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课时2　赋予生物新的遗传特性的基因工程
重点1　基因工程和蛋白质工程
【知识盘查】
1.归纳基因工程的基本工具
提醒　若用不同的限制酶切割出不同的黏性末端，则能使目的基因和载体定向连接，避免自身环化和反向连接，提高连接的有效性。
2.理解掌握基因工程的操作步骤
(1)目的基因的筛选与获取
(2)基因表达载体的构建——重组质粒的构建
提醒　①启动子和终止子：启动子(DNA片段)≠起始密码子(位于mRNA上)；终止子(DNA片段)≠终止密码子(位于mRNA)上。
②目的基因插入位置：启动子与终止子之间。
③利用乳腺生物反应器生产药物时，应将目的基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起。
(3)将目的基因导入受体细胞
(4)目的基因的检测与鉴定
提醒　PCR技术不仅可用于获取和扩增目的基因，还能用于检测受体细胞中是否含有目的基因或受体细胞中的目的基因是否转录出mRNA。
3.图示法解读蛋白质工程
【曾经这样考】
1.(2023·新课标卷，6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(　　)
A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接
B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA连接酶连接
2.(2024·江西卷，12)γ－氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L－谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L－谷氨酸脱羧是高效生产γ－氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如下图方法将酿酒酵母S的L－谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E.coliA，构建了以L－谷氨酸钠为底物高效生产γ－氨基丁酸的菌株E.coliB。下列叙述正确的是(　　)
A.图中表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB
B.E.coliB发酵生产γ－氨基丁酸时，L－谷氨酸钠的作用是供能
C.E.coliA和E.coliB都能高效降解γ－氨基丁酸
D.可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒
3.(2023·重庆卷，12)某小组通过PCR(假设引物长度为8个碱基，短于实际长度)获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切(如下图)，再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是(　　)
A.实验所用引物，其中一个序列为5′－TGCGCAGT－3′
B.步骤①所用酶是SpeⅠ和CfoⅠ
C.用步骤①的酶对载体进行酶切至少获得了2个片段
D.酶切片段和载体连接时可使用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶
4.(2024·新课标卷，35)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的结合位置、片段甲替换区如下图所示，→表示引物5′→3′方向。回答下列问题。
(1)限制酶切割的化学键是________。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是__________________________________________________________
________________________________________________________________。
(2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G—C和____________________。
(3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是____________；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是________________________________________________________________。
(4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是_________________________________________________________________
___________________________________________________(答出2点即可)。
【还会这样考】
1.(2024·九省联考甘肃卷，15)胰岛素可用于治疗糖尿病，我国科学家打破国外技术垄断，研发了拥有自主知识产权的重组人胰岛素药物，下列叙述错误的是(　　)
A.用PCR技术扩增人胰岛素基因时，每次循环包括变性、复性、延伸三步
B.构建人胰岛素基因表达载体时，需使用限制性内切核酸酶和DNA连接酶
C.大肠杆菌细胞经Ca2＋处理后，更容易吸收重组的人胰岛素基因表达载体
D.抗原－抗体杂交法不能检测人胰岛素基因表达载体是否导入大肠杆菌细胞
2.(2024·重庆市质量检测)烟草是我国一些地区的经济作物之一，提高烟草质量有利于提高经济收入。我国科研团队研究了一种转基因抗盐烟草新品种，抗盐基因的结构和获得转基因抗盐烟草新品种的过程(①～⑤)如图所示。回答下列问题：
(1)获得转基因抗盐烟草新品种过程中利用的生物技术有__________________________________________________________________
____________________________________________________(答出2项)等。
(2)为确保目的基因定向插入质粒，应该选择限制酶________________切割含目的基因的DNA和质粒。在培养基中加入____________(填“氨苄青霉素”或“四环素”)以便于重组DNA分子的筛选。
(3)培育转基因抗盐烟草新品种的核心工作是图中过程________(填序号)。过程②③采用的方法是________。
(4)过程⑤需要用到________________________等植物激素，在诱导愈伤组织分化成幼苗的过程中，这两种植物激素的比例会发生变化，原因是
_______________________________________________________________
________________________________________________________________。
3.(2024·湖南雅礼中学调研)金属硫蛋白(MT)是一类低分子量、富含半胱氨酸、具有金属结合能力的普遍存在于生物体内的金属结合蛋白，具有多种生物学功能。近年来，因其与Zn、Cu、Cd等金属的结合能力较强而用于生态修复。科研人员成功地将人MT蛋白基因用农杆菌转化法转入番茄，成功培育转基因番茄。回答下列问题：
注：T－DNA中标出的启动子在真核细胞中表达。
(1)感受态农杆菌的制备：取保存的农杆菌菌落用________接种于相应的液体培养基中，并置于________中进行振荡培养，完成菌种的活化和扩大培养；取适量菌液置于CaCl2溶液中处理，制得感受态农杆菌。
(2)目的基因的获取和转化：取人肝脏细胞，破碎后提取mRNA，在逆转录酶的作用下形成cDNA，经PCR扩增后的产物与Ti质粒连接形成重组质粒(如图)，将其与制备好的感受态农杆菌混合，使外源DNA转入细胞；经适宜条件培养一段时间，再加入适宜浓度的________筛选出转化的农杆菌。
(3)转化番茄：取番茄子叶进行________(填“消毒”或“灭菌”)处理后切段，再与转化的农杆菌菌液进行共培养，一段时间后，取出子叶放在________上吸取多余菌液，再将子叶放在适宜的以____________培养基为基础配制的培养基中进行培养。
(4)育成转基因番茄：取上述处理的番茄子叶先经________过程形成愈伤组织，将愈伤组织接种到含有特定激素的培养基上，就可以诱导其________成胚状体，长出________，进而发育成完整的番茄植株。
(5)转基因番茄性状的检测和生产应用：为了检测番茄中是否成功导入目的基因，可依据________________________设计引物进行PCR扩增，再用凝胶电泳技术进行检测，进行此实验的同时应以____________________________作为阴性对照，以导入Ti质粒的番茄作为阳性对照；已知某转基因番茄植株能大量吸收Zn、Cd等，且这些金属元素主要富集在根，生产应用时需对其定期拔除并实施无害处理，原因是_______________________________________________________
_______________________________________________(答出2点即可)。
4.(2024·湖南卷，21)百合具有观赏、食用和药用等多种价值，科研人员对其进行了多种育种技术研究。回答下列问题：
(1)体细胞杂交育种。进行不同种百合体细胞杂交前，先用________________________去除细胞壁获得原生质体，使原生质体融合，得到杂种细胞后，继续培养，常用________________________(填植物激素名称)诱导愈伤组织形成和分化，获得完整的杂种植株。
(2)单倍体育种。常用______________的方法来获得单倍体植株，鉴定百合单倍体植株的方法是____________________________________________________
_________________________________________________________________。
(3)基因工程育种。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因pL，该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图，其中基因gus编码GUS酶，GUS酶活性可反映启动子活性。
①研究病原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取L，首先选用____________酶切，将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接，再导入烟草。随机选取3组转基因成功的烟草(P1、P2和P3)进行病原微生物胁迫，结果如图c。由此可知：三种病原微生物都能诱导pL的活性增强，其中________的诱导作用最强。
②现发现栽培种百合B中也有L，但其上游的启动子与野生百合不同，且抗病性弱。若要提高该百合中L的表达量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，简要写出实验思路_______________________________________________
____________________________________________________________________。
重点2　PCR技术及应用
【知识盘查】
1.PCR技术原理与条件
2.PCR技术的过程
提醒　可通过引物控制PCR扩增的基因片段，并在基因两侧引入限制酶识别序列。
3.DNA的粗提取与鉴定
4.DNA片段的电泳鉴定
【曾经这样考】
1.(2024·安徽卷，14)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是(　　)
A.实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低
B.利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA
C.DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物
D.将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质
2.(2024·新课标卷，5)某种二倍体植物的P1和P2植株杂交得F1，F1自交得F2。对个体的DNA进行PCR检测，产物的电泳结果如图所示，其中①～⑧为部分F2个体，上部2条带是一对等位基因的扩增产物，下部2条带是另一对等位基因的扩增产物，这2对等位基因位于非同源染色体上。下列叙述错误的是(　　)
A.①②个体均为杂合体，F2中③所占的比例大于⑤
B.还有一种F2个体的PCR产物电泳结果有3条带
C.③和⑦杂交子代的PCR产物电泳结果与②⑧电泳结果相同
D.①自交子代的PCR产物电泳结果与④电泳结果相同的占1/2
3.(2024·山东卷，5)制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP)的反应管①～④中，分别加入如表所示的适量单链DNA，已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有(　　)
反应管 加入的单链DNA
① 5′—GCCGATCTTTATA—3′3′—GACCGGCTAGAAA—5′
② 5′—AGAGCCAATTGGC—3′
③ 5′—ATTTCCCGATCCG—3′3′—AGGGCTAGGCATA—5′
④ 5′—TTCACTGGCCAGT—3′
A.①② B.②③
C.①④ D.③④
4.(2023·江苏卷，22)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：
(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有________，扩增程序中最主要的不同是________。
(2)有关基因序列如图2。引物F2－F、F1－R应在下列选项中选用________。
EGFP基因序列：5′ATGGTGAGCAAGGGC—GACGAGCTGTACAAG3′
AnB1基因序列：5′CATGTCCAGCTGCAG—CCAAAACCACAACCA3′
图2
A.ATGGTG——CAACCA
B.TGGTTG——CACCAT
C.GACGAG——CTGCAG
D.CTGCAG——CTCGTC
(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有____________________________________________________。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有________。
A.稀释涂布平板需控制每个平板30～300个菌落
B.抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C.抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D.抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1－F和F2－R进行了PCR扩增，质粒P1～P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有________。
(6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是__________________________________________________________
________________________________________________________________。
【还会这样考】
1.(2024·华师一附中调研)中天杨是由我国科学家采用生物转基因技术，历经8年时间培育成功的抗盐碱、耐干旱的杨树新品种。该品种以八里庄杨为实验材料，经转mtl－D基因培育获得。如图为培育“中天杨”的操作流程，①～⑥表示操作过程，该过程中可能用到的限制酶如表所示。
注：Ti质粒中的Tetr为四环素抗性基因，Ampr为氨苄青霉素抗性基因。
限制酶 Bcl Ⅰ EcoR Ⅰ Xba Ⅰ Sau3A Ⅰ BamH Ⅰ
切割位点 T↓GATCA G↓AATTC T↓CTAGA ↓GATC G↓GATCC
(1)过程①需要的酶是______________________，过程②需要的工具酶是____________________。采用PCR技术扩增目的基因时，在PCR反应体系需加入引物，引物的作用是____________________________________，若目的基因扩增3代，则共用引物________个。PCR完成以后，常采用________法来鉴定PCR的产物。
(2)培育转基因杨树的核心工作是________________，在进行该工作时，应在mtl－D基因的两侧添加限制酶________的识别序列。
(3)将目的基因导入受体细胞除图示方法外，还有____________。为了确认目的基因在植物细胞中是否成功表达，从分子水平通常是用________法进行检测。
2.(2024·河南名校联盟)如图是构建基因表达载体的示意图，回答下列问题：
(1)基因工程操作中的核心步骤是____________。重组质粒载体的核心部件有目的基因、启动子、________、________、复制原点等。
(2)引物是一小段能与________碱基互补配对的单链DNA。图中合成引物时，在引物5′端添加限制酶识别序列的原因是
________________________________________________________________。
(3)PCR扩增目的基因需在一定的缓冲溶液中进行，反应体系中需添加模板DNA、引物、耐高温的DNA聚合酶和________等。PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋，以激活________。PCR反应完成后，常采用________技术来鉴定PCR的产物。
(4)构建基因表达载体时，选用双酶切切割质粒载体和目的基因的目的有_______________________________________________________________________________________________________________________(写出两点)，
图中的T4 DNA连接酶能使目的基因片段和质粒载体片段之间形成________键。
课时2　赋予生物新的遗传特性的基因工程
重点1
知识盘查
1.磷酸二酯　黏性　磷酸二酯　黏性
2.(1)基因文库　PCR　逆转录　(2)RNA聚合酶　(3)农杆菌转化法　显微注射法　(4)抗原—抗体杂交　抗性接种实验
3.基因合成　新的蛋白质　蛋白质结构　脱氧核苷酸序列
曾经这样考
1.C　[酶3切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA连接酶连接，A不符合题意；质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B不符合题意；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C符合题意；若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D不符合题意。]
2.A　[分析题意，可以从酿酒酵母S中筛选、分离出目的基因gadB，然后利用PCR扩增目的基因，A正确；由题意知，L－谷氨酸钠是生产γ－氨基丁酸的底物，不能用来供能，B错误；将目的基因(gadB)导入菌株E.coliA构建高效生产γ－氨基丁酸的菌株E.coliB，E.coliA和E.coliB均不能高效降解γ－氨基丁酸，C错误；根据题干提供的信息，无法推断出是否有其他酶能够替代NcoⅠ和KpnⅠ，D错误。]
3.B　[根据扩增所得DNA片段可知，实验所用的两种引物序列为5′－TGCGCAGT－3′和5′－AGCTAGCA－3′，A正确；根据酶切后得到的黏性末端判断，步骤①所用酶是NheⅠ和CfoⅠ，B错误；步骤①用两种酶切割载体(质粒)，质粒上至少有两个切口，至少产生2个片段，C正确；目的基因片段和质粒经酶切后产生的均为黏性末端，可用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶连接，D正确。]
4.(1)磷酸二酯键　保证N基因启动子、N基因、N基因终止子的完整性，确保N基因能够顺利表达
(2)C—G、U—A、A—T
(3)菌株B2的基因组　无PCR产物
(4)无空气污染；更安全，无火灾隐患；分解效率更高，高效利用秸秆资源等
解析　(1)限制酶作用于DNA的磷酸二酯键。由题述可知，该过程是将重组质粒特定位点，接入M1、M2，再利用限制酶切出新的片段甲替换区(M1＋启动子＋N基因＋终止子＋M2)，再接入B1基因组中，得到B2，因此在M1和M2之间，需要保证N基因完整性，同时需要保证N基因能够正常表达，因此需要把M1接入启动子之前，M2接入终止子之后。(2)根据所给信息，向导RNA需要与对应DNA进行结合，结合期间，RNA的碱基会和DNA的碱基进行互补配对，根据碱基互补配对原则配对方式包括G—C、C—G、U—A、A—T。(3)需要验证是否插入重组后的片段甲，因此所用模板为菌株B2的基因组，如果有PCR产物说明菌株B2中含有N基因，如果没有PCR产物说明菌株B2中不含N基因。因为片段甲被替换，因此在重组片段甲(M1＋启动子＋N基因＋终止子＋M2)中，没有引物P4的结合位置，因此使用引物P3、P4进行PCR时，无法获得PCR产物。(4)秸秆焚烧严重污染环境，且有很大的火灾隐患，与此同时，焚烧对于有机物中的能量是极大的浪费，可以从上述角度进行论述。例如：无空气污染；更安全，无火灾隐患；分解效率更高，高效利用秸秆资源等。
还会这样考
1.D　[用PCR技术扩增人胰岛素基因时，扩增的过程是：目的基因DNA受热变性后解为单链，引物与单链相应互补序列结合；然后以单链DNA为模板，在DNA聚合酶作用下进行延伸，即将4种脱氧核苷酸加到引物的3′端，如此重复循环多次。每次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步，A正确；在构建人胰岛素基因表达载体时，首先用一定的限制性内切核酸酶切割含有目的基因的DNA片段和载体，再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子，B正确；大肠杆菌细胞经Ca2＋处理后，细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，更容易吸收重组的人胰岛素基因表达载体，C正确；抗原－抗体杂交法可以检测人胰岛素基因是否在大肠杆菌中翻译成胰岛素，若抗原－抗体杂交结果为阳性，说明人胰岛素基因在大肠杆菌中表达，则可以说明人胰岛素基因表达载体导入了大肠杆菌细胞中，D错误。]
2.(1)基因工程技术(或重组DNA技术)、植物组织培养技术
(2)Hind Ⅲ和Sal Ⅰ　氨苄青霉素　(3)①　农杆菌转化法
(4)生长素、细胞分裂素　诱导愈伤组织分化成幼苗的过程中，需要诱导生成根、芽等不同组织，而当生长素用量与细胞分裂素用量的比值大时有利于根的分化，当生长素用量与细胞分裂素用量的比值小时有利于芽的分化
解析　(1)①～③过程中利用了基因工程技术，烟草细胞→愈伤组织→转基因抗盐烟草幼苗的过程中利用了植物组织培养技术。因此，获得转基因抗盐烟草新品种过程中利用的生物技术有基因工程技术、植物组织培养技术等。(2)抗盐基因(目的基因)中含有限制酶BamH Ⅰ的切割位点，若用限制酶BamH Ⅰ切割含抗盐基因的DNA，则会破坏抗盐基因，因此不能用限制酶BamH Ⅰ切割含抗盐基因的DNA；抗盐基因两端含有限制酶Sal Ⅰ的切割位点，质粒上也含有限制酶Sal Ⅰ的切割位点，若用限制酶Sal Ⅰ切割含抗盐基因的DNA和质粒，然后用DNA连接酶连接，则可能会造成质粒和抗盐基因自身环化，或者使抗盐基因在质粒中反向连接。因此应该用两种限制酶切割含抗盐基因的DNA和质粒，经分析可知，可用限制酶Hind Ⅲ、Sal Ⅰ切割含目的基因(抗盐基因)的DNA和质粒，以确保目的基因定向插入质粒。由于用限制酶Hind Ⅲ、Sal Ⅰ切割质粒时，破坏了四环素抗性基因，而氨苄青霉素抗性基因没有被破坏，因此应在培养基中加入氨苄青霉素，以便于重组DNA分子的筛选。(3)基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建，即图中过程①。过程②③采用的方法是农杆菌转化法。(4)过程⑤是再分化，需要用到生长素、细胞分裂素等植物激素。在诱导愈伤组织分化成幼苗的过程中，这两种植物激素的比例会发生变化，这是因为诱导愈伤组织分化成幼苗的过程中，需要诱导生成根、芽等不同组织，而当生长素用量与细胞分裂素用量的比值大时有利于根的分化，当生长素用量与细胞分裂素用量的比值小时有利于芽的分化。
3.(1)接种环　摇床　(2)卡那霉素　(3)消毒　无菌滤纸　MS　(4)脱分化　再分化　芽和根　(5)T－DNA片段的(部分)序列　未导入Ti质粒的野生型番茄　避免死亡后根等遗体被分解，Zn、Cd等再度返回土壤，造成二次污染；及时拔除植物后，可缓解Zn、Cd等随食物链不断富集的危害
解析　(1)取保存的农杆菌菌落用接种环接种于相应的液体培养基中，并置于摇床中进行振荡培养，使其大量繁殖；取适量菌液置于CaCl2溶液中处理，制得感受态农杆菌。(2)由图可知，载体上含有卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性基因，但能在农杆菌中表达的是卡那霉素抗性基因，因此，经适宜条件培养一段时间，再加入适宜浓度的卡那霉素筛选出转化的农杆菌。(3)取番茄子叶进行消毒处理，其目的是防止杂菌污染，而后切段，再与转化的农杆菌菌液进行共培养，一段时间后，取出子叶放在无菌滤纸上吸取多余菌液，再将子叶放在适宜的以MS培养基为基础配制的培养基中进行培养，以便获得无菌的外植体。(4)取上述处理的番茄子叶先经脱分化过程形成愈伤组织，再在特定培养基上培养，以诱导其再分化为胚状体，长出芽和根，最后发育成完整的番茄植株。(5)为了检测番茄中是否成功导入目的基因，可依据T－DNA片段的部分序列设计引物进行PCR扩增，再用凝胶电泳技术进行检测，进行此实验的同时应以未导入Ti质粒的野生型番茄作为阴性对照，以导入Ti质粒的番茄作为阳性对照。已知某转基因番茄植株能大量吸收Zn、Cd等，且这些金属元素主要富集在根，生产应用时需对其定期拔除并实施无害处理，这样可以避免死亡后根等遗体被分解，这些元素再度返回土壤，造成二次污染；同时及时拔除植物后，能缓解Zn、Cd等随食物链不断富集的危害。
4.(1)纤维素酶和果胶酶　生长素和细胞分裂素
(2)花药(或花粉)离体培养　利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目
(3)①HindⅢ、BamHⅠ　交链格孢　②利用转基因技术将百合B中L基因的启动子替换为野生百合中L基因的启动子pL
解析　(1)因植物细胞细胞壁的成分主要是纤维素和果胶，因此获得原生质体的方法是用纤维素酶和果胶酶对植物细胞进行处理，得到原生质体后使原生质体融合，形成杂种细胞，再用生长素和细胞分裂素诱导愈伤组织形成和分化，从而获得完整的杂种植株。(2)获得单倍体植株的常用方法是花药(花粉)离体培养；鉴定百合单倍体植株的方法是利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目，如果染色体数目减少一半，则获得的植株为单倍体植株。(3)①根据目的片段以及质粒上限制酶的识别位点，若要获得pL并连接到质粒上，可选用限制酶HindⅢ、BamHⅠ进行酶切，以替换Ti质粒中的启动子，从而达到根据GUS酶活性反映启动子活性的目的。根据图c的结果可知，交链格孢的每一组转基因烟草中的GUS酶活性都最高可确定其诱导作用最强。②欲培育具有高抗病原微生物百合新品种，可利用转基因技术将百合B中L基因的启动子替换为野生百合中L基因的启动子pL。
重点2
知识盘查
1.DNA半保留复制　引物
2.复性　72 ℃　Taq DNA聚合酶
曾经这样考
1.D　[若将研磨液更换为蒸馏水，则从细胞核中释放出的DNA量会减少，从而会降低DNA提取的效率，A正确；由于DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，所以利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA，B正确；DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2 mol/L的NaCl溶液，利用该原理可纯化DNA粗提物，C正确；二苯胺试剂可以用于鉴定DNA，不能检测出溶液中是否含有蛋白质杂质，D错误。]
2.D　[由题图可知，P1、P2为纯合子，F1为杂合子，且两对等位基因的遗传符合自由组合定律，假设基因由上到下依此为A、a、B、b，则P1基因型为AAbb，P2基因型为aaBB，F1基因型为AaBb，据此分析选项。①基因型为AaBB，②基因型为Aabb，均为杂合体；F2中，③基因型为AABb，占比1/8，⑤基因型为AABB，占比1/16，③占比大于⑤，A正确；据图分析，图中缺少F2中基因型为aaBb对应的电泳图像，其电泳结果为3条带，分别为第2条带、第3条带和第4条带，B正确；由题图可知，③和⑦对应杂交类型为AABb×aabb，因此后代基因型为AaBb、Aabb，与②(基因型为Aabb)、⑧(基因型为AaBb)电泳结果相同，C正确；①基因型为AaBB，其自交后代基因型及比例为AABB∶AaBB∶aaBB＝1∶2∶1，④的基因型为aaBB，因此①自交子代与④电泳结果相同的占比1/4，D错误。]
3.D　[①反应管中的两种单链DNA部分互补配对： 则无延伸产物，②反应管中的1种单链DNA自身进行部分互补配对，，新合的“…”部分，无荧光标记的dATP，①②错误；③反应管中两种单链DNA部分互补配对， 新合成的“…”部分有带荧光标记的dATP，④反应管中1种单链DNA部分配对， 新合成的“…”部分有带荧光标记的dATP，且③④组双链DNA区都大于9个，③④正确。故选D。]
4.(1)模板、引物　退火温度　(2)CD　(3)限制性内切核酸酶、DNA连接酶　(4)ABC　(5)P3、P4　(6)电泳只能显示扩增片段的大致长度，不能显示精准的DNA碱基数量，也不能呈现DNA碱基序列
解析　(1)不同的PCR反应体系中，模板和引物是不同的；扩增程序中依据不同引物设置不同的退火温度是最重要的环节，恰当地选择退火温度，尽量避免引物与模板的非特异性结合，以保证目的产物的有效扩增。而对于延伸时间而言，以常用的TaqDNA聚合酶为例，催化DNA延伸的速度为1 000～2 000 bp/min，通常在实验室中可根据目的片段大小在30 s～2 min的时长内大致设置延伸时间，一般不需要精确控制。(2)对于引物F2－F、F1－R，根据图中信息分析，应该包含EGFP尾部和AnB1头部的序列，且反向互补。因此，应选择引物C和D。(3)根据图中示意的同源重组过程，两个插入片段与线性载体在重组酶作用下，可形成环状质粒，直接转化细菌，这一过程省去了传统质粒构建过程中酶切、连接两个过程，所以无需使用限制性内切核酸酶、DNA连接酶。(4)“稀释涂布平板需控制每个平板30～300个菌落”是微生物计数的实验步骤，与抗性平板筛选的目的完全不同，A错误；涂布平板时，培养基已凝固，不会烫死细菌，抗性平板上没有出现菌落，最常见的原因是未能有效实现重组质粒构建，或未能进行有效转化，导致抗性平板上未长出带有抗性质粒的菌落，B错误；由于筛选平板中含有抗生素，在正常的无菌操作过程中，不会出现大量的杂菌污染，C错误；单菌落无需进行纯化，如携带非目标质粒，可通过鉴定排除，D正确。(5)结合图1中的设计目标，从PCR产物电泳结果判断：P3无目的片段，P4产物片段大小不符，故P3、P4可直接丢弃。而P1、P2产物大小与理论值相近，需进一步分析确认。(6)电泳条带依据其和参照分子(Marker)的相对位置，仅能显示扩增片段的大致长度，即不能显示精准的DNA碱基数量，也不能呈现DNA碱基序列，必须通过DNA测序最终确认构建的质粒符合设计。
还会这样考
1.(1)逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶　限制酶和DNA连接酶　使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸　14　琼脂糖凝胶电泳
(2)基因表达载体的构建　Xba Ⅰ、Bcl Ⅰ　(3)花粉管通道法　抗原—抗体杂交
解析　(1)过程①以RNA为模板合成DNA并进行PCR，该过程需要逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶。过程②是将目的基因与Ti质粒进行连接，需要限制酶切割目的基因和Ti质粒，然后利用DNA连接酶将二者进行连接。采用PCR技术扩增目的基因时，在PCR反应体系需加入引物，引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，若目的基因扩增3代，则共用引物14个。PCR完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳法来鉴定PCR的产物。(2)基因表达载体的构建是基因工程的核心工作，在进行基因表达载体的构建时，应选择两种限制酶切割目的基因和Ti质粒，分析Ti质粒上的酶切割位点，首先排除BamHⅠ和EcoRⅠ，由Sam3AⅠ的酶切割位点可知，该酶可以将复制原点切开，故在mtl－D基因的两侧添加限制酶Xba Ⅰ、Bcl Ⅰ的识别序列。(3)图中利用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞，除此方法外，还有花粉管通道法等。为了确认目的基因在植物细胞中是否成功表达，通常用抗原—抗体杂交法从分子水平进行检测。
2.(1)构建基因表达载体　终止子　标记基因
(2)目的基因(或DNA母链)　使扩增的目的基因含有限制酶的识别序列，便于切割后与载体连接并且不影响目的基因的复制　(3)4种脱氧核苷酸　DNA聚合酶　琼脂糖凝胶电泳　(4)保证目的基因片段插入的方向正确、防止质粒载体或目的基因的自连　磷酸二酯
解析　(1)构建基因表达载体是基因工程操作中的核心步骤。一个完整的基因表达载体，必须有启动子、终止子、目的基因、标记基因和复制原点等。(2)引物是根据目的基因的一小段DNA序列人工合成的。在引物5′端添加限制酶识别序列，一方面便于切割目的基因后与载体连接，另一方面又不影响目的基因的扩增，因为DNA分子复制时，子链的延伸是从引物的3′端开始的。(3)PCR反应体系中有模板DNA、引物、耐高温的DNA聚合酶和原料(4种脱氧核苷酸)等。DNA聚合酶需要Mg2＋的激活。PCR产物中有多种类型的DNA分子，常采用琼脂糖凝胶电泳技术来鉴定PCR的产物。(4)对目的基因和质粒同时进行双酶切，能够保证目的基因片段插入的方向正确，且可以防止质粒载体或目的基因的自连。基因工程中的DNA连接酶，能使目的基因片段和质粒载体片段之间形成磷酸二酯键。(共85张PPT)
赋予生物新的遗传特性的基因工程
课 时 2
目 录
重点1
基因工程和蛋白质工程
PCR技术及应用
重点2
知识盘查
曾经这样考
重点1　
基因工程和蛋白质工程
还会这样考
1.归纳基因工程的基本工具
提醒　若用不同的限制酶切割出不同的黏性末端，则能使目的基因和载体定向连接,避免自身环化和反向连接，提高连接的有效性。
细胞和细胞产物
磷酸二酯
黏性
磷酸二酯
黏性
2.理解掌握基因工程的操作步骤
(1)目的基因的筛选与获取
基因文库
PCR
逆转录
(2)基因表达载体的构建——重组质粒的构建
RNA聚合酶
提醒　①启动子和终止子：启动子(DNA片段)≠起始密码子(位于mRNA上)；终止子(DNA片段)≠终止密码子(位于mRNA)上。
②目的基因插入位置：启动子与终止子之间。
③利用乳腺生物反应器生产药物时，应将目的基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起。
(3)将目的基因导入受体细胞
农杆菌转化法
显微注射法
(4)目的基因的检测与鉴定
提醒　PCR技术不仅可用于获取和扩增目的基因，还能用于检测受体细胞中是否含有目的基因或受体细胞中的目的基因是否转录出mRNA。
抗原—抗
体杂交
抗性接
种实验
3.图示法解读蛋白质工程
基因合成
新的
蛋白质
蛋白质结构
脱
氧核苷酸序列
1.(2023·新课标卷，6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
C
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(　　)
A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接
B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA连接酶连接
解析　酶3切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA连接酶连接，A不符合题意；质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B不符合题意；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C符合题意；若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D不符合题意。
A
2.(2024·江西卷，12)γ－氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L－谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L－谷氨酸脱羧是高效生产γ－氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如下图方法将酿酒酵母S的L－谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E.coliA，构建了以L－谷氨酸钠为底物高效生产γ－氨基丁酸的菌株E.coliB。下列叙述正确的是(　　)
A.图中表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB
B.E.coliB发酵生产γ－氨基丁酸时，L－谷氨酸钠的作用是供能
C.E.coliA和E.coliB都能高效降解γ－氨基丁酸
D.可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒
解析　分析题意，可以从酿酒酵母S中筛选、分离出目的基因gadB，然后利用PCR扩增目的基因，A正确；由题意知，L－谷氨酸钠是生产γ－氨基丁酸的底物，不能用来供能，B错误；将目的基因(gadB)导入菌株E.coliA构建高效生产γ－氨基丁酸的菌株E.coliB，E.coliA和E.coliB均不能高效降解γ－氨基丁酸，C错误；根据题干提供的信息，无法推断出是否有其他酶能够替代NcoⅠ和KpnⅠ，D错误。
B
3.(2023·重庆卷，12)某小组通过PCR(假设引物长度为8个碱基，短于实际长度)获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切(如下图)，再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是(　　)
A.实验所用引物，其中一个序列为5′－TGCGCAGT－3′
B.步骤①所用酶是SpeⅠ和CfoⅠ
C.用步骤①的酶对载体进行酶切至少获得了2个片段
D.酶切片段和载体连接时可使用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶
解析　根据扩增所得DNA片段可知，实验所用的两种引物序列为5′－TGCGCAGT－3′和5′－AGCTAGCA－3′，A正确；根据酶切后得到的黏性末端判断，步骤①所用酶是NheⅠ和CfoⅠ，B错误；步骤①用两种酶切割载体(质粒)，质粒上至少有两个切口，至少产生2个片段，C正确；目的基因片段和质粒经酶切后产生的均为黏性末端，可用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶连接，D正确。
4.(2024·新课标卷，35)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的结合位置、片段甲替换区如下图所示，→表示引物5′→3′方向。回答下列问题。
(1)限制酶切割的化学键是______________。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是_______________________________________________________
___________________________________________________________________。
磷酸二酯键
保证N基因启动子、N基因、N基因终止子的完整性，确保N基因能够顺利表达
(2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G—C和____________________。
C—G、U—A、A—T
(3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是____________________；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是_______________________________。
菌株B2的基因组
无PCR产物
(4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是___________________________________________________________________
(答出2点即可)。
无空气污染；更安全，无火灾隐患；分解效率更高，高效利用秸秆资源等
解析　(1)限制酶作用于DNA的磷酸二酯键。由题述可知，该过程是将重组质粒特定位点，接入M1、M2，再利用限制酶切出新的片段甲替换区(M1＋启动子＋N基因＋终止子＋M2)，再接入B1基因组中，得到B2，因此在M1和M2之间，需要保证N基因完整性，同时需要保证N基因能够正常表达，因此需要把M1接入启动子之前，M2接入终止子之后。
(2)根据所给信息，向导RNA需要与对应DNA进行结合，结合期间，RNA的碱基会和DNA的碱基进行互补配对，根据碱基互补配对原则配对方式包括G—C、C—G、U—A、A—T。
(3)需要验证是否插入重组后的片段甲，因此所用模板为菌株B2的基因组，如果有PCR产物说明菌株B2中含有N基因，如果没有PCR产物说明菌株B2中不含N基因。因为片段甲被替换，因此在重组片段甲(M1＋启动子＋N基因＋终止子＋M2)中，没有引物P4的结合位置，因此使用引物P3、P4进行PCR时，无法获得PCR产物。
(4)秸秆焚烧严重污染环境，且有很大的火灾隐患，与此同时，焚烧对于有机物中的能量是极大的浪费，可以从上述角度进行论述。例如：无空气污染；更安全，无火灾隐患；分解效率更高，高效利用秸秆资源等。
D
1.(2024·九省联考甘肃卷，15)胰岛素可用于治疗糖尿病，我国科学家打破国外技术垄断，研发了拥有自主知识产权的重组人胰岛素药物，下列叙述错误的是(　　)
A.用PCR技术扩增人胰岛素基因时，每次循环包括变性、复性、延伸三步
B.构建人胰岛素基因表达载体时，需使用限制性内切核酸酶和DNA连接酶
C.大肠杆菌细胞经Ca2＋处理后，更容易吸收重组的人胰岛素基因表达载体
D.抗原－抗体杂交法不能检测人胰岛素基因表达载体是否导入大肠杆菌细胞
解析　用PCR技术扩增人胰岛素基因时，扩增的过程是：目的基因DNA受热变性后解为单链，引物与单链相应互补序列结合；然后以单链DNA为模板，在DNA聚合酶作用下进行延伸，即将4种脱氧核苷酸加到引物的3′端，如此重复循环多次。每次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步，A正确；在构建人胰岛素基因表达载体时，首先用一定的限制性内切核酸酶切割含有目的基因的DNA片段和载体，再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子，B正确；大肠杆菌细胞经Ca2＋处理后，细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，更容易吸收重组的人胰岛素基因表达载体，C正确；抗原－抗体杂交法可以检测人胰岛素基因是否在大肠杆菌中翻译成胰岛素，若抗原－抗体杂交结果为阳性，说明人胰岛素基因在大肠杆菌中表达，则可以说明人胰岛素基因表达载体导入了大肠杆菌细胞中，D错误。
2.(2024·重庆市质量检测)烟草是我国一些地区的经济作物之一，提高烟草质量有利于提高经济收入。我国科研团队研究了一种转基因抗盐烟草新品种，抗盐基因的结构和获得转基因抗盐烟草新品种的过程(①～⑤)如图所示。回答下列问题：
(1)获得转基因抗盐烟草新品种过程中利用的生物技术有______________________________________________________(答出2项)等。
(2)为确保目的基因定向插入质粒，应该选择限制酶________________切割含目的基因的DNA和质粒。在培养基中加入____________(填“氨苄青霉素”或“四环素”)以便于重组DNA分子的筛选。
基因工程技术(或重组DNA技术)、植物组织培养技术
Hind Ⅲ和Sal Ⅰ
氨苄青霉素
(3)培育转基因抗盐烟草新品种的核心工作是图中过程________(填序号)。过程②③采用的方法是______________。
(4)过程⑤需要用到_______________________等植物激素，在诱导愈伤组织分化成幼苗的过程中，这两种植物激素的比例会发生变化，原因是___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
______________________________________________________。
①
农杆菌转化法
生长素、细胞分裂素
诱导愈伤组织分化成幼苗的过程中，需要诱导生成根、芽等不同组织，而当生长素用量与细胞分裂素用量的比值大时有利于根的分化，当生长素用量与细胞分裂素用量的比值小时有利于芽的分化
解析　(1)①～③过程中利用了基因工程技术，烟草细胞→愈伤组织→转基因抗盐烟草幼苗的过程中利用了植物组织培养技术。因此，获得转基因抗盐烟草新品种过程中利用的生物技术有基因工程技术、植物组织培养技术等。
(2)抗盐基因(目的基因)中含有限制酶BamH Ⅰ的切割位点，若用限制酶BamH Ⅰ切割含抗盐基因的DNA，则会破坏抗盐基因，因此不能用限制酶BamH Ⅰ切割含抗盐基因的DNA；抗盐基因两端含有限制酶Sal Ⅰ的切割位点，质粒上也含有限制酶Sal Ⅰ的切割位点，若用限制酶Sal Ⅰ切割含抗盐基因的DNA和质粒，然后用DNA连接酶连接，则可能会造成质粒和抗盐基因自身环化，或者使抗盐基因在质粒中反向连接。因此应该用两种限制酶切割含抗盐基因的DNA和质粒，经分析可知，可用限制酶Hind Ⅲ、Sal Ⅰ切割含目的基因(抗盐基因)的DNA和质粒，以确保目的基因定向插入质粒。由于用限制酶Hind Ⅲ、Sal Ⅰ切割质粒时，破坏了四环素抗性基因，而氨苄青霉素抗性基因没有被破坏，因此应在培养基中加入氨苄青霉素，以便于重组DNA分子的筛选。
(3)基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建，即图中过程①。过程②③采用的方法是农杆菌转化法。(4)过程⑤是再分化，需要用到生长素、细胞分裂素等植物激素。在诱导愈伤组织分化成幼苗的过程中，这两种植物激素的比例会发生变化，这是因为诱导愈伤组织分化成幼苗的过程中，需要诱导生成根、芽等不同组织，而当生长素用量与细胞分裂素用量的比值大时有利于根的分化，当生长素用量与细胞分裂素用量的比值小时有利于芽的分化。
3.(2024·湖南雅礼中学调研)金属硫蛋白(MT)是一类低分子量、富含半胱氨酸、具有金属结合能力的普遍存在于生物体内的金属结合蛋白，具有多种生物学功能。近年来，因其与Zn、Cu、Cd等金属的结合能力较强而用于生态修复。科研人员成功地将人MT蛋白基因用农杆菌转化法转入番茄，成功培育转基因番茄。回答下列问题：
注：T－DNA中标出的启动子在真核细胞中表达。
(1)感受态农杆菌的制备：取保存的农杆菌菌落用________接种于相应的液体培养基中，并置于________中进行振荡培养，完成菌种的活化和扩大培养；取适量菌液置于CaCl2溶液中处理，制得感受态农杆菌。
(2)目的基因的获取和转化：取人肝脏细胞，破碎后提取mRNA，在逆转录酶的作用下形成cDNA，经PCR扩增后的产物与Ti质粒连接形成重组质粒(如图)，将其与制备好的感受态农杆菌混合，使外源DNA转入细胞；经适宜条件培养一段时间，再加入适宜浓度的________筛选出转化的农杆菌。
接种环
摇床
卡那霉素
(3)转化番茄：取番茄子叶进行__________(填“消毒”或“灭菌”)处理后切段，再与转化的农杆菌菌液进行共培养，一段时间后，取出子叶放在________上吸取多余菌液，再将子叶放在适宜的以___________培养基为基础配制的培养基中进行培养。
(4)育成转基因番茄：取上述处理的番茄子叶先经________过程形成愈伤组织，将愈伤组织接种到含有特定激素的培养基上，就可以诱导其________成胚状体，长出________，进而发育成完整的番茄植株。
消毒
无菌滤纸
MS
脱分化
再分化
芽和根
(5)转基因番茄性状的检测和生产应用：为了检测番茄中是否成功导入目的基因，可依据________________________设计引物进行PCR扩增，再用凝胶电泳技术进行检测，进行此实验的同时应以__________________________作为阴性对照，以
导入Ti质粒的番茄作为阳性对照；已知某转基因番茄植株能大量吸收Zn、Cd等，且这些金属元素主要富集在根，生产应用时需对其定期拔除并实施无害处理，原因是___________________________________
_______________________________________________________________________________________(答出2点即可)。
T－DNA片段的(部分)序列
未导入Ti质粒的野生型番茄
避免死亡后根等遗体被分解，Zn、Cd等再度返回土壤，造成二次污染；及时拔除植物后，可缓解Zn、Cd等随食物链不断富集的危害
解析　(1)取保存的农杆菌菌落用接种环接种于相应的液体培养基中，并置于摇床中进行振荡培养，使其大量繁殖；取适量菌液置于CaCl2溶液中处理，制得感受态农杆菌。(2)由图可知，载体上含有卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性基因，但能在农杆菌中表达的是卡那霉素抗性基因，因此，经适宜条件培养一段时间，再加入适宜浓度的卡那霉素筛选出转化的农杆菌。
(3)取番茄子叶进行消毒处理，其目的是防止杂菌污染，而后切段，再与转化的农杆菌菌液进行共培养，一段时间后，取出子叶放在无菌滤纸上吸取多余菌液，再将子叶放在适宜的以MS培养基为基础配制的培养基中进行培养，以便获得无菌的外植体。(4)取上述处理的番茄子叶先经脱分化过程形成愈伤组织，再在特定培养基上培养，以诱导其再分化为胚状体，长出芽和根，最后发育成完整的番茄植株。
(5)为了检测番茄中是否成功导入目的基因，可依据T－DNA片段的部分序列设计引物进行PCR扩增，再用凝胶电泳技术进行检测，进行此实验的同时应以未导入Ti质粒的野生型番茄作为阴性对照，以导入Ti质粒的番茄作为阳性对照。已知某转基因番茄植株能大量吸收Zn、Cd等，且这些金属元素主要富集在根，生产应用时需对其定期拔除并实施无害处理，这样可以避免死亡后根等遗体被分解，这些元素再度返回土壤，造成二次污染；同时及时拔除植物后，能缓解Zn、Cd等随食物链不断富集的危害。
4.(2024·湖南卷，21)百合具有观赏、食用和药用等多种价值，科研人员对其进行了多种育种技术研究。回答下列问题：
(1)体细胞杂交育种。进行不同种百合体细胞杂交前，先用__________________去除细胞壁获得原生质体，使原生质体融合，得到杂种细胞后，继续培养，常用____________________(填植物激素名称)诱导愈伤组织形成和分化，获得完整的杂种植株。
纤维素酶和果胶酶
生长素和细胞分裂素
(2)单倍体育种。常用___________________________的方法来获得单倍体植株，鉴定百合单倍体植株的方法是__________________________________________
____________________________________________________________________。
花药(或花粉)离体培养
利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中
染色体的数目
(3)基因工程育种。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因pL，该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图，其中基因gus编码GUS酶，GUS酶活性可反映启动子活性。
①研究病原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取L，首先选用__________________酶切，将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接，再导入烟草。随机选取3组转基因成功的烟草(P1、P2和P3)进行病原微生物胁迫，结果如图c。由此可知：三种病原微生物都能诱导pL的活性增强，其中________的诱导作用最强。
HindⅢ、BamHⅠ
交链格孢
②现发现栽培种百合B中也有L，但其上游的启动子与野生百合不同，且抗病性弱。若要提高该百合中L的表达量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，简要写出实验思路_________________________________________________
_____________________________________________________________________。
利用转基因技术将百合B中L基因的启动子替换为野生百合中L基因的启动子pL
解析　(1)因植物细胞细胞壁的成分主要是纤维素和果胶，因此获得原生质体的方法是用纤维素酶和果胶酶对植物细胞进行处理，得到原生质体后使原生质体融合，形成杂种细胞，再用生长素和细胞分裂素诱导愈伤组织形成和分化，从而获得完整的杂种植株。
(2)获得单倍体植株的常用方法是花药(花粉)离体培养；鉴定百合单倍体植株的方法是利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目，如果染色体数目减少一半，则获得的植株为单倍体植株。
(3)①根据目的片段以及质粒上限制酶的识别位点，若要获得pL并连接到质粒上，可选用限制酶HindⅢ、BamHⅠ进行酶切，以替换Ti质粒中的启动子，从而达到根据GUS酶活性反映启动子活性的目的。根据图c的结果可知，交链格孢的每一组转基因烟草中的GUS酶活性都最高可确定其诱导作用最强。②欲培育具有高抗病原微生物百合新品种，可利用转基因技术将百合B中L基因的启动子替换为野生百合中L基因的启动子pL。
重点2　
PCR技术及应用
知识盘查
曾经这样考
还会这样考
1.PCR技术原理与条件
DNA半保留复制
引物
2.PCR技术的过程
提醒　可通过引物控制PCR扩增的基因片段，并在基因两侧引入限制酶识别序列。
复
性
72 ℃
Taq DNA聚合酶
3.DNA的粗提取与鉴定
4.DNA片段的电泳鉴定
D
1.(2024·安徽卷，14)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是(　　)
A.实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低
B.利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA
C.DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物
D.将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质
解析　若将研磨液更换为蒸馏水，则从细胞核中释放出的DNA量会减少，从而会降低DNA提取的效率，A正确；由于DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，所以利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA，B正确；DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2 mol/L的NaCl溶液，利用该原理可纯化DNA粗提物，C正确；二苯胺试剂可以用于鉴定DNA，不能检测出溶液中是否含有蛋白质杂质，D错误。
D
2.(2024·新课标卷，5)某种二倍体植物的P1和P2植株杂交得F1，F1自交得F2。对个体的DNA进行PCR检测，产物的电泳结果如图所示，其中①～⑧为部分F2个体，上部2条带是一对等位基因的扩增产物，下部2条带是另一对等位基因的扩增产物，这2对等位基因位于非同源染色体上。下列叙述错误的是(　　)
A.①②个体均为杂合体，F2中③所占的比例大于⑤
B.还有一种F2个体的PCR产物电泳结果有3条带
C.③和⑦杂交子代的PCR产物电泳结果与②⑧电泳结果相同
D.①自交子代的PCR产物电泳结果与④电泳结果相同的占1/2
解析　由题图可知，P1、P2为纯合子，F1为杂合子，且两对等位基因的遗传符合自由组合定律，假设基因由上到下依此为A、a、B、b，则P1基因型为AAbb，P2基因型为aaBB，F1基因型为AaBb，据此分析选项。①基因型为AaBB，②基因型为Aabb，均为杂合体；F2中，③基因型为AABb，占比1/8，⑤基因型为AABB，占比1/16，③占比大于⑤，A正确；据图分析，图中缺少F2中基因型为aaBb对应的电泳图像，其电泳结果为3条带，分别为第2条带、第3条带和第4条带，B正确；由题图可知，③和⑦对应杂交类型为AABb×aabb，因此后代基因型为AaBb、Aabb，与②(基因型为Aabb)、⑧(基因型为AaBb)电泳结果相同，C正确；①基因型为AaBB，其自交后代基因型及比例为AABB∶AaBB∶aaBB＝1∶2∶1，④的基因型为aaBB，因此①自交子代与④电泳结果相同的占比1/4，D错误。
D
3.(2024·山东卷，5)制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP)的反应管①～④中，分别加入如表所示的适量单链DNA，已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有(　　)
A.①② B.②③ C.①④ D.③④
反应管 加入的单链DNA
① 5′—GCCGATCTTTATA—3′
3′—GACCGGCTAGAAA—5′
② 5′—AGAGCCAATTGGC—3′
③ 5′—ATTTCCCGATCCG—3′
3′—AGGGCTAGGCATA—5′
④ 5′—TTCACTGGCCAGT—3′
4.(2023·江苏卷，22)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：
(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有______________，扩增程序中最主要的不同是______________。
(2)有关基因序列如图2。引物F2－F、F1－R应在下列选项中选用________。
EGFP基因序列：5′ATGGTGAGCAAGGGC—GACGAGCTGTACAAG3′
AnB1基因序列：5′CATGTCCAGCTGCAG—CCAAAACCACAACCA3′
图2
A.ATGGTG——CAACCA B.TGGTTG——CACCAT
C.GACGAG——CTGCAG D.CTGCAG——CTCGTC
模板、引物
退火温度
CD
(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有________________________________。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有________。
A.稀释涂布平板需控制每个平板30～300个菌落
B.抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C.抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D.抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
限制性内切核酸酶、DNA连接酶
ABC
(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1－F和F2－R进行了PCR扩增，质粒P1～P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有________。
(6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是_____________________________________________________________________________________________。
P3、P4
电泳只能显示扩增片段的大致长度，不能显示精准的DNA碱基数量，也不能呈现DNA碱基序列
解析　(1)不同的PCR反应体系中，模板和引物是不同的；扩增程序中依据不同引物设置不同的退火温度是最重要的环节，恰当地选择退火温度，尽量避免引物与模板的非特异性结合，以保证目的产物的有效扩增。而对于延伸时间而言，以常用的TaqDNA聚合酶为例，催化DNA延伸的速度为1 000～2 000 bp/min，通常在实验室中可根据目的片段大小在30 s～2 min的时长内大致设置延伸时间，一般不需要精确控制。(2)对于引物F2－F、F1－R，根据图中信息分析，应该包含EGFP尾部和AnB1头部的序列，且反向互补。因此，应选择引物C和D。
(3)根据图中示意的同源重组过程，两个插入片段与线性载体在重组酶作用下，可形成环状质粒，直接转化细菌，这一过程省去了传统质粒构建过程中酶切、连接两个过程，所以无需使用限制性内切核酸酶、DNA连接酶。(4)“稀释涂布平板需控制每个平板30～300个菌落”是微生物计数的实验步骤，与抗性平板筛选的目的完全不同，A错误；涂布平板时，培养基已凝固，不会烫死细菌，抗性平板上没有出现菌落，最常见的原因是未能有效实现重组质粒构建，或未能进行有效转化，导致抗性平板上未长出带有抗性质粒的菌落，B错误；由于筛选平板中含有抗生素，在正常的无菌操作过程中，不会出现大量的杂菌污染，C错误；单菌落无需进行纯化，如携带非目标质粒，可通过鉴定排除，D正确。
(5)结合图1中的设计目标，从PCR产物电泳结果判断：P3无目的片段，P4产物片段大小不符，故P3、P4可直接丢弃。而P1、P2产物大小与理论值相近，需进一步分析确认。(6)电泳条带依据其和参照分子(Marker)的相对位置，仅能显示扩增片段的大致长度，即不能显示精准的DNA碱基数量，也不能呈现DNA碱基序列，必须通过DNA测序最终确认构建的质粒符合设计。
1.(2024·华师一附中调研)中天杨是由我国科学家采用生物转基因技术，历经8年时间培育成功的抗盐碱、耐干旱的杨树新品种。该品种以八里庄杨为实验材料，经转mtl－D基因培育获得。如图为培育“中天杨”的操作流程，①～⑥表示操作过程，该过程中可能用到的限制酶如表所示。
注：Ti质粒中的Tetr为四环素抗性基因，Ampr为氨苄青霉素抗性基因。
(1)过程①需要的酶是______________________________，过程②需要的工具酶是____________________。采用PCR技术扩增目的基因时，在PCR反应体系需加入引物，引物的作用是______________________________________________，若目的基因扩增3代，则共用引物________个。PCR完成以后，常采用_________________法来鉴定PCR的产物。
限制酶 Bcl Ⅰ EcoR Ⅰ Xba Ⅰ Sau3A Ⅰ BamH Ⅰ
切割位点 T↓GATCA G↓AATTC T↓CTAGA ↓GATC G↓GATCC
逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶
限制酶和DNA连接酶
使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
14
琼脂糖凝胶电泳
(2)培育转基因杨树的核心工作是___________________，在进行该工作时，应在mtl－D基因的两侧添加限制酶_________________的识别序列。
(3)将目的基因导入受体细胞除图示方法外，还有_______________。为了确认目的基因在植物细胞中是否成功表达，从分子水平通常是用________________法进行检测。
基因表达载体的构建
Xba Ⅰ、Bcl Ⅰ
花粉管通道法
抗原—抗体杂交
解析　(1)过程①以RNA为模板合成DNA并进行PCR，该过程需要逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶。过程②是将目的基因与Ti质粒进行连接，需要限制酶切割目的基因和Ti质粒，然后利用DNA连接酶将二者进行连接。采用PCR技术扩增目的基因时，在PCR反应体系需加入引物，引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，若目的基因扩增3代，则共用引物14个。PCR完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳法来鉴定PCR的产物。
(2)基因表达载体的构建是基因工程的核心工作，在进行基因表达载体的构建时，应选择两种限制酶切割目的基因和Ti质粒，分析Ti质粒上的酶切割位点，首先排除BamHⅠ和EcoRⅠ，由Sam3AⅠ的酶切割位点可知，该酶可以将复制原点切开，故在mtl－D基因的两侧添加限制酶Xba Ⅰ、Bcl Ⅰ的识别序列。
(3)图中利用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞，除此方法外，还有花粉管通道法等。为了确认目的基因在植物细胞中是否成功表达，通常用抗原—抗体杂交法从分子水平进行检测。
2.(2024·河南名校联盟)如图是构建基因表达载体的示意图，回答下列问题：
(1)基因工程操作中的核心步骤是____________________。重组质粒载体的核心部件有目的基因、启动子、________、________、复制原点等。
(2)引物是一小段能与______________
_________碱基互补配对的单链DNA。图中合成引物时，在引物5′端添加限制酶识别序列的原因是_________________________________
__________________________________________________________________。
构建基因表达载体
终止子
标记基因
目的基因(或
DNA母链)
使扩增的目的基因含有限制酶的识别序列，便于切割后与载体连接并且不影响目的基因的复制
(3)PCR扩增目的基因需在一定的缓冲溶液中进行，反应体系中需添加模板DNA、引物、耐高温的DNA聚合酶和_________________等。PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋，以激活______________。PCR反应完成后，常采用_________________技术来鉴定PCR的产物。
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
琼脂糖凝胶电泳
(4)构建基因表达载体时，选用双酶切切割质粒载体和目的基因的目的有________________________________________________________________(写出两点)，图中的T4 DNA连接酶能使目的基因片段和质粒载体片段之间形成________键。
保证目的基因片段插入的方向正确、防止质粒载体或目的基因的自连
磷酸二酯
解析　(1)构建基因表达载体是基因工程操作中的核心步骤。一个完整的基因表达载体，必须有启动子、终止子、目的基因、标记基因和复制原点等。(2)引物是根据目的基因的一小段DNA序列人工合成的。在引物5′端添加限制酶识别序列，一方面便于切割目的基因后与载体连接，另一方面又不影响目的基因的扩增，因为DNA分子复制时，子链的延伸是从引物的3′端开始的。
(3)PCR反应体系中有模板DNA、引物、耐高温的DNA聚合酶和原料(4种脱氧核苷酸)等。DNA聚合酶需要Mg2＋的激活。PCR产物中有多种类型的DNA分子，常采用琼脂糖凝胶电泳技术来鉴定PCR的产物。(4)对目的基因和质粒同时进行双酶切，能够保证目的基因片段插入的方向正确，且可以防止质粒载体或目的基因的自连。基因工程中的DNA连接酶，能使目的基因片段和质粒载体片段之间形成磷酸二酯键。限时练24 赋予生物新的遗传特性的基因工程
(时间：40分钟　分值：50分)
【精准强化】　
重点1　基因工程和蛋白质工程
1.(8分)(2024·广西南宁市摸底)镰状细胞贫血是一种常染色体隐性遗传病，由正常血红蛋白基因(HbA)突变为镰状细胞贫血基因(Hbs)引起，HbA和Hbs的某片段如图甲。对胎儿进行基因检测的主要原理是：用MstⅡ限制酶处理PCR扩增后的DNA；加热使被酶切的DNA片段解旋，用荧光标记的CTGACTCCT序列与其杂交；凝胶电泳分离。图乙是凝胶电泳后荧光出现的三种可能性。回答下列问题：
(1)(2分)图甲为基因HbA和Hbs的部分片段，据图可知，镰状细胞贫血是基因中发生________导致的。基因突变具有不定向性，可产生________基因。
(2)(2分)胎儿c的基因型为________，与胎儿c具有相同基因型的一对夫妇生下患镰状细胞贫血女儿的概率为________。
(3)(4分)基因治疗是治疗镰状细胞贫血最有效的方法，治疗时要构建含HbA的基因表达载体，构建基因表达载体首先需要用同一种限制酶切割HbA和质粒，目的是_____________________________________________________________，
再用DNA连接酶连接，DNA连接酶的主要功能是________________________。构建基因表达载体的目的是_______________________________________
_______________________________________________________________。
2.(12分)(2024·南京市调研)PSMA3是蛋白酶体的重要组成成分之一，与恶性肿瘤的发生和发展有密切关系。为探寻PSMA3与肝细胞癌(HCC)的关系，科研人员通过构建含人PSMA3基因的重组腺病毒(pAd/PSMA3)并开展了相关研究，以期为HCC早期诊断和治疗奠定基础。如图为重组腺病毒的构建流程，其中GFP为绿色荧光蛋白基因。请回答下列问题。
限制酶 识别序列和酶切位点 限制酶 识别序列和酶切位点
PacⅠ TTAAT↓TAA BclⅠ T↓GATCA
PmeⅠ GTTT↓AAAC EcoRⅤ GAT↓ATC
SalⅠ G↓TCGAC Sau3AⅠ ↓GATC
(1)(2分)过程①以提取的总RNA为模板，在__________酶的作用下获得PSMA3的cDNA，该cDNA与人体细胞核中PSMA3基因在结构上的区别是该cDNA没有____________________。
(2)(2分)为防止过程②中PSMA3基因与质粒1错误连接，可在PSMA3基因的上游引物和下游引物的5′端分别添加限制酶________________的识别序列。
(3)(4分)过程④为同源重组，该过程首先需要用核酸外切酶从线性化DNA分子一条链的末端按3′→5′的方向顺次水解若干个磷酸二酯键，其目的是形成________末端，再经________酶的作用形成重组腺病毒载体。
(4)(4分)过程⑥常用脂质体包裹DNA片段，目的是_______________________。
转染后，可通过荧光显微镜观察________基因的表达强度来初步筛选目标239A细胞。
重点2　PCR技术及应用
3.(15分)(2024·衡阳八中质检)科学家用抗旱基因培育出了耐旱玉米新品系，为解决我国粮食问题做出了重要贡献。若测得某耐旱基因(mt1D)编码链首端到末端(其中一条链)的序列为5′—ATCTACGCGCTCATCCG…(省略3n个核苷酸序列)…CGCAGCAATGAGTAGCG—3′。下图1为构建重组质粒的过程示意图，BamHⅠ、BclⅠ、SmaⅠ、Sau3AⅠ为限制酶(四种酶的识别序列详见表)，箭头表示转录方向。回答下列问题。
限制酶 识别序列及切割位点(5′→3′)
BamHⅠ G↓GATCC
BclⅠ T↓GATCA
SmaⅠ CCC↓GGG
Sau3AⅠ ↓GATC
Q1：5′—GGATCCCGCAGCAA—3′
Q2：5′—CCCGGGATCTACGC—3′
Q3：5′—TGATCCATCTACGC—3′
Q4：5′—TGATCACGCTACTC—3′
图2
(1)(4分)为获取更多mt1D基因，可采用PCR技术扩增，在反应体系中除加入引物、dNTP、缓冲液、Mg2＋外，还需要加入____________________。某同学设计了如下六种PCR引物，其中适合选用的一对引物是________(选填序号)
①5′—GACTACTCGCGCATCTA—3′
②5′—ATCTACGCGCTCATCCG—3′
③5′—GCGATGAGTAACGACGC—3′
④5′—CGCTACTCATTGCTGCG—3′
⑤5′—TAGATGCGCGAGTAGGC—3′
⑥5′—CGCAGCAATGAGTAGCG—3′
(2)(2分)若PCR反应得到的非特异性扩增产物偏多，从引物设计和温度控制角度考虑，主要原因可能是________________________________。
(3)(5分)为将图中质粒A和mt1D基因正确连接构建重组质粒B，设计mt1D基因的引物时，应在两种引物的5′端分别添加________限制酶的识别序列，选用________限制酶切割质粒A，酶切后的载体和目的基因片段通过________酶作用后获得重组质粒。为了筛选出转入了重组质粒的受体细胞，应首先在筛选平板培养基中添加________，再将平板上长出的菌落通过影印平板法接种到添加________的平板培养基上继续培养观察。
(4)(2分)若从平板上长出的菌落中提取重组质粒B，利用Sau3AⅠ进行完全酶切，最多可以得到________种大小不同的DNA片段。
(5)(2分)图2是对重组质粒测序所得到的部分序列，若目的基因与质粒正确连接，则图中M连接处的序列正确的是________(填序列编号)。
4.(15分)图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。请回答下列问题：
图1
(1)(2分)EcoRⅤ酶切位点为，EcoRⅤ酶切出来的线性载体P1为________末端。
(2)(4分)用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为________的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在________酶作用下，形成重组质粒P3。
(3)(5分)为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如表(“＋”代表生长，“－”代表不生长)。根据表中结果判断，应选择的菌落是________(填表中字母)类，另外两类菌落质粒导入情况分别是________________、________________。
菌落类型平板类型 A B C
无抗生素 ＋ ＋ ＋
氨苄青霉素 ＋ ＋ －
四环素 ＋ － －
氨苄青霉素＋四环素 ＋ － －
图2
(4)(4分)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是
_____________________________________________________。
限时练24　赋予生物新的遗传特性的基因工程
1.(1)碱基替换　一个以上的等位
(2)HbAHbs　1/8　(3)产生相同的末端　将切下来的双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键(合理即可)　让目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时能够使目的基因表达并发挥作用
解析　(1)据图甲分析可知，镰状细胞贫血是相应基因中发生碱基替换的结果。基因突变具有不定向性，可以产生一个以上的等位基因。
(2)
(3)用同一种限制酶切割HbA和质粒，目的是让HbA和质粒形成相同的末端。之后再用DNA连接酶连接，DNA连接酶的主要功能是将切下来的双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。构建基因表达载体的目的是让目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时能够使目的基因表达并发挥作用。
2.(1)逆转录　启动子、终止子、内含子
(2)SalⅠ、EcoRⅤ(顺序不能颠倒)　(3)黏性　DNA连接
(4)促进目的DNA片段进入239A细胞　绿色荧光蛋白(GFP)
解析　(1)以RNA为模板合成DNA的过程称为逆转录，该过程需要逆转录酶参与。与人体细胞核中的PSMA3基因相比，经逆转录获得的PSMA3的cDNA在结构上缺少启动子、终止子和内含子。(2)应将PSMA3基因插到质粒1的启动子和终止子之间，为防止目的基因和质粒发生自身环化和目的基因在质粒中反向连接，需要进行双酶切。由题图可知，质粒1启动子和终止子之间含有限制酶SalⅠ、EcoRⅤ和Sau3AⅠ的识别序列，且质粒1中还含有限制酶BclⅠ的识别序列。由题表知，BclⅠ的识别序列和酶切位点为T↓GATCA，Sau3AⅠ的识别序列和酶切位点为↓GATC，若使用限制酶Sau3AⅠ对质粒1进行切割，会将终止子切下来，因此不能使用限制酶Sau3AⅠ对质粒1进行切割。经分析可知，应选择限制酶SalⅠ和EcoRⅤ对质粒1进行酶切，又知质粒1中限制酶SalⅠ的识别序列位于限制酶EcoRⅤ识别序列的上游，因此，为了使PSMA3基因与质粒1正确连接，可在PSMA3基因的上游引物和下游引物的5′端分别添加限制酶SalⅠ和EcoRⅤ的识别序列。(3)据题表可知，过程③是用限制酶PmeⅠ切割的，形成的是平末端。过程④为同源重组，该过程首先需要用核酸外切酶从线性化DNA分子一条链的末端按3′→5′的方向顺次水解若干个磷酸二酯键，形成黏性末端，再经DNA连接酶的作用形成重组腺病毒载体。(4)过程⑥是脂质体转染，常用脂质体包裹DNA片段，以促进目的DNA片段进入239A细胞。转染后，可通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白基因(GFP基因)的表达强度来初步筛选目标239A细胞。
3.(1)模板、耐高温的DNA聚合酶　②④
(2)复性温度低，引物设计不恰当(合理即可)
(3)BamHⅠ、SmaⅠ　BclⅠ、SmaⅠ　T4 DNA连接　四环素　氨苄青霉素　(4)3　(5)Q3
解析　(1)该耐旱基因(mt1D)编码链首端到末端(其中一条链)的序列为5′—ATCTACGCGCTCATCCG…(省略3n个核苷酸序列)…CGCAGCAATGAGTAGCG—3′。设计引物时，其中一种引物需要与编码链3′端的一段序列发生碱基互补配对，另一种引物需要与模板链3′端的部分序列发生碱基互补配对，六种PCR引物中可选用的引物是②④。(2)扩增时复性温度过低，可能会导致引物与非目的基因序列发生结合，从而扩增出不同长度的DNA分子，出现多条条带。PCR扩增产物的电泳结果显示，除目的基因条带外，还有非特异性条带，从引物的角度考虑可能的原因是引物设计不合理，设计的引物可与非目的基因序列发生互补配对，从而扩增出非目的基因序列，产生非特异性条带。(3)为将图中质粒A和mt1D基因正确连接构建重组质粒B，设计mt1D基因的引物时，由于目的基因中有BclⅠ的识别序列，因此设计的引物中不能含有BclⅠ的识别序列，又由于质粒A的氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因中都含有BamHⅠ的识别序列，结合题表信息可知，限制酶BamHⅠ和BclⅠ酶切后产生的黏性末端相同，故设计mt1D基因的引物时，需要在两种引物的5′端分别添加BamHⅠ、SmaⅠ限制酶的识别序列，同时需要选用BclⅠ、SmaⅠ限制酶切割质粒A。酶切后的载体和目的基因片段会出现相同的黏性末端和平末端，可用T4DNA连接酶(既可连接黏性末端，又可连接平末端)将酶切后的载体和目的基因连接起来，获得重组质粒。重组质粒B中含有四环素抗性基因，质粒A中含有两种抗性基因(四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因)。为了筛选出转入了重组质粒的受体细胞，应首先在筛选平板培养基中添加四环素，再将平板上长出的菌落通过影印平板法接种到添加氨苄青霉素的平板培养基上继续培养观察。(4)从平板上长出的菌落中提取重组质粒B，利用Sau3AⅠ进行完全酶切，由于重组质粒中有限制酶BamHⅠ、BclⅠ、SmaⅠ的识别序列以及重组的接口处的序列5′—TGATCC—3′，由于限制酶Sau3AⅠ可识别GATC序列，因此利用Sau3AⅠ酶切重组质粒B，最多可以得到3种大小不同的DNA片段。(5)图2是对重组质粒测序后得到的部分序列，若目的基因与质粒正确连接，则图中连接处的序列为5′—TGATCC—3′，再结合目的基因的部分碱基序列可知，图中M连接处的序列正确的是Q3。
4.(1)平　(2)胸腺嘧啶(T)　DNA连接　
(3)B　A类菌落含有P0　C类菌落未转入质粒
(4)乙、丙　目的基因反向连接
解析　(1)EcoRⅤ酶切位点在酶所识别序列的中心轴线处，产生的是平末端。(2)DNA连接酶对平末端的连接效率较低，因此通常要将平末端改造成黏性末端后再进行连接。由于目的基因片段的两端各自带一个腺嘌呤脱氧核苷酸，根据碱基互补配对原则，处理后的载体质粒两端需要各添加一个碱基为胸腺嘧啶的脱氧核苷酸；要将处理后的质粒与目的基因连接起来，需要用DNA连接酶。(3)由于四环素抗性基因中含有EcoRⅤ酶识别的序列及切割位点，所以形成的重组质粒中四环素抗性基因已经被破坏，而氨苄青霉素抗性基因正常。根据表中结果可知，A菌落抗氨苄青霉素和四环素，说明A菌落中导入的是P0质粒；B菌落抗氨苄青霉素而不抗四环素，说B菌落中导入的是重组质粒；C菌落既不抗氨苄青霉素，也不抗四环素，说明C菌落中没有导入质粒。(4)由于处理后的P0质粒的两个末端都含一个胸腺嘧啶的脱氧核苷酸，而目的基因片段的两端各自带一个腺嘌呤脱氧核苷酸，所以目的基因在和P0质粒连接时可能会出现两种情况：正向连接和反向连接。分析图2可知，理论上可以选择的引物组合有甲和丙、乙和丙两种情况。如果选择甲和丙这对引物，则无论目的基因是否正确插入，扩增的片段都是50 bp＋300 bp＋100 bp＝450 bp，不符合要求；如果选择乙和丙这对引物，正向连接和反向连接后所得结果不同，所以应选择乙和丙这对引物进行PCR鉴定。如果目的基因和P0质粒反向连接，则引物乙会出现在重组质粒的外侧，此时若加入引物甲和乙，则可以扩增出300 bp＋100 bp＝400 bp的片段。

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