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(共34张PPT)
3.2 课时2 基因表达载体的构建、
将目的基因导入受体细胞、
目的基因的检测与鉴定
1.能阐述基因表达载体构建的流程。
2.能阐述将目的基因导入受体细胞的方式及原理。
3.能阐明目的基因的检测与鉴定所涉及的技术原理。
上节回顾：PCR技术
1.目的
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
2.组成
质粒
（1）启动子
基因的前端，RNA聚合酶识别和结合的部位；驱动基因转录出mRNA
（2）终止子：
限制酶切割位点
基因的尾端，能终止mRNA的转录
（3）标记基因
作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来
复制原点
（4）目的基因
二、基因表达载体的构建
目的基因：能控制表达所需要的特殊性状
启动子：
位置：基因的上游
功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。
复制原点：
DNA复制的起始位点
终止子：
位置：基因的下游
功能：终止转录
标记基因：便于重组DNA分子的筛选和鉴定。
如何构建抗虫棉的基因表达载体？
用一定的限制酶切割载体，使其出现一个切口。
② 用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。
③ 将切下的Bt基因片段拼接到载体的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子。
载体
基因表达载体
3.过程
思考：使用一种DNA限制酶进行切割，共有几种连接情况？
载体
目的基因
自连
片段间的连接
目的基因自连
质粒自连
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
正向连接 反向连接
1
1’
2
2’
1
2
2’
1’
2
2’
1’
1
请结合下图，思考：
（1）构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ限制酶切割质粒？为什么？
不能
因为SmaⅠ切割会破坏质粒的抗生素抗性基因。
质粒上的抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进一步筛选。
（2）只使用EcoRⅠ分别切割质粒和外源DNA，能否构建基因表达载体？
如果能有何弊端？
能
①质粒、目的基因发生自身环化；
②质粒与目的基因会发生反向连接。
（3）与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时
处理质粒、外源DNA的优点是什么？
①可以防止质粒、目的基因的自身环化连接；
②还可以防止目的基因与载体的反向连接。
①载体与表达载体区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。
表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。
②工具酶：限制酶、DNA连接酶，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键。
③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少。
④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。
三、将目的基因导入受体细胞
方法
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
微生物细胞
农杆菌转化法
花粉管通道法
——显微注射法
——Ca2+处理法
我国科学家独创
常用
（1）花粉管通道法（我国科学家独创）
②在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中
目的基因
目的基因
适用生物：开花植物
1.目的基因导入植物细胞
（2）农杆菌转化法
转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。实质是基因重组。
转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
（可转移的DNA）
目的基因
Ti质粒
表
达
载
体
农杆菌
植物细胞
植物细胞
染色体DNA
新性状植株
构建
转入
导入
插入
表达
农杆菌转化法中两次拼接、两次导入的辨析
第一次拼接
第二次拼接
第一次导入
第二次导入
两次拼接：
第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；
第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。
两次导入：
第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌；
第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞。
农杆菌特点：
1.能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力；
2.农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上；
3.利用农杆菌进行转化的方法：
可转移的DNA
2.目的基因导入动物细胞
（1）常用方法：
（2）受体细胞:
显微注射法
受精卵
①体积大，易操作。②易表现出全能性。
（3) 过程：
构建基因表达载体并提纯
利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中
早期胚胎培养
胚胎移植
获得具有新性状的动物
（1）常用方法：
Ca2+处理
原核细胞（常选择大肠杆菌）
目的：可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
（2）受体细胞：
优点：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，易于培养。
3.目的基因导入微生物细胞
Ca2+
感受态细胞
吸收
将目的基因导入受体细胞比较
种类项目 　　 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用方法 农杆菌转化法； 花粉管通道法 显微注射法 Ca2＋处理法
受体细胞 体细胞 受精卵 原核细胞
转化过程 目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→ 导入植物细胞→ 整合到受体细胞DNA中→表达 目的基因表达载体提纯→取受精卵→ 显微注射→ 受精卵发育→ 获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→
感受态细胞→
表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
思考：结合基因表达的过程，推测可以从哪些方面进行检测与鉴定？
Bt基因
mRNA
Bt抗虫蛋白
抗虫棉
PCR等技术检测
抗原 — 抗体杂交技术
分子
水平
抗虫鉴定
（个体水平）
四、目的基因的检测与鉴定
1.分子水平的检测
（1）PCR等技术
检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因
检测目的基因是否转录出了mRNA
将受体DNA/RNA提取出来，进行PCR扩增
在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素做标记，以此作为探针
使探针与PCR扩增后的DNA/RNA进行杂交，如果出现杂交带，就说明目的基因整合到受体生物的染色体DNA上或者转轮出了mRNA
（2）抗原—抗体杂交技术
检测目的基因是否翻译成相应的蛋白质。
1.分子水平的检测
从转基因生物中提取出蛋白质，用相应的抗体进行抗原－抗体杂交，若出现杂交带，则表明目的基因已形成蛋白质产品。
2.个体生物学水平的检测
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐植物
抗除草剂植物
获取目的基因产物的转基因生物
饲喂害虫（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）感染（抗病接种实验）
未出现病斑
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
功能、活性正常
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
1. 在实际种植过程中，棉铃虫是否对转济基因的抗虫棉产生了严重的抗性？证据是什么？
科研人员对长江流域种植的抗虫棉进行了监测，2011年的数据显示，大部分转基因抗虫棉品种的抗虫性属于中抗及高抗水平；2013年的数据表明，如果棉田周围存在大量天然庇护所，靶标害虫棉铃虫、红铃虫等基因的抗虫棉产生明显抗性。在我国、澳大利亚、印度等国的多个实验室中，通过毒抗性筛选，已经培育出多个高抗水平的转基因抗虫棉品种。
到社会中去
2. 科研工作者在没有发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应对，他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗？
(1)基因策略。最早种植的抗虫棉中只转入了一种Bt基因，抗性比较单一；现在经常将两种或两种以上的Bt基因(如 CrylAa和 CryIAc基因)同时转入棉花细胞，这样既可以提高杀虫活性，又可以延缓害虫抗性的产生和发展，还可以通过不同基因间的互补作用扩大抗虫范围。
(2)田间策略。这是在种植时采取的措施，如提供庇护所、与其他作物轮作或套种等。
(3)国家宏观调控策略。该策略包括实施分区种植管理、加强抗性监测、进行严格的安全性评价等。
1.目的基因的筛选和获取-前提
利用PCR获取和扩增
化学方法人工合成
2.构建基因表达载体-核心
目的基因、启动子、终止子、标记基因
3.将目的基因导入受体细胞-关键
农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物) 、
感受态细胞转化法(微生物);
4.目的基因的检测与鉴定-保证
分子检测：是否插入、转录、翻译
个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。
有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。
载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。
才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。
一、概念检测
1. 研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp加整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。
（1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。 （ ）
（2） 构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。（ ）
（3） 只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功。 （ ）
×
×
√
2. 利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是 （ ）
A. PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
B. 变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
C. 复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D. 延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸
D
二、拓展应用
1. 研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。
外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。
2. 八氢番茄红素合酶（其基因用psy表示） 和胡萝卜素脱饱和酶（其基因用crtl表示）参与β-胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和crtl基因转入水稻，使水稻胚乳中富含β-胡萝卜素，由此生产出的大米称为 “黄金大米”。请根据以上信息回答下列问题。
（1）科学家在培育“黄金大米”时，将ctrl 和psy基因导入含pmi基因的质粒中，构建了质粒pSYN 12424。该项研究的目的基因是 ______________ ，标记基因是_____________ ，质粒pSYN 12424的作用______________________ 。
ctrl 基因和psy基因
Pmi基因
将目的基因送入水稻细胞
（2）在构建质粒载体时，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的识别序列？为什么？
不能。如果目的基因序列中含有用到的限制酶的识别序列，限制酶可能将它切断。
（3）请查找相关资料，了解科学家为什么 要培育“黄金大米”以及当前关于“是否要推广 '黄金大米’”的各种争论。你还可以提出自己的看法，并与同学交流讨论。
维生素A在人体内具有非常重要的生理功能，对视力、骨骼生长、免疫功能等都有调节作用。但是，人体不能合成维生素A，需要从食物中摄取。维生素A缺乏症是南亚地区常见的由营养不良导致的疾病，该地区的居民一般以籼稻作为主食。β-胡萝ト素是维生素A的前体，在人体内它可以转化为维生素A。因此，科学家将两个参与β-胡萝ト素合成的酶的基因转入了籼稻中，使其胚乳中富含β-胡萝ト素，期望让人们通过日常食用主食就能补充足够量的维生素A，从而降低维生素A缺乏症的患病率。关于“是否要推广“黄金大米””的争论主要围绕其安全性、有效性等方面展开。

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