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第2节 微生物的培养技术及应用
（一）微生物的基本培养技术
01
能阐明无菌技术的类型、适用范围和操作方法。
02
能概述不同类型培养基的特点及适用场景。
03
能尝试完成微生物的纯培养实验的操作。
一些人会在家里自制酸奶。自制酸奶虽然方便，但是食用自制酸奶导致肠胃不适的事例屡见不鲜，主要原因是在制作过程中有杂菌混入。那么，怎样才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物中呢？
防止杂菌污染，获得纯净的微生物
实验室培养微生物的需要做到？
从社会中来
实验室培养微生物
培养基
确保其它微生物无法混入
分离需要的微生物
无菌技术
纯化培养
提供微生物生长繁殖所需营养和环境条件
从社会中来
1.培养基的概念和作用
（1）概念：
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，
即培养基。
（2）培养基的作用：
用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
一、培养基的配制
2. 培养基分类
按物理性质
液体培养基
固体培养基
琼脂
无动力 有动力(弥散)
半固体培养基
化学 成分来源
划分 培养基种类 特点 用途
功能用途划分
含化学成分不明确的天然物质
工业生产
分类、鉴定
天然培养基
合成培养基
用已知成分的化学物质配制
在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长
培养、分离出特定微生物
培养基中加入能与目的菌的代谢产物发生显色反应的指示剂，用以鉴别不同种类的微生物
鉴别不同种类微生物
选择培养基
鉴别培养基
【任务一】
结合提供的资料和教材中“表1-1 1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成”，分析培养微生物的培养基的种类和营养构成。
组分 含量 提供的主要营养
牛肉膏 5g 碳源、磷酸盐和维生素
蛋白胨 10g 氮源和维生素等
NaCl 5g 无机盐
H2O 定容至1000mL 水
3.培养基的配制
(1)基本成分：
碳源、氮源、水、无机盐
①碳源
无机碳源：
有机碳源：
CO2、CO32-、HCO3-
葡萄糖等糖类、油/脂肪、石油等
自养
异养
②氮源
无机氮源：
有机氮源：
NH4＋、NO3-、硝酸盐、铵盐
尿素、玉米浆、蛋白胨等
③水
④无机盐：
磷酸盐、Ca、Mg、K、Na、Fe、微量元素等
为什么培养基需要氮源？
培养基中的氮元素是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的。
(2) 还需满足微生物对 pH、特殊营养物质、氧气的需求
培养乳酸菌需要添加维生素
培养霉菌时需将PH调至酸性，培养细菌时将PH调至中性或微碱性
培养厌氧微生物时需要提供无氧条件
生长因子:
通常是指微生物自身不能合成或合成量不足，但又是微生物生长和代谢所必需的小分子。
如某些维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等。酵母浸粉、牛肉浸膏或植物组织提取液等天然物质中含有不同的生长因子。
微生物 碳源 氮源 能源
蓝细菌
硝化细菌
根瘤菌
大肠杆菌
CO2
NH4＋、NO3-等
光能
CO2
NH3
NH3的氧化
糖类等有机物
N2
有机物
糖类、蛋白质等有机物
蛋白质等
有机物
1.自养型微生物与异养型微生物培养基的主要差别在于 ；
2.无机氮源不但能给自养型微生物提供 ，也能作为 ，
3.含有C、H、O、N的有机物可作为 微生物的碳源、氮源、能源；
碳源
氮源
能源物质
异养型
完成下面表格并分析：
4. 常见的细菌培养基 —— 牛肉膏蛋白胨培养基
组分 含量 提供的主要营养
牛肉膏 5g
蛋白胨 10g
NaCl 5g
H2O 定容至1000mL 水
1000mL牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成
碳源、氮源、磷酸盐和维生素等
氮源、碳源和维生素等
无机盐
微生物接种操作时为什么要“全副武装”和在专门的设备内进行？
二、无菌技术
1.获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染。
2.无菌技术应围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括消毒和灭菌。
①消毒
课外拓展
芽孢：
有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫作芽孢。
芽孢壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。
孢子：
细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖或休眠作用的生殖细胞。能直接长成新个体。
课外拓展
消毒
(1) 煮沸消毒法
针对某些实验器具、餐具、饮用水等，在100℃下煮沸5~6 min，可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢。
(2) 巴氏消毒法
62~65℃下煮 30 min或80 ~90℃ 处理 30s~1min，适合不耐高温的液体，如牛奶。可以杀死牛奶中的绝大多数微生物，并且不破坏牛奶的营养成分。
(3) 化学药物消毒法
(4) 紫外线消毒法
紫外线可以使蛋白质变性并损伤生物的DNA。接种室、接种箱或超净工作台可用紫外线照射30min。在照射前，适量喷洒石碳酸或煤酚皂溶液等消毒液，加强消毒效果。
70％-75%酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等。
灭菌
(1) 湿热灭菌
这是一种利用沸水、流通蒸汽或高压蒸汽进行灭菌的方法。其中高压蒸汽灭菌效果最好。实验室常用高压蒸汽灭菌锅，就是以水蒸气为介质在压力为100kPa、温度为121℃条件下，维持15~30min来灭菌的。
(2) 干热灭菌
将灭菌物品放入密闭容器如干热灭菌箱，在160~170℃的热空气中维持2~3h可以达到灭菌的目的。耐高温的和需要保持干燥的物品，如玻璃器皿（如吸管、培养皿）、金属用具等，可以采用这种方法灭菌。
(3) 灼烧灭菌
类型 理化因素作用强度 消灭微生物数量 芽孢和孢子能否被消灭
消毒
灭菌
较为温和
强烈
部分微生物
全部微生物
一般不能
能
1. 比较消毒和灭菌对微生物作用效果的差异
2.无菌操作的对象是什么？
培养皿
接种环
培养基
操作的空间、操作者的衣着和手等
讨 论：
1. 牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是什么？
在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少。
2 .为什么体积分数为70%～75%的酒精杀菌效果最好？
若酒精浓度过高，菌体表面蛋白质变性过快而凝固成一层保护膜，酒精不能渗入其中；若酒精浓度过低，杀菌能力减弱。
3. 无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么作用？
无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。
想一想：
3.防止杂菌污染的措施
（1）实验前：
①对操作空间、操作人员消毒；
②对所用器皿、接种用具和培养基灭菌。
①避免已灭菌处理材料用具与周围物品接触造成污染；
②为避免周围微生物污染，实验操作都应在超净工作台并在酒精灯火焰旁进行。
（2）操作时：
（3）实验后：
使用后的培养基在丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。
湿热灭菌（高压蒸汽灭菌）
干热灭菌
灼烧灭菌
化学药物消毒（酒精）
紫外线消毒
巴氏消毒法
1.以下所采用的灭菌或消毒方法依次是
化学药物消毒（次氯酸钠）
培养基
培养皿
接种环
实验操作者的双手
实验室
牛奶
有活性生物材料
平板划线法 稀释涂布平板法
1.原理：采用平板划线法和稀释涂布平板法能将单个微生物分散在固体培养基上，经培养得到的单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。
微生物群
分散或稀释
单个细胞
单个菌落
繁殖
2.获得单菌落的方法：
探究 · 实践：酵母菌的纯培养
酵母菌菌落：
湿润，粘稠，易挑起，表面光华，比细菌的菌落大而厚。
三、微生物的纯培养
去皮
切块
加水
(1000mL)
加热煮沸
软烂
马铃薯
纱布过滤
加琼脂
（15～20g）
酵母菌
培养基
加水定容
(1000mL)
称取马铃薯
(200g)
马铃薯块
滤液
加葡萄糖/蔗糖
（20g）
调pH
①
②
3.方法步骤：
第1步 制备培养基 ：配制培养基
制备培养基
接种与分离
培养
培养基——高压蒸汽灭菌
转移
灭菌15~30min
皮筋勒紧
包牛皮纸
放入高压蒸汽灭菌锅中（100kPa、121℃）
酵母菌培养基
锥形瓶
加棉塞
高压蒸汽灭菌锅
1. 避免因水蒸气凝结而浸湿棉塞。
2. 避免再次污染
第2步 灭菌
培养皿——干热灭菌
灭菌2h
几层牛皮纸包紧
放入干热灭菌箱（160～170℃）
5～8套培养皿
干热灭菌箱
培养基冷却到50℃左右，在酒精灯火焰附近倒平板。
1
拔出锥形瓶的棉塞。
2
将瓶口迅速通过火焰。
3
用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基倒入培养皿（10～20mL），立即盖上皿盖。
4
等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒过来放置。
1.防止培养基水分蒸发。
2.防止皿盖上冷凝水滴落，造成污染。
通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
不能完全打开，以免杂菌污染培养基。
第3步 倒平板：
（1）培养基灭菌后，需冷却至50 ℃左右时才能倒平板，温度过高会烫手，温度过低培养基又会凝固。
（2）整个操作在酒精灯火焰旁附近进行，避免周围环境中微生物的污染。
（3）平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
（4）倒平板时不要将培养基溅在皿盖与皿底之间，否则此培养基不能用来培养微生物，因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
（5）将所倒平板放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底。
【倒平板的注意事项】
倒平板注意事项：
①温度：50℃左右
②操作：在酒精灯火焰附近
③冷凝后平板倒置
分离的方法
——平板划线法
通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。经过数次划线后培养，可以分离到单菌落。
连续划线法
分区划线法
第4步 接种和分离酵母菌
平板划线法的具体操作
1
将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环的金属丝烧红。
2
在火焰旁冷却接种环。同时，拔出装有酵母菌培养液的试管的棉塞。
将试管口通过火焰。
3
4
在火焰附近用接种环蘸取一环菌液。
防止温度太高杀死菌种。
5
将试管口通过火焰，并塞上棉塞。
在火焰附近将皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面基表面迅速划三至五条平行线，盖上皿盖。
6
灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。注意不要将最后一次的划线与第一次的划线相连。
7
将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面，经数次划线后培养，可以分离得到单菌落。
1. 划五次线，接种环需要灼烧几次？
1
2
3
4
5
第1次划线
接种环灭菌
第2次划线
接种环灭菌
第3次划线
接种前接种环灭菌
接种环灭菌
第4次划线
接种环灭菌
第5次划线
接种环灭菌
需要灼烧6次。
【思考与讨论】
2. 为什么每次划线之前都要灼烧接种环？
第一次划线前：杀死接种环上的微生物，避免污染培养物。
第二次及以后划线前：杀死上次划线时残留菌种，保证每次划线菌种来自上次划线末端。
3. 划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？
杀死残留菌种，避免污染环境和感染操作者。
4. 第二次及以后的划线时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
5. 为什么不能将最后一次的划线与第一次的划线相连？
将聚集的菌种逐步稀释，以便获得单菌落。
线条末端酵母菌的数目比起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使酵母菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到单菌落。
菌种经数次划线后培养，分离得到单菌落。
第一次划线酵母菌数量多，最后一次划线酵母菌数量少，首尾相连，不容易得到单个菌落。
第5步 培养酵母菌
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右（培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异）的恒温培养箱中培养24~48h。
在实验室中，切不可吃东西、喝水，离开实验室时一定要洗手，以防止被微生物感染。使用后的培养基在丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。
警示
对照：说明培养基是否被杂菌污染。
未接种的培养基是不能有菌生长的，如果有菌生长，则说明受到污染或者灭菌不彻底。
正确的做法是，配好培养基之后，将培养基放在温箱里培养24小时观察，长菌的培养基应该丢弃，无菌生长的方能使用。这样做的另一个好处是将培养基水蒸发干，不会对微生物的培养产生影响。
(1)在未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有，说明了什么？
(2)如果你观察到了不同形态的菌落，你认为可能是由哪些原因引起的？
可能是接种的菌种不纯、培养基灭菌不彻底，或接种过程中感染了杂菌。
4.结果分析与评价
培养基的类型
培养基的营养物质
——消毒、灭菌
微生物的基本培养技术
培养基
无菌技术
基本成分：碳源、氮源、水、无机盐
特殊需求：维生素（如乳酸杆菌）、碱基等
微生物的纯培养
制备培养基
接种与分离
培养
平板划线法

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