PCR获取EGFP基因时,为保证EGFP基因能正确插入载体且可以正常表达,除选择引物P1外,还需要选择引物P2,并在其5'端增加碱基序列5'-GAATTCATG-3'。(3)通过琼脂糖凝胶电泳区分不同的DNA片段的原理是不同DNA分子的大小和构象不同,在凝胶中的迁移速率不同。非特异性条带产生的原因可能是复性温度过低使引物与模板的结合位点增加,故可适当提高PCR中复性过程中的温度,以减少非特异性条带的产生。(4)目的基因是绿色荧光蛋白基因,由于基因表达载体的构建过程中,将LacZ基因序列切除了,所以菌落应呈现出白色,故若需进一步鉴定该生物传感器是否制备成功,可选取白色菌落接种到含Cd的培养基上,观察是否有绿色荧光出现。
9.B　解析　 DNA会溶解在2 mol/L的NaCl溶液中,B错误。
10.B　解析　 根据α-1-AT改良基因的左右两端的末端可推知,应选用限制酶EcoRⅤ和BamHⅠ切割质粒,A正确;E.coli DNA连接酶不能连接具有平末端的DNA片段,故应选用T4 DNA连接酶连接目的基因和质粒,B错误。
11.B　解析　载体1中含有KanR(卡那霉素抗性基因)和SacB(蔗糖致死基因)两个标记基因,为去除筛选效率较低的SacB,应选择引物1和引物4,并在引物的5'端引入Xho Ⅰ的识别序列,进行PCR扩增,产物经酶切、连接后环化成载体2,A正确,B错误;由于载体2含有XhoⅠ的识别位点而载体3没有,PCR扩增载体3中筛选效率较高的标记基因RpsL时,引物应包含XhoⅠ的识别序列,C正确。

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