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第二章 植物细胞工程
第二节 通过体细胞杂交可获得新的植物体
素养目标
生命观念
基于植物体细胞杂交的定义，利用结构与功能观、生命的物质观和能量观，理解植物体细胞杂交技术的原理。
科学思维
根据植物组织培养和植物体细胞杂交的技术流程，利用比较与分析、归纳与概括的方法，理解两者之间的区别和联系。
科学探究
根据科学史，掌握植物体细胞杂交技术发现的过程，并能分析过程中使用的相关试剂及作用。
社会责任
根据科学史，掌握植物体细胞杂交技术发现的过程，并能分析过程中使用的相关试剂及作用。
教学重难点
植物体细胞杂交的过程和应用价值。
01
植物体细胞杂交的过程。
02
课程导入
用传统的有性杂交方法能得到这种后代吗？
课程导入
番茄细胞
马铃薯细胞
＋
→
杂种细胞
成功培养原生质体是植物体细胞杂交技术的基础
植物体细胞杂交技术
将不同种植物的体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体的方法。
原理
细胞膜的流动性、植物细胞的全能性
可遗传变异类型
染色体数目变异
育种类型
细胞工程育种
成功培养原生质体是植物体细胞杂交技术的基础
原生质体
利用酶解法去除植物细胞壁后的细胞结构，包括细胞膜、细胞质和细胞核，球形。
番茄细胞
马铃薯细胞
番茄原生质体
马铃薯原生质体
去除细胞壁
纤维素酶和果胶酶
显微镜下的球形原生质体
成功培养原生质体是植物体细胞杂交技术的基础
原生质体与原生质层
原生质体
细胞壁
细胞膜
细胞质
液泡
细胞核
原生质层
细胞壁
细胞膜
细胞质
液泡膜
细胞液
原生质层不包括细胞液和细胞核。
原生质体：指的是脱去细胞壁的细胞。动物细胞也可看做是原生质体
原生质层：成熟植物细胞的细胞膜、液泡膜和介于这两层膜之间的细胞质
成功培养原生质体是植物体细胞杂交技术的基础
原生质体的优点
没有了坚硬致密的细胞壁的阻碍，植物细胞之间的融合得以实现
01
原生质体也更容易被导入外源基因，是植物基因工程的理想受体
02
与完整细胞一样具有全能性，仍可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株
03
成功培养原生质体是植物体细胞杂交技术的基础
原生质体的获取、培养
0.5~0.6mol/L的甘露醇
（或一定浓度的蔗糖）
（较高渗透压）
纤维素酶、果胶酶
目的使细胞处于微弱的质壁分离状态，这样有利于完整的原生质体的释放，防止原生质体被破坏。
球形的
原生质体
植物
细胞
材料选择：分裂旺盛，再分化能力强的（植物的年龄、生长发育状态等），如根尖、愈伤组织或悬浮培养细胞等。
可用无菌的G6玻璃砂漏斗过滤灭菌。
纯化方法：
沉降法（低速离心法）
原生质体活力检测：荧光标记法、染色法、形态观察法、胞质环流法、氧摄入量评价法
成功培养原生质体是植物体细胞杂交技术的基础
原生质体活力检测
活的原生质体在光照下光合放氧，无光呼吸耗氧。
氧电极法测呼吸速率
活原生质体会随着外界渗透压的变化体积变化。如放入高渗溶液，细胞皱缩。
渗透压变化法
是否存在胞质环流判断原生质体活力
胞质环流法
FDA法：FDA（二乙酸荧光素）能穿越细胞质膜，被活细胞内的酯酶裂解，在荧光显微镜下发荧光（荧光素）。
伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，但质膜受到严重损坏使细胞被染色。
染色法
02
04
01
03
成功培养原生质体是植物体细胞杂交技术的基础
植物原生质体培养的应用
02
利用原生质体进行外源基因的转化
01
利用原生质体融合获得融合细胞
03
利用原生质体再生植株
04
利用固定化原生质体培养生产次生代谢产物
由杂种细胞培育出的新植物体可能会具有新的特性
科研实践的一些成果
1960年英国植物生理学家科金用酶解法去除植物细胞壁，分离出了植物原生质体。
1971年科研人员首次由原生质体获得了烟草再生植株。
据不完全统计，至少有400多种植物的原生质体经培养后成功再生植株。我国科研人员获得50多种植物的原生质体再生植株。
意义：原生质体培养成功标志着植物细胞工程技术又向前迈进了一步，为植物细胞工程和基因工程的研究提供了先进的实验体系，具有重要的理论研究和实际应用价值。
由杂种细胞培育出的新植物体可能会具有新的特性
原生质体的融合
番茄原生质体
马铃薯原生质体
正在融合的原生质体
细胞膜的流动性
原理
电刺激、离心、振荡
物理手段
聚乙二醇（PEG）
化学手段
02
01
03
由杂种细胞培育出的新植物体可能会具有新的特性
正在融合的原生质体
杂种细胞
再生出 细胞壁
诱导成功的标志
融合的原生质体经培养后再生出新的细胞壁
影响原生质体再生壁的因素
植物基因型、供体细胞的分化程度、培养基成分、渗透压、有些植物加聚乙二醇有利于细胞壁发育
注意
再生出细胞壁是其能进行有丝分裂的前提，且再生细胞壁之后，应逐步降低渗透压。
由杂种细胞培育出的新植物体可能会具有新的特性
重组细胞类型
番茄原生质体(A)
马铃薯原生质体(B)
在一定密度的细胞群体下进行
可能是异种融合细胞
诱导融合后的产物是混合物：
①未融合的细胞： A、B
②两两融合的细胞：AA、BB、AB
③多细胞融合体
④部分融合
获得杂种细胞需要进行鉴定和筛选
由杂种细胞培育出的新植物体可能会具有新的特性
鉴定和筛选杂种细胞的常用方法（拓展）
机械选择法：利用两种原生质体的某些可见标志（如形态、颜色等差异），对融合产物进行鉴别，筛选出杂种细胞进行单独培养。对于在形态、颜色上难以区分的原生质体融合形成的异核体，可利用不同荧光素分别标记两亲本的原生质体，然后进行诱导融合，在荧光显微镜下选择同时带有两种荧光标记的杂种细胞。
互补选择法：这种方法的原理是利用现成的或诱发产生的各种缺陷型或抗性型的突变体细胞作为融合实验的材料。由于突变体均不能在特定的选择培养基上生长，而能在该培养基上正常生长的是互补的杂种细胞，因此可将其筛选出来。
组织培养筛选法：根据植物细胞对培养基成分和培养条件的要求与反应不同，可作为选择杂种细胞的依据。利用这种特性或人为地造成杂种细胞生长和分化能力的差异来进行杂种细胞的选择。
由杂种细胞培育出的新植物体可能会具有新的特性
植物组织培养（杂种细胞具有全能性）
再生出细胞壁
的杂种细胞
愈伤组织
杂种植株
移栽后的植株
1978年梅尔彻斯等用植物体细胞杂交技术培育出的 “马铃薯-番茄”植株，外型倾向于番茄植株，花和叶具有杂种的特点，并结有畸形的小果实，但在根部没有形成块茎。
由杂种细胞培育出的新植物体可能会具有新的特性
植物体细胞杂交的成果
在此基础上，科学家们利用植物体细胞杂交技术，又相继培育出了白菜—甘蓝、普通小麦—长穗偃麦草等杂种。我国科学家还在木本植物的体细胞杂交方面培育出了多种柑橘属不同种间的杂种植株。
白菜
甘蓝
白菜—甘蓝
由杂种细胞培育出的新植物体可能会具有新的特性
植物体细胞杂交技术的优点和局限性
打破生殖隔离，克服远缘杂交不亲和的障碍
优点
①技术复杂、操作繁琐、工作量大；
②不一定按人们需要表达优良性状
局限性
由杂种细胞培育出的新植物体可能会具有新的特性
植物体细胞杂交
A细胞
A原生质体
B细胞
再生出细胞壁
愈伤组织
杂种植株
移栽后的植株
B原生质体
正在融合的原生质体
植物体细胞杂交
原生质体获取、融合
植物组织培养
由杂种细胞培育出的新植物体可能会具有新的特性
植物体细胞杂交
植物细胞
原生质体
融合的原生质体
去除细胞壁
杂种细胞
植株
融合
组培
再生细胞壁
纤维素酶果胶酶
PEG融合法
电融合法
离心法
植物体细胞杂交的结果是杂种植株；属于可遗传变异类型（染色体畸变）；
原理：细胞膜具有一定的流动性，植物细胞的全能性；
杂种细胞的鉴定和筛选以及杂种植株的鉴定和选育是获得真正杂种的必要过程；
意义：克服远缘杂交不亲和的障碍、培育新品种。
由杂种细胞培育出的新植物体可能会具有新的特性
项目 植物物组织培养 植物体细胞杂交技术
所属范畴
原理
步骤
意义
联系
保持优良性状,繁殖速度快、大规模生产提高经济效益
植物体细胞杂交技术应用了植物组织培养技术
①去除细胞壁
②融合形成杂种细胞
③组织培养
细胞全能性
细胞膜一定的流动性、细胞全能性
染色体变异、基因重组
无性繁殖
①脱分化
②再分化
克服不同种生物远缘杂交的障碍
课堂练习
1.紫花苜蓿营养价值高，百脉根耐酸性强。研究者欲通过植物体细胞杂交的方法培育兼具二者优良性状的杂交种，下列相关分析正确的是（ ）
A.加入胰蛋白酶酶解以制备原生质体
B.用灭活病毒诱导法可促进原生质体融合
C.融合的细胞即为杂种细胞
D.杂种细胞不一定具备双亲的优良性状
D
解析：紫花苜蓿细胞细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，在制备原生质体时，需要使用纤维素酶和果胶酶，A错误；灭活病毒诱导法是诱导动物细胞融合的常用方法，不能用于诱导植物细胞原生质体融合，B错误；融合的细胞不一定为杂种细胞，可能是融合了同种原生质体的细胞，C错误；杂种细胞中基因的表达可能会相互干扰，故杂种细胞不一定具备双亲的优良性状，D正确。
课堂练习
2.实验人员利用矮牵牛（2n=14）的红色花瓣细胞（液泡呈红色）与枸杞（4n=48）的叶肉细胞，制备了相应的原生质体，并诱导其融合，经筛选、培养获得杂种植株。下列有关叙述错误的是（ ）
A.获得该杂种植株时不用考虑两种高等植物间的生殖隔离问题
B.可利用聚乙二醇、灭活的病毒等方法诱导原生质体融合
C.可利用光学显微镜观察，筛选出杂种原生质体
D.若原生质体均为两两融合，则融合后的细胞中染色体数目不都为62条
B
解析：植物体细胞杂交获得杂种植株克服了远缘杂交不亲和的障碍，故获得题述杂种植株时不用考虑两种高等植物间的生殖隔离问题，A正确；诱导植物原生质体融合时，可以采用物理方法（电融合、离心等）和化学方法（聚乙二醇等），而灭活的病毒是诱导动物细胞融合的方法之一，B错误；杂种原生质体含有红色液泡和叶绿体，所以可利用光学显微镜观察，筛选得到融合后的杂种原生质体，C正确；若原生质体均为两两融合，则会形成3种细胞，即矮牵牛红色花瓣细胞自身融合的细胞、枸杞叶肉细胞自身融合的细胞以及杂种细胞，所以融合后的细胞中染色体数目为28条或96条或62条，D正确。
课堂练习
3.现有甲、乙两种二倍体纯种植物，甲植物的光合作用产量高于乙植物，但乙植物更适宜在盐碱地种植，相关性状均由核基因控制。现要利用甲、乙两种植物培育出高产、耐盐的植株。下列技术不可行的是（ ）
A.利用植物体细胞杂交技术，可以获得符合要求的四倍体杂种植株
B.将乙种植物耐盐基因导入甲种植物的体细胞中，可培育出所需植株
C.两种植物杂交后得到F1，再利用单倍体育种，可较快获得所需植株
D.诱导两种植物的花粉融合后培育成幼苗，再用秋水仙素处理可培育出所需植株
解析：利用植物体细胞杂交技术，获得的杂种植株理论上具有两个亲本的遗传特性，A正确；将乙种植物耐盐基因导入甲种植物的体细胞中，再利用组织培养技术可培育出所需植株，B正确；甲、乙为不同物种，存在生殖隔离，一般不能杂交，即使能杂交，形成的后代也是不可育的，C错误；诱导两种植物的花粉融合后培育成幼苗，再用秋水仙素处理，可得到符合要求的四倍体纯种植株，D正确。
C
课堂练习
4.20世纪60年代，科学家尝试将番茄和马铃薯杂交，希望培育出一种地上结番茄，地下结马铃薯的超级作物，传统的杂交方法很难实现，科学家利用体细胞杂交技术得到了“番茄—马铃薯”杂种植株，但是没有出现地上结番茄，地下结马铃薯的现象。下列关于该技术的叙述，错误的是（ ）
A.培育“番茄—马铃薯”杂种植株的原理是植物细胞具有全能性和细胞膜的流动性
B.“番茄—马铃薯”杂种植株，没有出现地上结番茄，地下结马铃薯的原因是存在生殖隔离
C.利用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁得到原生质体，以免影响细胞间杂交
D.原生质体融合是体细胞杂交的关键环节，可借助物理法、化学法进行融合
B
解析：A、植物体细胞杂交技术是指将不同来源的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新植物体的技术，所以培育“番茄—马铃薯”杂种植株的原理是植物细胞具有全能性和细胞膜的流动性，A正确；B、“番茄—马铃薯”杂种植株没有出现地上结番茄，地下结马铃薯的原因是生物体内基因的表达相互干扰，B错误；C、植物细胞只有在去除细胞壁成为原生质体后才能融合，需用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁，以免影响细胞间杂交，去除细胞壁后可得到原生质体，C正确；D、原生质体融合是体细胞杂交的关键环节，可借助物理法（电融合法、离心法）、化学法（PEG融合法、高Ca2+—高pH融合法）进行融合，D正确。故选B。
课堂练习
5.某科研人员利用番茄（2n=24）和马铃薯（4n=48）进行体细胞杂交。下列有关叙述正确的是（ ）
A.用酶解法去除细胞壁时，应在低渗溶液中进行
B.诱导原生质体融合时，常使用的化学诱导剂是聚乙二醇
C.杂种植株的所有体细胞均能进行减数分裂产生可育配子
D.此项技术可以打破生殖隔离，定向改造生物性状
B
解析：用酶解法去除细胞壁时，为维持细胞形态，应在等渗溶液中进行，在低渗溶液中原生质体会吸水涨破，A错误；诱导原生质体融合的过程中常采用的化学诱导剂是聚乙二醇，B正确；杂种植株的体细胞都不能进行减数分裂，C错误；植物体细胞杂交技术可以打破生殖隔离，克服远缘杂交不亲和障碍，但不能达到定向改造生物性状的目的，D错误。
总结归纳
概念
植物细胞融合
原生质体制备
过程
变异类型
植物体细胞杂交
优缺点
植物组织培养
原生质体融合
原理
育种类型

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