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第1节 植物细胞工程
一、植物细胞工程的基本技术
02
能解释植物组织培养技术和植物体细胞杂交技术原理。
03
能说明菊花的组织培养流程。
01
能阐明植物细胞工程的理论基础。
细胞工程是指应用细胞生物学、分子生物学和发育生物学等多学科的原理和方法，通过细胞器、细胞或组织水平上的操作，有目的地获得特定的细胞、组织、器官、个体或其产品的一门综合性的生物工程。
1902年，哈伯兰特提出了细胞全能性的理论，但相关的实验尝试没有成功
1958年，斯图尔德等发现胡萝卜的体细胞可以分化为胚，为细胞全能性理论提供了强有力的支持
1960年，科金用真菌的纤维素酶分解番茄根的细胞壁，成功获得了原生质体
1964年，古哈等在培养毛曼陀罗的花药时，首次得到了由花药中的花粉粒发育而来的胚
1971年，卡尔森诱导烟草种间原生质体融合，获得了第一株体细胞种间杂种植株
1974年，土壤农杆菌的Ti质粒被发现，之后，该质粒应用于植物分子生物学领域，促进了植物细胞工程与分子生物学技术的紧密结合
细胞工程
“其茅葺，其叶青青，犹绿衣郎，挺节独立，可敬可慕。迨夫开也，凝情瀼露，万态千妍，薰风自来，四坐芬郁，岂非真兰室乎！岂非有国香乎！”这是我国历史上第一部兰谱—《金漳兰谱》的跋文中对兰花的一段描述。从古至今，我国人民都把兰花看作高洁、典雅的象征，很多人喜欢养兰花。但是，兰花种子通常发育不全，在自然条件下萌发率极低；传统分株繁殖的方法又存在繁殖周期长、繁殖率低等问题，如果靠自然繁殖，兰花的价格可想而知了。如何能让名贵的兰花大量、快速地繁殖，从而走入寻常百姓家呢？
兰花是观赏植物中最常见的一类依靠植物组织培养繁育种苗的植物，其组培苗的数量约占观赏植物组培苗总量的40%
利用植物组织培养技术可以大量、快速地培育兰花。
从社会中来
细胞经分裂和分化后，仍然具有__________________或____________________的潜能。
产生完整生物体
分化成其他各种细胞
生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套 ，都有发育成为完整个体所必需的全部 。从理论上讲，生物体的每一个活细胞都应该具有全能性。
遗传物质
基因
回忆：细胞的全能性
2. 细胞具有全能性的原因
1. 概念
在特定的时间和空间条件下，细胞中的基因会 。
【思考】为什么生物体内细胞并没有表现出全能性，而是分化成为不同的组织器官？
选择性地表达
细胞分化的实质：基因的选择性表达
【思考】细胞具有全能性一定会表现出全能性吗？
①离体
②一定的营养物质
⑤适宜的培养条件（温度、pH等）
具有全能性≠表现出全能性
——植物组织培养技术的理论基础之一
④适宜比例的植物激素
③严格的无菌条件
3. 植物细胞表现出全能性的条件：
回忆：细胞的全能性
将________的植物器官、组织或细胞等，培养在___________________上，给予适宜的培养条件，诱导其形成__________的技术。
离体
人工配制的培养基
完整植株
外植体
植物细胞的全能性
外植体
脱分化
愈伤组织
再分化
芽、根等
试管苗
壮苗、
驯化移栽
完整植株
【思考】植物组织培养是否遵循孟德尔定律？
×
一、植物组织培养技术
1. 概念
2. 理论基础/原理：
3. 一般过程：
移栽成活
脱分化
再分化
再分化
先芽后根
愈伤组织：离体的植物器官、组织或细胞，在培养一段时间以后，通过脱分化，形成一种排列疏松无规则、高度液泡化、无定形态的薄壁细胞组成的组织。
◆脱分化：让已经分化的细胞经过诱导后，失去其特有的结构和功能，转变成未分化细胞的过程。
◆再分化：脱分化产生的愈伤组织，在一定的培养条件下，再分化出芽、根等器官，进而形成完整的小植株。
内容 脱分化 再分化
过程 外植体 愈伤组织 愈伤组织 幼苗
形成体特点 排列疏松、高度液泡化的薄壁细胞 有根、芽
需要条件 a.离体 b.适宜的营养 c.生长素与细胞分裂素 d.一般不需光 a.离体
b.适宜的营养
c.生长素与细胞分裂素的比例适中
脱分化和再分化的比较
使用顺序 实验结果
先使用生长素 后使用细胞分裂素 有利于细胞分裂
先使用细胞分裂素， 后使用生长素 细胞既分裂也分化
同时使用 分化频率提高
简记为：先“生”分裂不分化，后“生”分裂又分化，同“使”分化频率高 （1）按照不同的顺序使用这两类激素，会得到不同的实验结果
生长素和细胞分裂素对植物培养的影响
（2）当同时使用这两类激素时，两者用量比例影响植物细胞的发育方向
生长素/细胞分裂素 植物细胞的发育方向
高 有利于根的分化、抑制芽的形成
低 有利于芽的分化、抑制根的形成
适中 促进愈伤组织的生长
简记为：“高”根，“低”芽，“中”愈伤 注意：由愈伤组织进行细胞分化时，一般要先诱导其生芽，然后诱导其生根，可通过控制培养基中生长素和细胞分裂素的比例来实现
将流水充分冲洗后的外植体(幼嫩的茎段)用_______消毒30 s，然后立即用________清洗2～3次后，再用_______________处理30 min后，立即用__________清洗2～3次。
酒精
次氯酸钠溶液
用酒精擦拭双手和超净工作台
探究 实践：菊花的组织培养
无菌水
无菌水
过程：
1. 外植体的消毒
将消过毒的外植体置于无菌的培养皿中，用无菌滤纸吸去表面的水分。用解剖刀将外植体切成0.5-1 cm长的小段。
在_______________旁，将外植体的1/3～1/2插入________________的培养基中。用封口膜或瓶盖封盖瓶口，并在培养瓶上做好标记。
酒精灯火焰
诱导愈伤组织
IAA/CTK≈1
2. 外植体的分割
3. 接种
将接种了外植体的锥形瓶或植物组织培养瓶置于____________的_________中培养。定期观察和记录_____________的生长情况。
培养箱
愈伤组织
脱分化避光
有光时，往往容易形成维管组织，而不易形成愈伤组织。
愈伤组织培养
18～22 ℃
4. 培养
将生长良好的愈伤组织转接到____________的培养基上。长出芽后，再将其转接到____________的培养基上，进一步诱导形成试管苗。
诱导生芽
诱导生根
IAA/CTK<1
IAA/CTK>1
5. 转移培养
移栽前先打开封口膜或瓶盖，让试管苗在培养箱内生长几日。用流水清洗掉根部的培养基后，将试管苗移植到消过毒的____________________上，壮苗后再移栽入土。
蛭石或珍珠岩
6. 移栽
1．实验中使用的培养基和所有的器械都要灭菌。接种操作必须在酒精灯火焰旁进行，并且每次使用后的器械都要灭菌。
2．接种时注意外植体的方向，不要倒插。
3．诱导愈伤组织期间一般不需要光照，在后续的培养过程中，每日需要给予适当时间和强度的光照。
▲注意
防止杂菌污染，因为杂菌生长快，会和培养物争夺营养。杂菌生长过程中会产生有害的物质，导致培养物迅速死亡。
【思考】为什么要强调所用器械的灭菌和实验人员的无菌操作？
形态学下端插入培养基
脱分化避光，
再分化需光。
1. 接种3 - 4 d后，检查外植体的生长情况，统计由多少外植体被污染，有多少能正常生长，并分析他们被污染的原因。
用于植物组织培养的培养基同样适合某些微生物的生长，如细菌、真菌等，培养物一旦收到污染，就会导致前功尽弃，因此要进行严格的无菌操作。导致外植体被污染的原因可能是：培养基、接种工具灭菌不彻底；外植体消毒不彻底；操作过程不符合无菌操作要求等。
结果分析与评价
2. 你培养出愈伤组织了吗？如果培养出来了，从刚接种的外植体到长出愈伤组织经历了多少天？这些愈伤组织进一步分化出芽和根了吗？
观察实验结果，看看是否培养出了愈伤组织，记录多长时间出了愈伤组织。从刚才接种的外植体到长出愈伤组织一般需要2周左右的时间。统计更换培养基后愈伤组织进一步分化成芽和根的比例和时间。
3.观察外植体的分化情况，填好结果记录表，并及时分析结果。
做好统计和对照，填好结果记录表，培养严谨的科学态度。从实验的第一步开始就要做好实验记录，可以分组配制不同的培养基，如诱导愈伤组织的培养基，诱导生芽的培养基等，可以进行不同配方的比较。
生根苗移栽技术的关键是既要充分清洗根系表面的培养基，又要不能伤及根系。多使用无土栽培的办法，培养基质要提前消毒，可以向培养基质喷洒质量分数为5%的高锰酸钾，并用塑料薄膜覆盖12h。掀开塑料薄膜24h后才能移栽。
4.你培育的幼苗移栽到露地后，能够正常生长吗？
欲培育地上长番茄和地下结马铃薯的“超级作物”。你有什么好妙招？？？
利用传统有性杂交方法能实现吗？为什么？
不能。因为不同种生物之间存在着生殖隔离
于是，这些科学家试图用这两种植物的体细胞进行杂交，来实现这一美妙的设想。
将___________的植物体细胞，在一定条件下融合成____________，并把____________培育成____________的技术。
不同来源
杂种细胞
新植物体
杂种细胞
①细胞膜的流动性
（原生质体融合）
②植物细胞的全能性
（杂种细胞形成杂种植物）
生长期短，
耐热、易贮藏
普通小麦-长穗偃[yǎn]麦草、白菜-甘蓝等
二、植物体细胞杂交技术
1. 概念
2. 融合实例:
3. 原理:
①物理法：__________法、_________法等。
纤维素酶
和果胶酶
去除细胞壁
去除细胞壁
A细胞
B细胞
A原生质体
B原生质体
正在融合的原生质体
诱导原生质体融合的方法
电融合
②化学法：__________________融合法、
__________________融合法等。
聚乙二醇(PEG)
离心
选必三 P37
高Ca2＋－高pH
4. 过程
诱导
脱分化
移栽后的植株
克服不同种生物_________________的不亲和性。
远缘杂交
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种等方面展示出独特的优势。
植物体细胞融合成功的标志
再生出细胞壁
愈伤组织
杂种植株
诱导
脱分化
4. 过程
5.意义:
体细胞融合成功后培养基中会有多种细胞类型(A、B、AA、BB、AB、AAA、BBB、AAB等)，其中两两融合细胞类型有3种(AA、BB、AB)，而真正符合要求的是AB，因此要对融合细胞进行筛选。
【思考】细胞融合后，共有几种细胞类型？融合细胞有几种，符合要求的是哪种？
名称 植物组织培养 植物体细胞杂交
原理
选材
技术操作
意义
关系 植物细胞的全能性
细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性
选取根尖、茎尖、形成层部位最容易诱导脱分化
不同植物细胞融合后形成的杂种细胞
脱分化、再分化等
杂种细胞形成、植物组织培养
植物组织培养是植物体细胞杂交的基础，植物体细胞杂交所用的技术更复杂
植物组织培养和植物体细胞杂交的比较
保持优良性状，繁殖速度快，可大规模生产
克服远源杂交不亲和的障碍
过程
植物组织培养和植物体细胞杂交的比较
1．下面是植物组织培养过程，相关说法正确的是(　 )
A.上述植物组织培养的过程依据的生物学原理是植物细胞具有全能性
B.需要对外植体进行严格的灭菌处理，以防止杂菌污染
C.外植体若是月季的花药，则图中的①过程需要光照
D.外植体若是菊花的根尖组织，因细胞中没有叶绿体，故培养成的新植株叶
片无色
A
外植体① → 愈伤组织② → 长出丛芽③ → 生根④ → 移栽成活
2．为探究矮牵牛原生质体的培养条件和植株再生能力，某研究小组的实验过程如下图。下列叙述正确的是(　　)
A．过程①获得的原生质体需悬浮在30%蔗糖溶液中
B．过程②需提高生长素的比例以促进芽的分化
C．过程③需用秋水仙素处理诱导细胞壁再生
D．原生质体虽无细胞壁，但仍保持细胞的全能性
D
3．下图是植物体细胞杂交过程示意图，如果A、B植物均为二倍体，据图分析回答：
(1)图中所示过程的原理有____________________________________________。
(2)图中的①过程是__________________________。
(3)植物体细胞融合成功的标志是____________________，其产生与细胞内____________________(细胞器)有关。
细胞膜具有流动性、植物细胞具有全能性
(去壁)制备原生质体
形成新的细胞壁
高尔基体
(4)③和④过程分别是__________和_________过程。该杂种植株有____个染色体组。
(5)该技术最显著的优势是________________________________。
3．下图是植物体细胞杂交过程示意图，如果A、B植物均为二倍体，据图分析回答：
脱分化
再分化
4
克服远缘杂交不亲和的障碍

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