资源简介

(共39张PPT)
第三节 动物细胞工程及其应用
第二章 细胞工程
第2课时
在治疗大面积烧伤时，通常采用的方法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。但对这样的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源又不足，而且会产生免疫排斥反应。
动物细胞培养
动物细胞核移植
动物细胞融合
动物细胞工程
→是最基础的技术
问题:什么是干细胞技术？
情境导入
植物体细胞杂交
植物细胞融合
植物组织培养
打破生殖隔离，克服远缘杂交不亲和障碍，培育出新的作物类型。
温故知新：植物体细胞杂交技术
动物细胞融合技术及其应用
运用植物体细胞杂交技术，可培育新的作物类型
那么，能不能让不同种动物的体细胞进行杂交，培育出集不同细胞优势于一身的动物细胞呢？
动物细胞融合技术及其应用
实例：1970年，人—鼠细胞荧光标记融合实验
人细胞
鼠细胞
红色荧光染料标记的膜蛋白
绿色荧光染料标记的膜蛋白
细胞融合
人鼠杂交细胞
37°
培养40min
细胞融合
实验表明：细胞膜具有流动性
动物细胞融合技术及其应用
动物细胞融合
概念
原理
诱导方法
使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。
细胞膜具有一定的流动性
物理法：电融合法
化学法：聚乙二醇（PEG)
生物法：灭活病毒诱导法
思考：灭活病毒诱导细胞融合的原理是什么呢？
动物细胞融合技术及其应用
问题2:灭活病毒诱导细胞融合的原理是什么呢？
灭活：是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构。
原理：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞相互凝集，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
动物细胞融合技术及其应用
动物细胞融合
结果
意义
运用
形成具有原来两个或多个细胞的遗传信息的杂交细胞
突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能。
第一
第二
第三
为制造单克隆抗体开辟了新途径。
研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。
至今，种间、属间、科间，甚至动物和植物之间的细胞融合都已获得成功。
比较植物体细胞杂交和动物细胞融合的异同。
动物细胞融合技术及其应用
植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较
比较 植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理
步骤 酶解法去掉 后，诱导 融合，形成 ，再经植物组织培养形成 。 分散成 后诱导细胞融合，形成 。
方法 聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2＋—高pH融合法、电融合法、离心法 PEG融合法、电融合法、
诱导法
结果 形成____________ 形成 ，以生产细胞产品
意义 打破生殖隔离，实现远缘杂交育种 突破有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能
细胞膜的流动性
细胞的全能性
细胞膜的流动性
细胞壁
原生质体
杂种细胞
杂种植株
单个细胞
杂交细胞
灭活病毒
杂种植株
杂交细胞
血清
（抗体主要分布部位）
传统抗体制备方法:
向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需抗体。
缺陷：
产量低、纯度低，特异性差
血清含量有限
传统抗体制作方法及缺陷：
抗体1
抗体2
抗体3
抗体4
…….
动物体内产生的特异性抗体的种类超过百万种
抗原1
抗原2
抗原3
抗原4
B细胞1
B细胞2
B细胞3
B细胞4
…….
每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体
刺激
刺激
刺激
刺激
传统抗体制作方法及缺陷：
抗体1
抗体2
抗体3
抗体4
…….
动物体内产生的特异性抗体的种类超过百万种
抗原1
抗原2
抗原3
抗原4
B细胞1
B细胞2
B细胞3
B细胞4
…….
每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体
刺激
刺激
刺激
刺激
血清中获取
纯度低
特异性差
需要
得到
若能得到大量的B细胞4就可以
若我们只需要大量的抗体4有什么办法吗？
传统抗体制作方法及缺陷：
为了增强人体的免疫力，临床上常常需要大量的特定抗免疫体。由于用传统方法制备的是含有多种抗体的混合抗体，不能说出用吗专一性地对付某一类病原体，因而治疗效果不佳。若采取单个浆细胞进行无性繁殖形成细胞群，这样的细胞群就能产生化学性质单一、特异性强的抗体，即单克隆抗体。
每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体
单一B淋巴细胞
细胞群
选择
克隆
产生
大量纯度高特异性强的抗体
B淋巴细胞不可能无限增殖
科学家针对浆细胞在体外培养条件下不能无限增殖的问题，利用肿瘤细胞如骨髓瘤细胞）具有无限增殖的特性，成功地设计出一个制备方案。
传统抗体制作方法及缺陷：
一个极富创造力的方案：
动物细胞融合
杂交细胞
动物细胞培养
单克隆抗体
骨髓瘤细胞（癌细胞）能无限增殖
一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体
杂交瘤细胞
既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体
1975年，米尔斯坦和柯勒
1984年，诺贝尔生理学或医学奖
传统抗体制作方法及缺陷：
从患骨髓瘤的小鼠体内取骨髓瘤细胞的培养
多种已免疫B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
诱导融合
小鼠的脾脏中获取
注射特定的抗原,小鼠脾产生特定抗体的淋巴B细胞
单克隆抗体的制备过程：
B细胞1
B细胞2
B细胞3
B细胞4
B细胞2
B细胞3
B细胞4
骨髓瘤细胞
B细胞1
杂交1
杂交2
杂交3
杂交4
动物细胞融合
融合的细胞
B细胞2
B细胞3
B细胞4
骨髓瘤细胞
B细胞1
杂交1
杂交2
杂交3
杂交4
置于选择性培养基上培养
第一次筛选
杂交1
杂交2
杂交3
杂交4
杂交瘤细胞(多种)
第一次筛选：用特定的选择培养基在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长
动物细胞培养
单克隆抗体的制备过程：
①细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基喋呤阻断。
②人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但不能分裂增殖。
③鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，但能不断分裂增殖。
筛选出杂交瘤细胞方法？
培养基中加入氨基嘌呤
B淋巴细胞及同型融合细胞
不能无限增殖，死亡
骨髓瘤细胞及同型融合细胞
不能无限增殖，死亡
杂交瘤细胞
能无限增殖，生长
拓展延伸：【第一次筛选】获得杂交瘤细胞
克隆化培养
拓展延伸：【第二次筛选】得到能产生所需抗体的杂交瘤细胞
克隆化培养
拓展延伸：【第二次筛选】得到能产生所需抗体的杂交瘤细胞
抗原4
抗体检测
拓展延伸：【第二次筛选】得到能产生所需抗体的杂交瘤细胞
抗体检测呈阳性
抗体检测
拓展延伸：【第二次筛选】得到能产生所需抗体的杂交瘤细胞
使用96孔板培养和筛选杂交瘤细胞，每一个孔尽量只接种一个杂交瘤细胞，即将单个杂交瘤细胞单独培养，通过克隆化培养和抗体检测，即可获得大量能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。
拓展延伸：【第二次筛选】得到能产生所需抗体的杂交瘤细胞
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞
体外培养
单克隆抗体
体内或体外培养
注射到小鼠腹腔
腹内培养相对于体外培养的优点：不需要特定的培养基，不需要严格控制环境条件。
单克隆抗体的制备过程：
单克隆抗体
杂交细胞
杂交瘤细胞
体外或体内培养
第一次筛选
骨髓瘤细胞
诱导融合
分泌特异抗体的杂交瘤细胞
杂交瘤细胞群
提取
已免疫的B淋巴细胞
动物细胞融合技术
动物细胞培养技术
特异性强
灵敏度高
可大量制备
注射抗原
选择性培养基上培养
第二次筛选
克隆化培养抗体检测
既能大量繁殖又能产生专一抗体
单克隆抗体的制备过程：
（1）杂交瘤细胞的特点__________________________________
（2）第二次筛选的目的________________________________________________
如何筛选_______________________________________ ____________
选择抗体检测呈___性的杂交瘤细胞，即_____________ _____________
（3）抗体检测原理_______________________________________
获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选）
分泌的抗体能与特定的抗原结合
抗原和抗体能够特异性结合(分子水平的鉴定）
既能迅速大量增殖，又能产生抗体
（4）如何获取大量所需杂交瘤细胞__________________________________________
（5）如何获取单克隆抗体
①体外培养___________________________
②小鼠腹腔内培养_________________________
（6）单克隆抗体的优点_____________________________
_________________________________________________
在体外条件下大规模培养（接种于培养液中）或注射到小鼠腹腔内增殖
从细胞培养液中获取
从小鼠腹水中获取
能准确地识别抗原的细微差异，
与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备
阳
单克隆抗体的制备过程：
1.作为诊断试剂——最广泛的应用
抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体
比原来诊断方法提前了10d左右，准确率在90﹪以上。
具有准确、高效、简易、快速特点
诊断优点：
单克隆抗体的应用
2.用于治疗疾病和运载药物
(主要用于癌症治疗)如：单克隆抗体+药物 =“生物导弹”
优点：位置准确、疗效高、副作用小
结合同位素的单抗
(“生物导弹” —单抗导向，药物为弹头)
单克隆抗体的应用
2.用于治疗疾病和运载药物
细胞凋亡
ADC的作用机制示意图
①
ADC被细胞吞噬
②
⑤
ADC
抗体
药物
接头
单克隆抗体+接头+药物（如细胞毒素）=ADC
实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。
单克隆抗体的应用
2.用于治疗疾病和运载药物
脂质体给药
高效 低毒 靶向
抗肿瘤药物载体：阿霉素脂质体和顺铂脂质体已在国外上市。
单克隆抗体的应用
2.用于治疗疾病和运载药物
单克隆抗体不仅可以运载药物，而且自身也能用于治疗疾病。单克隆抗体药物占有非常重要的地位。
排名 药物 中文名 销售额(亿美元) 适应症 类型
1 Humria 修美乐 199.36 自身免疫疾病 单抗
6 Herceptin 赫赛汀 70.32 乳腺癌等多种癌症 单抗
7 Avastin 安维汀 68.98 结肠癌等多中癌症 单抗
8 Rituxan 美罗华 68.01 白血病 单抗
9 Opdivo 纳武单抗 67.35 多种肿瘤 单抗
2018年全球药物销售额排名前10的单抗药物
修美乐已连续8年蝉联榜首,2021年新冠疫苗(mRNA疫苗)位居榜首，修美乐位居第二位。
单克隆抗体的应用
神奇的干细胞—干细胞的种类（视频）
干细胞技术应用于疾病治疗
来源或存在 功能、特点 局限性
胚胎干细胞(ES细胞)
成体干细胞
诱导多能干细胞(iPS细胞)
早期胚胎，体积小，细胞核大、核仁明显
能够分化成为动物体内的任何细胞，并进一步形成组织、器官甚至生物个体
成体组织或器官，如造血干细胞、神经干细胞和精原干细胞等
体外诱导体细胞产生
能分化成为具有特定功能的细胞来治疗疾病。无须破坏胚胎，且避免免疫排斥反应。
具有组织特异性，能分化成特定的细胞或组织
不具有发育成完整个体的能力
需从胚胎中获取，涉及伦理问题，限制了它在医学上的应用
技术不成熟。
面临的问题:存在着导致肿瘤发生的风险。
干细胞技术应用于疾病治疗
移植
取成纤维细胞等
iPS细胞
转入相关因子
细胞发生转化
分化
胰岛细胞
神经元
血细胞
肠上皮细胞
心肌细胞
肝细胞
病人
iPS细胞用于治疗人类疾病示意图
诱导多能干细胞
（iPS细胞）
多种体细胞
定向诱导分化
体外诱导成纤维细胞
临床治疗疾病如：
白血病、帕金森病、阿而茨海默病等
iPS细胞
治疗糖尿病疾病
治疗神经疾病
治疗心血管疾病
治疗消化道疾病
干细胞技术应用于疾病治疗
概述
应用
动物细胞融合
技术
过程
结果
意义
原理
融合方法
原理
应用
单克隆抗体的制备
免疫处理
第一次筛选
诱导融合
第二次筛选
大规模培养
诊断试剂
运载药物
治疗疾病
克隆化培养
抗体检测
体外培养
小鼠腹腔
课堂小结
随堂训练
1.用小鼠经免疫的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞生产的鼠源性单克隆抗体可用于分子检测，但用于人类疾病治疗时往往有一定的副作用。如果对小鼠进行基因改造，使其表达人类抗体，从而将鼠源性单克隆抗体改造成人源性单克隆抗体，则更适用于疾病治疗。下列相关叙述正确的是( )
A.制备单克隆抗体时，首先要从小鼠体内分离出能分泌所需抗体的浆细胞
B.骨髓瘤细胞中没有指导抗体合成的相关基因，但可让融合细胞大量增殖
C.将产生相应抗体的杂交瘤细胞注入小鼠体内，然后从其血浆中分离抗体
D.将鼠源性单克隆抗体改造成人源性，可能降低人体发生免疫排斥的风险
答案：D
解析：A、制备单克隆抗体时，首先要从小鼠体内分离出经免疫的B淋巴细胞，A错误；B、骨髓瘤细胞中没有指导抗体合成的相关基因，但具有自身在适宜条件下无限增殖的能力，B错误；C、将杂交瘤细胞进行克隆化培养后，将产生相应抗体的杂交瘤细胞注入小鼠体内，从小鼠的腹水中分离抗体，C错误；D、不同生物体的组织相容性抗原不同，若将鼠源性单克隆抗体直接用于人，会产生免疫排斥反应，对小鼠进行基因改造，使其表达人类抗体，从而将鼠源性单克隆抗体改造成人源性单克隆抗体，可减少人对鼠源性单克隆抗体的免疫排斥反应，D正确。故选D。
随堂训练
2.乳腺癌化疗的药物在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，为降低药物对患者的副作用，科研人员尝试在单克隆抗体技术的基础上，构建抗体一药物偶联物（ADC），过程如图所示。下列相关说法正确的是( )
A.对①过程形成的杂交细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可以获得能分泌所需抗体的细胞
B.ADC通常由抗体、接头和药物三部分组成，ADC起作用时会被细胞吞噬，并在溶酶体内被分解后释放药物
C.经步骤③筛选得到的杂交瘤细胞具有的特点是能准确识别抗原的细微差异并能大量制备
D.ADC能降低乳腺癌治疗药物的副作用，原因是药物能特异性地作用于乳腺癌细胞，避免其他细胞受损
答案：B
解析：A、经过程①形成的融合细胞有同种核两两融合和不同核融合细胞，需要经过特定的选择性培养基筛选，A错误；B、抗体一药物偶联物（ADC）通常由负责选择性识别癌细胞表面抗原的抗体，负责杀死癌细胞的药物有效载荷，以及连接抗体和有效载荷的连接子三个部分组成，ADC起作用时会被细胞吞噬，并在溶酶体内被分解后释放药物，B正确；C、步骤③是抗体检测，得到的杂交瘤细胞既能大量增殖又能产生专一性抗体，C错误；D、ADC能降低乳腺癌治疗药物的副作用，原因是抗体能特异性地作用于乳腺癌（靶）细胞，避免其他细胞受损，D错误。故选B。
3.正常情况下，机体中细胞分化往往不可逆转。然而，在特定的实验条件下，已分化的细胞被逆转后可恢复全能性状态，或者形成胚胎干细胞系，或者进一步发育成一个新个体。科学家已尝试采用多种方法来制备诱导多能干细胞（iPS细胞）。下列叙述错误的是( )
A.iPS细胞可分化形成多种组织细胞，说明iPS细胞在分裂时很容易发生突变
B.iPS细胞最初是由成纤维细胞转化而来的，后来发现已分化的T细胞、B细胞等也能被诱导为iPS细胞
C.由iPS细胞产生的特定细胞，可以在新药的测试中发挥重要作用，但用于临床治疗中可能存在导致肿瘤发生的风险
D.iPS细胞具有细胞周期，它分化形成的神经细胞一般不具有细胞周期
答案：A
解析：iPS细胞是多能干细胞，可分化形成多种组织细胞，细胞分化的本质是基因选择性表达，与突变的概率没有直接关系，A错误；科学家已尝试采用多种方法来制备iPS细胞，包括借助载体将特定基因导入细胞中，直接将特定蛋白导入细胞中或者用小分子化合物等来诱导形成iPS细胞，最初是由成纤维细胞转化而来的，后来发现已分化的T细胞、B细胞等也能被诱导为iPS细胞，B正确；由iPS细胞产生的特定细胞，可以在新药的测试中发挥重要作用，由于iPS细胞是干细胞，容易分裂，因此用于临床治疗中可能存在导致肿瘤发生的风险，C正确；iPS细胞是胚胎干细胞，因此具有细胞周期，神经细胞是高度分化细胞，不会进行连续分裂，一般不具有细胞周期，D正确。
感谢观看

展开更多......

收起↑