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第三节 动物细胞工程及其应用
第二章 细胞工程
第1课时
1890年，希普将安哥拉兔的胚胎移入比利时兔的输卵管内，得到了两只安哥拉兔，这是世界上胚胎移植成功的首例
1907年，哈里森用一滴淋巴液成功培养了蝌蚪的神经元，首创了动物组织体外培养法
1951年，张明觉等发现了哺乳动物精子的获能现象
1959年，试管家兔诞生，之后，多种试管动物相继出生
1975年，米尔斯坦和科勒等创立了单克隆抗体技术
1978年，小鼠的桑椹胚被成功分割，次年，科学家分割绵羊胚胎获得了同卵羔羊
1981年，埃文斯等成功分离和培养了小鼠的胚胎干细胞
1996年，世界上第一只体细胞克隆羊多莉在英国诞生，随后多种克隆动物相继问世
2006年，山中伸弥等获得了诱导多能干细胞，我国科学家用这种细胞培育出了小鼠
2014年，世界上第一个用单细胞基因组测序进行遗传病筛查的试管婴儿在我国诞生
1958年，格登用非洲爪蟾进行体细胞核移植实验，成功培育出性成熟个体，同一时期，我国科学家童第周等开展了鱼类细胞核移植工作
2017年，我国科学家首次培育了体细胞克隆猴
细胞工程的发展历程
积极思维
为什么克隆羊多莉会轰动全世界？
事实：
1996年7月，英国科学家韦尔穆特等人采用成年绵羊的乳腺细胞（动物体细胞）进行核移植，成功培育出世界上首例体细胞核移植克隆羊多莉，由此翻开了动物克隆史上崭新的一页。
思考
解释 试分析克隆羊多莉的性状与芬兰白面母羊相似的原因。
哺乳动物体细胞核在卵母细胞细胞质的支持下，也和植物细胞一样具有全能性。
提问：我们能否利用类似植物组织培养获得完整植物体的方法培养动物细胞，使其发育成一个完整的个体？
不能，高度分化的植物细胞仍保持着全能性，而动物细胞的全能性会随细胞分化程度的提高逐渐受到限制，分化潜能逐渐变弱。因此，目前还不能用类似植物组织培养的方法获得完整的动物个体。
积极思维
为什么克隆羊多莉会轰动全世界？
实现方法：动物体细胞核移植技术
1.动物细胞核移植技术概念
移入
动物细胞
取核
卵母细胞
去核
重组细胞
发育
新胚胎
发育
克隆动物
用核移植方法得到的动物称为克隆动物
2.原理：
动物细胞核的全能性
3. 生殖方式：无性生殖
动物细胞核移植技术
把动物的一个细胞的细胞核，移植到已经去除细胞核的卵母细胞中，并使这个重新组合的细胞发育成新胚胎，继而发育成动物新个体的技术。
类型
分为 细胞核移植和 细胞核移植。
胚胎
体
胚胎细胞核移植 体细胞核移植
分化程度
全能性强度
核移植难度
低
高
高
低
容易
困难
动物细胞核移植技术
动物细胞核移植技术
动物细胞核移植技术也是一种克隆技术。克隆不仅仅是指无性繁殖，还包括遗传上完全相同的分子、细胞或来自同一祖先的生物个体的无性繁殖群体。世界上已经培育出的克隆羊、克隆牛等克隆动物大多是通过动物细胞核移植技术实现的。用体细胞核移植技术进行的克隆就是体细胞克隆。这一过程需要利用显微操作的方法，将供体的体细胞核注入受体的去核卵母细胞中，重组细胞经过培养后生长发育成胚胎。
一般指DNA分子扩增，如PCR技术，还包括单克隆抗体技术。
由一个细胞分裂所形成的细胞群体，如动物细胞培养技术、植物细胞培养技术。
分子水平：
细胞水平：
个体水平：
在生物学上，克隆是无性繁殖，具体地说，是指一个共同的祖先，通过无性繁殖的方法产生出来的一群遗传特性相同的分子、细胞或个体。
克隆技术：是一个很广的概念，凡指新形成的事、物与亲本一致的现象均可称为“克隆”。
指基因型完全相同的个体或群体，如植物组织培养技术、核移植技术。
动物细胞核移植技术
动物细胞核移植技术
动物细胞核移植技术的过程
屠宰场收集牛卵巢，采集卵母细胞，在体外培养到MⅡ期
“去核”的卵母细胞
供体细胞培养
通过显微操作去核
高产奶牛
（供体）
从供体身体的某一部位（如耳）上取体细胞
①细胞质内存在激发细胞核全能性表达的物质；
②细胞体积大，便于操作；
③卵黄多，营养物质丰富。
卵母细胞的特点：
卵母细胞为什么要“去核”？
保证核移植的胚胎或动物的核遗传物质全部来自供体细胞。
为什么要培养到MⅡ期？
正常排出的卵子即处于MⅡ期，此时卵母细胞已发育成熟，细胞质中具有激活重构胚以及早期胚胎发育的必需因子。
①对卵母细胞损伤较小；
②保证供体细胞的细胞核不被破坏，操作方便。
电融合法
激活方法：①物理方法②化学方法
形成重构胚
为什么将整个供体细胞注入卵母细胞中？
激活重构胚目的是什么？
用物理或化学方法(如电刺激、Ca2+载体、乙醇、蛋白酶合成抑制剂等)激活重构胚胎，使其完成细胞分裂和发育进程。
早期胚胎
去核的卵母细胞
供体细胞
将供体细胞注入去核的卵母细胞
问题1 整个过程用了哪些技术？
问题2 新生牛的性别？性状表现与三个亲本都相关吗？
问题3 繁殖方式？
早期胚胎
(代孕)母牛体内
生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛
克隆牛
动物细胞培养、动物体细胞核移植、早期胚胎培养、胚胎移植
与供体相同，性状与代孕母牛无关
无性繁殖
动物细胞核移植技术
动物体细胞核移植技术的应用非常广泛，对促进畜牧业的发展、培育优良畜种、生产实验动物和转基因动物、拯救颜危动物、保护动物资源都具有一定的应用价值。
动物细胞核移植技术的应用
①通过建立转基因体细胞系，再利用体细胞核移植技术培育的转基因克隆动物可以作为生物反应器，生产许多珍贵的医用蛋白；
乳腺生物反应器
换成核移植过程相关细胞
动物细胞核移植技术的应用——医药领域
②在治疗人类疾病时，转基因克隆动物的细胞、组织或器官可以作为异种移植的供体；
③以患者作为供体培育的人核移植胚胎干细胞，经过诱导分化能形成相应的细胞、组织或器官，将它们一直给患者时可以避免免疫排斥反应。
动物细胞核移植技术的应用——医药领域
诱导
治疗性克隆 vs iPS细胞治疗
病人
取核
去核卵母细胞
重构胚胎
各种细胞组织或器官
诱导
取出
体细胞
核移植
移植
成纤维细胞
取出
转入相关因子
iPS细胞
各种细胞组织或器官
胚胎干细胞
取出
移植
治疗性克隆
iPS细胞治疗
细胞发生转化
动物细胞核移植技术的应用——科研领域
①研究克隆动物可以使人类更深入地了解胚胎发育及衰老过程；
②克隆一批遗传背景相同的动物，可以通过它们之间的对比来分析致病基因；
③克隆特定疾病模型的动物，还能为研究该疾病的致病机制和开发相应的药物提供帮助。
动物细胞核移植技术的应用——科研领域
在保护濒危物种领域：增加动物数量。
黑草黄弄蝶
白鳍豚
金丝猴
动物细胞核移植技术的应用
问题与讨论
大熊猫被誉为“活化石”和“中国国宝”，它是世界自然基金会的形象大使，也是世界生物多样性保护的物种之一。2008年，我国宣布世界首张大熊猫基因组图谱绘制完成。
我们能不能设计一个运用动物体细胞核移植技术繁殖大熊猫的方案呢？
在畜牧业生产中，利用体细胞核移植技术可以加速家畜遗传改良的进程，促进优良畜群的繁育；在保护颜危物种方面，利用体细胞核移植技术增加动物数量的工作也已经初见成效。
动物细胞核移植技术的应用
概念：
从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适当的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。
目的：
获得细胞或细胞产物；不能获得完整动物个体。
原理：
细胞增殖（有丝分裂）
那么，动物细胞的培养需要哪些条件呢？
细胞生长和增殖
适宜条件
动物体
组织
取出
单个细胞
分散
动物细胞培养技术
无菌、无毒的环境
动物细胞培养的条件
营养物质
稳定的
内环境
<
<
糖类
氨基酸
无机盐
维生素
……
适宜的温度、pH和渗透压
适宜的气体环境
将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成的培养基
含人类未知、细胞生长增殖所必需的物质，满足细胞对未知营养成分的需求。
合成培养基 + 血清等天然成分
无菌：
无毒：
①培养液、用具：灭菌处理；
②无菌操作；
③适量添加抗生素
定期更换培养液，
以便清除代谢物。
液体培养基：
动物细胞培养技术
血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等，其中，蛋白质主要为白蛋白和球蛋白；氨基酸有多种，是细胞合成蛋白质的基本原料，且有些氨基酸是动物细胞本身不能合成的（称为必需氨基酸），必须由培养液提供；激素有胰岛素、生长激素等。血清还含有多种未知的促细胞生长因子、促贴附因子及其他活性物质，它们能促进细胞的生长、增殖和贴附。因此，在培养动物细胞时，为保证细胞能够顺利生长和增殖，一般需在培养基中添加10%~20％的血清等天然成分。
动物细胞培养通常要添加血清的原因
知识延伸
①适宜的温度：
②适宜的pH：
③适宜的渗透压：
动物细胞培养的
条件
营养物质
稳定的
内环境
<
<
糖类
氨基酸
无机盐
维生素
……
无菌、无毒的环境
适宜的温度、pH和渗透压
适宜的气体环境
维持细胞正常的形态和功能。
36.5±0.5℃
7.2-7.4
维持培养液的pH
95%空气 + 5%CO2 的CO2 培养箱
O2：细胞代谢所必需
动物细胞培养技术
动物和人体的免疫系统可抵御各种微生物对机体的入侵，因此体内细胞生活的内环境几乎是无菌、无毒的。而离体培养的细胞对微生物和有毒物质的防御能力极低，所以其培养环境中一旦有细菌、真菌或病毒等微生物的污染，培养的细胞就会死亡。
动物细胞培养技术
取动物组织
制成细胞悬液
转入培养液进行原代培养
放入CO2培养箱中培养
传代培养
放入CO2
培养箱中培养
用机械的方法，或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理的方法，将组织分散成单个细胞
动物细胞培养技术的应用
传代培养
原代培养
新鲜取样的动物组织
单个细胞
细胞悬液
机械方法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理
加入培养液
贴壁细胞生长到接触抑制
细胞悬液
胰蛋白酶或胶原蛋白酶等处理，分散成单个细胞，离心法收集后，将收集的细胞加入培养液
分瓶继续培养
贴壁细胞生长到接触抑制
放入CO2
培养箱中培养
动物细胞培养流程图
动物细胞培养技术的应用
需分瓶进行传代培养的原因：
悬浮细胞会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质减少等因素而分裂受阻
贴壁细胞在生长增殖时，除受上述因素影响外，还会发生接触抑制现象
原代培养
从供体获取细胞或组织后进行的初次培养。
传代培养
将原代培养的细胞继续转接到新的培养基上继续培养。
动物细胞培养技术的应用
进行传代培养(分瓶培养)时，如何处理？
悬浮细胞
离心法收集
制成细胞悬液
贴壁细胞
胰蛋白酶处理
分瓶培养
动物细胞培养技术的应用
区分两种“培养”的关键是看用胰蛋白酶处理的对象
第一次
用胰蛋白酶对剪碎的动物组织进行处理，使其分散成单个细胞后进行培养，为原代培养。
细胞培养过程中出现接触抑制，用胰蛋白酶使其从瓶壁上脱离下来，然后，将其分散到多个培养瓶中继续培养，为传代培养。
第二次
问题:请列表比较动物细胞培养和植物组织培养。
动物细胞培养技术的应用
比较项目 植物组织培养 动物细胞培养
原理
培养基性质
培养基特有成分
培养结果
培养目的
相同点
植物组织培养和动物细胞培养的比较
获得细胞或细胞产物
常用固体培养基
植物体
葡萄糖、动物血清
常用液体培养基
细胞增殖
细胞的全能性
许多细胞
快速繁殖等
蔗糖、植物激素
1.培养过程中细胞都进行有丝分裂，不涉及减数分裂；
2.均需无菌操作，需要适宜的温度、pH等条件
动物细胞培养技术的应用
无菌、无毒
营养
温度、pH和渗透压
气体环境
制备细胞悬液
原代培养
传代培养
动物细胞培养
动物细胞培养的条件
动物细胞培养的过程
动物细胞核移植技术
动物细胞核移植过程及原理
动物细胞核移植技术的应用
课堂小结
随堂训练
1.下列关于动物细胞培养的叙述正确的是( )
A.动物细胞培养与植物组织培养依据的原理都是细胞的全能性
B.动物细胞培养时，定期更换培养液的目的是防止杂菌污染
C.在将组织分散成单个细胞时，可采用机械法，或利用胃蛋白酶进行的酶解法
D.在进行传代培养时，悬浮培养的细胞一般采用离心法收集
答案：D
解析：A、植物组织培养依据的原理是植物细胞的全能性，而动物细胞培养的原理是细胞的增殖，A错误；
B、动物细胞培养时定期更换培养液的主要目的是清除代谢产物，防止代谢产物积累对细胞自身造成危害，而不是防止杂菌污染，B错误；
C、用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理剪碎的动物组织，可使其分散成单个细胞，也可采用机械方法获得单个细胞，胃蛋白酶作用的适宜pH约为2，当pH大于6时，胃蛋白酶就会失去活性。而多数动物细胞培养的适宜pH为7.2～7.4，因此胃蛋白酶并不适用于此过程，C错误；
D、进行传代培养时，悬浮培养的细胞处于游离状态，因而可直接用离心法收集，D正确。
随堂训练
2.核移植技术除了研究生物学的基本问题外，在药物生产、优良种畜的培育和繁殖、拯救濒危动物、治疗性克隆等方面，具有重要的实际应用价值。下列关于动物细胞核移植技术应用的叙述，错误的是( )
A.细胞核移植技术可用于优良种畜的培育
B.细胞核移植技术可用于人的生殖性克隆
C.核移植技术与干细胞诱导技术结合，可用于修补人体损伤的器官
D.核移植技术可用于转基因动物的克隆，以保持转基因动物的性状
答案：B
解析：A、动物细胞核移植技术是将动物一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，使这个重新组合的细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体的技术，因此利用细胞核移植技术可培育优良种畜，A正确；B、利用细胞核移植技术可用于人的治疗性克隆，禁止用于生殖性克隆，B错误；C、核移植技术与干细胞诱导技术结合，可克隆出人体相应的器官，用于修补人体损伤的器官，C正确；D、利用核移植技术克隆转基因动物，获得的克隆动物遗传物质主要来自细胞核供体，可以保持转基因动物的性状，D正确。故选B。
随堂训练
3.利用核移植克隆人体器官有望最终解决供体器官的短缺和器官移植出现的排异反应。下图表示利用核移植克隆人体器官的过程。下列有关叙述错误的是( )
A.从病人体内取出的健康体细胞不会携带任何致病基因
B.上述过程不能够说明离体的动物体细胞具有全能性
C.重构胚具有发育成完整个体的能力
D.图中①②过程都发生了细胞增殖和分化
答案：A
解析：A、从病人体内取出的健康体细胞可能携带隐性致病基因，A错误；B、细胞全能性指高度分化的细胞离体后能发育成完整的生物个体或各种细胞的潜能，上述过程是将人体细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，重新组合的细胞发育成新胚胎，再分裂和分化出各种细胞，因此上述过程不能说明离体的动物体细胞具有全能性，B正确；C、重构胚能分裂和分化，具有发育成完整个体的能力，C正确；D、图中①是由胚胎干细胞分裂分化成脏器组织干细胞和神经组织干细胞，此过程存在细胞增殖和细胞分化，②过程由脏器组织干细胞和神经组织干细胞分裂分化成脏器组织细胞和神经细胞，也存在细胞增殖和分化，D正确。故选A。
随堂训练
4.如图为动物细胞培养的基本过程示意图。下列相关叙述错误的是( )
A.容器甲中放入的一般是健康幼龄动物的组织，原因是其细胞分裂能力强
B.图中丙和丁分别表示的是原代培养和传代培养，其培养原理相同
C.制备乙可用胰蛋白酶处理，且处理时间越长越好
D.动物细胞培养需要提供O2和CO2等气体环境，CO2的主要作用是维持培养液的pH
答案：C
解析：幼龄动物的细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，易于培养，A正确；图中丙和丁分别表示的是原代培养和传代培养，其培养原理都是细胞增殖，B正确；制备乙可用胰蛋白酶处理，但是处理时间要适当，不是越长越好，C错误；动物细胞培养需要提供95%的空气和5%的CO2等气体环境，其中氧气的作用是动物细胞有氧呼吸需要消耗的，而CO2的主要作用是维持培养液的pH，D正确。
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