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（二）微生物的选择培养和计数
第2节 微生物的培养技术及应用
02
能概述测定微生物数量的常用方法。
03
能尝试完成微生物选择培养及计数实验的操作。
01
能说出选择培养基的类型、配置方式。
学习
目标
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。
回忆必修2开展的“探究抗生素对细菌的选择作用”
一般情况下，一定浓度的抗生素会杀死细菌，但变异的细菌可能产生耐药性。在实验室连续培养细菌时，如果向培养基中添加抗生素，耐药菌有可能存活下来。
通过观察细菌在含有抗生素的培养基上的生长状况，探究抗生素对细菌的选择作用。
一、选择培养基
1.概念：
基础培养基
选择培养基
+某种抗生素
接种培养
培养结果
上述过程能否充分说明该选择培养基具有选择性？
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。
1.概念：
设置基础培养基或完全培养基作为对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数菌多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。
怎么证明一个选择培养基具有选择性？
基础培养基
选择培养基
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。
1.概念：
类型 条件 分离得到的菌种
改变培养条件 高温环境 水生栖热菌等
高盐环境 金黄色葡萄球菌等耐盐菌
添加某种化学物质 加入青霉素 酵母菌、霉菌等真菌
特殊碳源、氮源 尿素是唯一氮源 能分解尿素的微生物
石油是唯一碳源 能消除石油污染的微生物
营养缺陷 不加碳源 自养型微生物
不加氮源 固氮菌
2.选择培养基的类型
常见的分解尿素的微生物：芽孢杆菌、小球菌、棒状杆菌等细菌。
CO(NH2)2+H2O CO2+2NH3
脲酶
3.选择培养基的配方设计
如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
琼脂 20.0g
蒸馏水 定容到1000ml
培养基一
KH2PO4 1.4g
NaH2PO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 定容到1000ml
培养基二
选择哪种培养基更合适？

可作为完全培养基
（起对照作用）
以尿素作为唯一氮源设计选择培养基，可以将分解尿素的细菌分离出来。
1. 如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，
培养基的配方该如何设计？
讨 论:
这种培养基与普通培养基相比，只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。
2. 该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
选择培养基平板准备好，还需要准备什么？
土壤微生物
细菌宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大部分分布在距地表3~8cm的土壤层。铲去表层土3cm左右，取样，将样品装入事先准备好的信封中。
二、微生物的选择培养
土壤收集后能不能直接倒入平板内培养？应该怎么操作？
将土样加入盛有无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，取菌液加入平板内培养。
图1 完全培养基
图2 选择培养基
配制菌液土样时取多少？无菌水加多少？培养时取多少液体？
土壤细菌的数量庞大，要想得到特定微生物的纯培养物，需要对土壤进行充分稀释，然后再将菌液涂布到制备好的选择培养基上。
将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基表面的方法。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落。
稀释涂布平板法
A.梯度稀释菌液 B.涂布平板
主要操作:
(1)样品梯度稀释：
① 在火焰旁称取土壤10g, 加入90ml 无菌水中， 摇匀，制成稀释10倍的土壤菌液。
②取6支试管，分别加入9ml 无菌水。
③ 分别取1ml上清液，加入盛有9ml无菌水的试管中，制成不同稀释倍数的菌液。
1ml 1ml 1ml 1ml 1ml
101
0护取土样，将样
品装入纸袋中。
90mL 无菌水
土壤10g
稀释10倍菌液
102 10 104 10 106 107
6支试管，分别加入9ml无菌水
1ml
4、用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表 面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀
3、将涂布器在火焰上灼烧，待酒 精 燃尽后，冷却8-10 s。
2、 取 0.1ml稀释液，滴加到培养基表面
1、将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中
(2)取样涂布平板：
滴
各梯度分别涂布3个平板
1个不涂布作空白对照
(3)培养与观察 放入37℃恒温箱中培养1～2 d
稀释涂布平板法除可以分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目
在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落
注意事项：
①10g土样加入盛有90mL无菌水中后，已稀释10倍，在计算时，不要忽略；
②由于使用的是选择培养基，所以一般情况下，获得的单菌落即目的菌，但因为有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖，所以还需要进一步验证；
③过程中所有操作都应在酒精灯火焰旁进行；
④将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
(一)间接计数法——稀释涂布平板法
1.原理：在稀释度足够高时，培养基上表面生长的一个单菌落来源于样品稀释
液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，可推测出样品中大约有多少活菌。
2.计数原则
(1)选择菌落数为30-300的平板计数;
(2)同二稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均数；
三、微生物的数量测定
(1)统计的菌落数往往比活菌实际数目少；
(2)统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
3.结果分析
原因:当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
4.计算
每 g 样品中的细菌数=(C÷V)×M
C:某一稀释度下平板上生长菌落数的平均值；
V:涂布平板时吸取的稀释液体积数值(mL);
M: 稀释倍数；
现学现用：某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234,那么每g样品中的菌落数是(涂布平板时所用 稀释液的体积为0.1mL)( )
A.2.34×108 B.2.34×109
C.234 D.23.4
B
实例分析
两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释
倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。
2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、
212、256,该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。
你认为这两位同学的作法正确吗 如果有问题，错在哪
甲：没有重复实验(至少涂布3个平板)
乙：其中一个平板计数结果与其他两个相差太大，操作过程可能出现了错误。
利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。
血细胞计数板常用对相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等；
细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数。
优点：计数方便、操作简单，快速、直观
缺点：统计结果一般是菌数和死菌数的总和，不能区分死菌与活菌，计数节结果比实际值大；个体小的细菌在显微镜下难以观察；不适于对运动细菌的计数。
（二）直接计数——显微镜直接计数法
①原理：
②优缺点：
内容 直接计数法 间接计数法
主要用具 显微镜、细菌计数板或血细胞计数板 涂布器
计数依据 细菌个数 培养基上菌落数
优点 计数方便、操作简单 计数的是活菌
缺点 不能区分死菌与活菌 当两个或多个菌体连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落
计算公式 每毫升原液含菌株数＝每小格平均菌株数×400×1 0000×稀释倍数 每克样品中的菌株数：(C ÷ V）× M
C：某稀释度下平板上生长的平均菌落数；V：涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)；M：稀释倍数
结果 比实际值偏大 比实际值偏小
1.实验目的
（1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌。
（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。
2.实验原理
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分离尿素的细菌。
CO(NH2)2+H2O
脲酶
2NH3+CO2
组分 含量
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
琼脂 15.0g
H2O 定容至1000mL
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
3.实验流程：
样品稀释涂布平板
微生物的培养与观察
菌落计数
土壤取样
制备培养基
1.结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。
2.你是否获得了某一稀释度下菌落数为30～300的平板 在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近
3.你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少 与其他同学统计的结果接近吗 如果差异很大，可能是什么原因引起的
如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。如果接种后的完全培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。
如果得到了两个或多个菌落数为30～300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。
如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。
思考：
微生物的数量测定
选择培养基的作用
微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法
微
生
物
的
选
择
培
养
和
计
数
选择培养基
微生物的选择培养
科学实例
筛选原则
选择培养基的概念及举例
稀释涂布平板法的操作过程
间接计数法 — 稀释涂布平板法
直接计数 —计数板计数法
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
培养基的制备
实验设计
（1）土壤取样
（2）样品的稀释
（3）稀释涂布平板法接种
（4）微生物的培养与观察
实验结果
1. 研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌，判断下列相关表述是否正确。
（1）这种培养基是一种选择培养基。（ ）
（2）利用这种石油降解菌可以降解石油，修复土壤。（ ）
（3）相对于未被污染的土壤，从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。（ ）
2. 用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，原因是（ ）
A. 菌落中的细菌数目是固定的
B. 平板上的一个菌落就是一个细菌
C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同
D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
√
√
√
D
一、概念检测
3. 下列有关稀释涂布平板法计数和显微镜直接计数法计数的叙述，不正确的是( )
C
A.利用血细胞计数板计数属于显微镜直接计数法，其缺点是不能区分死菌与活菌
B.两种计数方法，其统计值与实际值相比，均有差异，但差异原因不同
C.两种计数方法均能在计数的同时观察到所研究微生物的形态特征
D.当菌落数目稳定时，一般选取菌落数在 的且差异不大的平板进行计数
4. 如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离
和计数”实验中样品稀释示意图。据图分
析错误的是( )
C
A.某一稀释度下至少涂3个平板，该实验方法统计得到的结果常会比实际活菌数目少
B.利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌
C.5号试管的实验结果表明每克土样中能分解尿素的细菌数为 个
D.该实验需设置牛肉膏蛋白胨培养基作对照，用以判断选择培养基是否有选择作用
(1)现在要从土壤中分离纤维素分解菌，请你给出详细的实验方案。
(2)你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？
可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。
(3)有同学说，可以把滤纸埋在土壤中，经过一段时间后，再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。
可行，这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境,腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。
二、拓展应用

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