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课时3　单抗与双抗、基因编辑技术及其应用
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单抗与双抗的制备及应用 ①2024·湖北卷，12；②2024·江西卷，16；①2023·北京卷，12；②2023·湖北卷，22；①2022·山东卷，15；②2022·辽宁卷，24；③2022·福建卷，13
基因编辑技术及其应用 ①2024·新课标卷，35；①2023·海南卷，20；①2021·海南卷，25
焦点1　单抗与双抗的制备和应用
【知识盘查】
双特异性抗体是指一个抗体分子可以与两个不同抗原或同一抗原的两个不同抗原表位相结合，目前最常利用杂交瘤杂交法来制备。长春花是原产于非洲东海岸的野生花卉，其所含的长春碱具有良好的抗肿瘤作用。图1是科研人员通过杂交—杂交瘤细胞技术(免疫的B淋巴细胞和杂交瘤细胞杂交技术)生产能同时识别癌胚抗原和长春碱的双特异性单克隆抗体的部分过程，图2是某双特异性单克隆抗体作用图。
①⑤小鼠产生能与癌胚抗原(长春碱)结合的抗体的B淋巴细胞，③④筛选特定的杂交瘤细胞。双特异性单克隆抗体能同时识别癌胚抗原和长春碱，见图2。
提醒　与直接使用抗肿瘤药物相比，将抗肿瘤药物与双特异性单克隆抗体结合后给药，特异性强，对人体的副作用更小，原因是双特异性单克隆抗体能将药物送到肿瘤部位，对肿瘤进行特异性杀伤。
【曾经这样考】
(2022·山东卷，15)如图所示，将由2种不同的抗原分别制备的单克隆抗体分子，在体外解偶联后重新偶联可制备双特异性抗体，简称双抗。下列说法错误的是(　　)
A.双抗可同时与2种抗原结合
B.利用双抗可以将蛋白类药物运送至靶细胞
C.筛选双抗时需使用制备单克隆抗体时所使用的2种抗原
D.同时注射2种抗原可刺激B细胞分化为产双抗的浆细胞
【还会这样考】
(2024·山东日照模拟)乳腺癌、胃癌细胞表面有大量的HER2蛋白，T细胞表面有CD3蛋白和CD28蛋白。研究人员将上述三种蛋白作为抗原分别制备单克隆抗体，然后将其在体外解偶联后重新偶联制备得到三特异性抗体，简称三抗(如图)。下列说法错误的是(　　)
A.同时注射3种抗原蛋白，可刺激B细胞增殖分化为分泌三抗的浆细胞
B.利用抗原—抗体杂交的原理筛选图示三抗时需要3种相应抗原蛋白
C.与植物原生质体融合相比，制备单抗时可采用灭活病毒进行诱导融合
D.与单抗相比，三抗增加了两个特异性抗原结合位点，对癌细胞的杀伤更强
焦点2　基因编辑技术及其应用
【知识盘查】
CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理是由一条单链向导RNA(sgRNA)引导核酸内切酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割(如图)。
CRISPR复合体中的sgRNA的主要功能是与靶向基因(目的基因)上特定的碱基序列互补，从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合，并在特定位点切割DNA。
CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物，与传统的基因工程相比，其明显优点是避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题。CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因治疗、基因水平进行动植物的育种、研究基因的功能等方面有广阔的应用前景。
【还会这样考】
1.(2024·山东青岛调研)CRISPR/Cas9是一种基因编辑技术，Cas9蛋白能与人工设计的sgRNA形成复合体(如图)。利用该技术可以对DNA进行一系列的定向改造。下列相关叙述错误的是(　　)
A.Cas9蛋白属于限制酶，能切割目的基因
B.sgRNA具有能与目的基因发生碱基互补配对的结构
C.基因编辑技术能够定点插入、删除或替换部分碱基对
D.通过基因编辑技术引起的变异属于基因重组
2.(2024·山东烟台调研)猪瘟病毒能与猪细胞膜上的LamR受体蛋白结合，进而侵入细胞引起猪瘟。利用基因编辑技术改变LamR受体蛋白基因，使LamR受体蛋白不能与猪瘟病毒正常结合，但不影响生理功能，从而培育出抗猪瘟病毒猪。基因编辑原理是由一条人为设计的单链向导RNA(sgRNA)引导Cas9蛋白到特定的DNA位点进行切割，从而完成对目的基因的编辑。基因编辑过程如图所示。下列叙述错误的是(　　)
A.培育抗猪瘟病毒猪，一般选择受精卵作为基因编辑的受体细胞，这样获得的个体的所有细胞都无法被猪瘟病毒感染
B.Cas9蛋白的功能是准确识别DNA特定序列并进行切割
C.改造后的受体细胞经培养发育到囊胚或桑葚胚时，可将其进行冷冻保存或胚胎移植
D.通过基因编辑技术改造前后的两种LamR基因是等位基因
课时3　单抗与双抗、基因编辑技术及其应用
焦点1
曾经这样考
D　[根据抗原和抗体发生特异性结合的原理推测，双抗可同时与2种抗原结合，A正确；根据抗原与抗体能够发生特异性结合的特性，利用双抗可以将蛋白类药物运送至靶细胞，从而使药物发挥相应的作用，B正确；由于双抗是在两种不同的抗原刺激下，B细胞增殖、分化产生不同的浆细胞分泌形成的单抗，在体外解偶联后重新偶联制备成的，因此，筛选双抗时需使用制备单克隆抗体时所使用的2种抗原来进行抗原—抗体检测，C正确；同时注射2种抗原可刺激B细胞分化形成不同的浆细胞，而不是分化成产双抗的浆细胞，D错误。]
还会这样考
A　[同时注射3种抗原会刺激B细胞分化形成不同的浆细胞，进而产生三种抗体，一种浆细胞只能产生一种抗体，并不能产生三抗，A错误；由于抗体具有特异性，所以利用抗原—抗体杂交的原理筛选图示三抗时需要3种相应抗原蛋白，B正确；动物细胞融合与植物原生质体融合相比，特有的融合方式是采用灭活病毒进行诱导融合，C正确；抗体具有特异性，与单抗相比，三抗增加了两个特异性抗原结合位点，可以将T细胞带至肿瘤细胞处，对癌细胞的杀伤更强，D正确。]
焦点2
还会这样考
1.D　[Cas9蛋白能与人工设计的sgRNA形成复合体，复合体中的sgRNA与目的基因按照碱基互补配对原则特异性结合，Cas9蛋白相当于限制酶，Cas9蛋白结合到相应位置并剪切DNA，最终实现对目的基因序列的编辑，A、B正确；复合体在sgRNA引导下结合目的基因，Cas9蛋白切割目的基因造成双链断裂，细胞在修复断裂的DNA时会定点插入、删除或替换部分碱基对，C正确；通过基因编辑技术引起的变异属于基因突变，D错误。]
2.B　[培育抗猪瘟病毒猪，一般选择受精卵作为基因编辑的受体细胞，改造后的受精卵开始进行胚胎发育，这样获得的个体的所有细胞都无法被猪瘟病毒感染，A正确；根据基因编辑的原理和题图所示过程，sgRNA是通过碱基互补配对原则准确地识别并结合到DNA的特定位点，从而引导Cas9蛋白到达准确位置进行DNA的切割，B错误；改造后的LamR基因与改造前的基因位置相同，控制的性状不同，两者是等位基因，D正确。](共18张PPT)
单抗与双抗、基因编辑技术及其应用
课 时 3
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单抗与双抗的制备及应用 ①2024·湖北卷，12；②2024·江西卷，16；
①2023·北京卷，12；②2023·湖北卷，22；
①2022·山东卷，15；②2022·辽宁卷，24；
③2022·福建卷，13
基因编辑技术及其应用 ①2024·新课标卷，35；①2023·海南卷，20；①2021·海南卷，25
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焦点1
单抗与双抗的制备和应用
基因编辑技术及其应用
焦点2
知识盘查
曾经这样考
焦点1　
单抗与双抗的制备和应用
还会这样考
双特异性抗体是指一个抗体分子可以与两个不同抗原或同一抗原的两个不同抗原表位相结合，目前最常利用杂交瘤杂交法来制备。长春花是原产于非洲东海岸的野生花卉，其所含的长春碱具有良好的抗肿瘤作用。图1是科研人员通过杂交—杂交瘤细胞技术(免疫的B淋巴细胞和杂交瘤细胞杂交技术)生产能同时识别癌胚抗原和长春碱的双特异性单克隆抗体的部分过程，图2是某双特异性单克隆抗体作用图。
①⑤小鼠产生能与癌胚抗原(长春碱)结合的抗体的B淋巴细胞，③④筛选特定的杂交瘤细胞。双特异性单克隆抗体能同时识别癌胚抗原和长春碱，见图2。
提醒　与直接使用抗肿瘤药物相比，将抗肿瘤药物与双特异性单克隆抗体结合后给药，特异性强，对人体的副作用更小，原因是双特异性单克隆抗体能将药物送到肿瘤部位，对肿瘤进行特异性杀伤。
D
(2022·山东卷，15)如图所示，将由2种不同的抗原分别制备的单克隆抗体分子，在体外解偶联后重新偶联可制备双特异性抗体，简称双抗。下列说法错误的是(　　)
A.双抗可同时与2种抗原结合
B.利用双抗可以将蛋白类药物运送至靶细胞
C.筛选双抗时需使用制备单克隆抗体时所使用的2种抗原
D.同时注射2种抗原可刺激B细胞分化为产双抗的浆细胞
解析　根据抗原和抗体发生特异性结合的原理
推测，双抗可同时与2种抗原结合，A正确；根
据抗原与抗体能够发生特异性结合的特性，利
用双抗可以将蛋白类药物运送至靶细胞，从而
使药物发挥相应的作用，B正确；由于双抗是在两种不同的抗原刺激下，B细胞增殖、分化产生不同的浆细胞分泌形成的单抗，在体外解偶联后重新偶联制备成的，因此，筛选双抗时需使用制备单克隆抗体时所使用的2种抗原来进行抗原—抗体检测，C正确；同时注射2种抗原可刺激B细胞分化形成不同的浆细胞，而不是分化成产双抗的浆细胞，D错误。
A
(2024·山东日照模拟)乳腺癌、胃癌细胞表面有大量的HER2蛋白，T细胞表面有CD3蛋白和CD28蛋白。研究人员将上述三种蛋白作为抗原分别制备单克隆抗体，然后将其在体外解偶联后重新偶联制备得到三特异性抗体，简称三抗(如图)。下列说法错误的是(　　)
A.同时注射3种抗原蛋白，可刺激B细胞增殖分化为分泌三抗的浆细胞
B.利用抗原—抗体杂交的原理筛选图示三抗时需要3种相应抗原蛋白
C.与植物原生质体融合相比，制备单抗时可采用灭活病毒进行诱导融合
D.与单抗相比，三抗增加了两个特异性抗原结合位点，对癌细胞的杀伤更强
解析　同时注射3种抗原会刺激B细胞分化形成不同的浆细胞，进而产生三种抗体，一种浆细胞只能产生一种抗体，并不能产生三抗，A错误；由于抗体具有特异性，所以利用抗原—抗体杂交的原理筛选图示三抗时需要3种相应抗原蛋白，B正确；动物细胞融合与植物原生质体融合相比，特有的融合方式是采用灭活病毒进行诱导融合，C正确；抗体具有特异性，与单抗相比，三抗增加了两个特异性抗原结合位点，可以将T细胞带至肿瘤细胞处，对癌细胞的杀伤更强，D正确。
焦点2　
基因编辑技术及其应用
知识盘查
还会这样考
CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理是由一条单链向导RNA(sgRNA)引导核酸内切酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割(如图)。
CRISPR复合体中的sgRNA的主要功能是与靶向基因(目的基因)上特定的碱基序列互补，从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合，并在特定位点切割DNA。
CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物，与传统的基因工程相比，其明显优点是避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题。CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因治疗、基因水平进行动植物的育种、研究基因的功能等方面有广阔的应用前景。
D
1.(2024·山东青岛调研)CRISPR/Cas9是一种基因编辑技术，Cas9蛋白能与人工设计的sgRNA形成复合体(如图)。利用该技术可以对DNA进行一系列的定向改造。下列相关叙述错误的是(　　)
A.Cas9蛋白属于限制酶，能切割目的基因
B.sgRNA具有能与目的基因发生碱基互补配对的结构
C.基因编辑技术能够定点插入、删除或替换部分碱基对
D.通过基因编辑技术引起的变异属于基因重组
解析　Cas9蛋白能与人工设计的sgRNA形成复合体，复合体中的sgRNA与目的基因按照碱基互补配对原则特异性结合，Cas9蛋白相当于限制酶，Cas9蛋白结合到相应位置并剪切DNA，最终实现对目的基因序列的编辑，A、B正确；复合体在sgRNA引导下结合目的基因，Cas9蛋白切割目的基因造成双链断裂，细胞在修复断裂的DNA时会定点插入、删除或替换部分碱基对，C正确；通过基因编辑技术引起的变异属于基因突变，D错误。
B
2.(2024·山东烟台调研)猪瘟病毒能与猪细胞膜上的LamR受体蛋白结合，进而侵入细胞引起猪瘟。利用基因编辑技术改变LamR受体蛋白基因，使LamR受体蛋白不能与猪瘟病毒正常结合，但不影响生理功能，从而培育出抗猪瘟病毒猪。基因编辑原理是由一条人为设计的单链向导RNA(sgRNA)引导Cas9蛋白到特定的DNA位点进行切割，从而完成对目的基因的编辑。基因编辑过程如图所示。下列叙述错误的是(　　)
A.培育抗猪瘟病毒猪，一般选择受精卵作为基因编辑的受体细胞，这样获得的个体的所有细胞都无法被猪瘟病毒感染
B.Cas9蛋白的功能是准确识别DNA特定序列并进行切割
C.改造后的受体细胞经培养发育到囊胚或桑葚胚时，可将其进行冷冻保存或胚胎移植
D.通过基因编辑技术改造前后的两种LamR基因是等位基因
解析　培育抗猪瘟病毒猪，一般选择受精卵作为基因编辑的受体细胞，改造后的受精卵开始进行胚胎发育，这样获得的个体的所有细胞都无法被猪瘟病毒感染，A正确；根据基因编辑的原理和题图所示过程，sgRNA是通过碱基互补配对原则准确地识别并结合到DNA的特定位点，从而引导Cas9蛋白到达准确位置进行DNA的切割，B错误；改造后的LamR基因与改造前的基因位置相同，控制的性状不同，两者是等位基因，D正确。限时练25 单抗与双抗、基因编辑技术及其应用
(时间：40分钟　分值：50分)
【综合提升】
1.(10分)(2024·湖南雅礼中学调研)双特异性抗体可同时与癌细胞和免疫细胞特异性结合，它一端与癌细胞结合，一端与T细胞结合，将T细胞拉近癌细胞，大大提高了杀灭癌细胞的效率。CD19是癌细胞表面的抗原蛋白，CD3蛋白受体位于T细胞表面，与抗体结合后，其免疫功能得到激活。下图是研究人员通过杂交瘤细胞技术生产双特异性单克隆抗体的部分过程。回答下列问题。
(1)(2分)给小鼠注射CD19蛋白，是为了从小鼠的脾脏中分离得到____________________；注射的抗原A是指________。
(2)(4分)过程②和④所用诱导方法与诱导植物细胞融合所用方法的不同之处是________。过程③培养杂交瘤细胞时需提供的气体条件是95%空气和5%CO2的混合气体，其中CO2的主要作用是___________________________________
_________________________________________________________________。
过程⑤筛选获得的细胞具有的特点是________________________________
_________________________________________________________________。
(3)(4分)与从血清中提取的CD19抗体、抗A抗原的抗体相比，通过双杂交瘤细胞得到双特异性单克隆抗体的优点是_________________________________。
双特异性单克隆抗体治疗癌症的效果往往优于抗体CD19和A抗体的联合使用，原因是___________________________________________________
______________________________________________________________。
2.(11分)(2024·山东潍坊统考)CRISPR/Cas9系统可对基因组进行定点编辑，其工作原理如图1所示。该系统主要包含单链向导RNA(sgRNA)和Cas9酶两个部分，能特异性识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas9酶到相应位置并剪切DNA，最终实现对靶基因序列的编辑。请回答下列问题。
(1)(2分)图1为CRISPR/Cas9系统作用示意图，该系统能精准识别相关基因的原理是sgRNA与目标DNA发生________，Cas9酶可催化________(化学键名称)水解，剪切特定DNA片段。
(2)(9分)LMNA基因编码的核纤层蛋白与维持细胞核正常形态有关。科研人员利用CRISPR/Cas9技术对体外培养HepG2(人源肺癌细胞)细胞株进行基因编辑，获得了LMNA基因敲除的稳定细胞系。
①体外培养HepG2时需要一定比例的O2和CO2，其中CO2的主要作用是______________________；培养基除灭菌外还需要通过________________来保证无菌无毒环境。
②HepG2细胞中没有编码Cas9的基因，需将Cas9基因及sgRNA基因拼接形成拼接基因并与质粒结合导入HepG2细胞，用图2中的质粒以及含Cas9－sgRNA拼接基因的DNA片段构建表达载体时，应选用________进行酶切。
③将构建好的表达载体与用________处理的细菌置于适宜反应体系中培养。然后将培养的细菌涂布于含____________的平板培养基上，37 ℃培养，24 h后挑取菌落，提取质粒作为模板，选择图3中引物组合________和________，通过PCR和电泳技术鉴定是否重组成功。
④用鉴定成功的工程菌对HepG2细胞进行转染，培养三天后收集HepG2细胞，提取基因组，对其________序列进行检测，判断Cas9－sgRNA拼接基因是否导入成功。若从细胞水平进行检测，可以检测HepG2细胞数目增长量或________。
3.(14分)(2024·河北卷，22)新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。
回答下列问题：
(1)(4分)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为____________启动子。Nos为终止子，其作用为____________________________________。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶________和________对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。
(2)(4分)利用________方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测____________________，通过________技术检测是否翻译出r2HN蛋白。
(3)(2分)获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合体植株的占比为________。选择纯合体进行后续研究的原因是_____________________________________________
________________________________________________________________。
(4)(2分)制备r2HN疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的CD8＋T细胞(细胞毒性T细胞)水平，结果如图2所示。据此分析，获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的________免疫和________免疫。
(5)(2分)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是
_________________________________________________(答出两点即可)。
4.(15分)(2024·安徽卷，20)丁二醇广泛应用于化妆品和食品等领域。兴趣小组在已改造的大肠杆菌中引入合成丁二醇的关键基因X，以提高丁二醇的产量。回答下列问题。
(1)(3分)扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶，原因是________________________________________________________________
__________________________________________________________________。
(2)(3分)使用BamHⅠ和SalⅠ限制酶处理质粒和X基因，连接后转化大肠杆菌，并涂布在无抗生素平板上(如图)。在此基础上，进一步筛选含目的基因菌株的实验思路是_______________________________________________________
__________________________________________________________________。
(3)(4分)研究表明，碳源和氮源的种类、浓度及其比例会影响微生物生长和发酵产物积累。如果培养基中碳源相对过多，容易使其氧化不彻底，形成较多的________________，引起发酵液pH下降。兴趣小组通过单因子实验确定了木薯淀粉和酵母粉的最适浓度分别为100 g·L－1和15 g·L－1。在此基础上，设置不同浓度的木薯淀粉(90 g·L－1、100 g·L－1、110 g·L－1)和酵母粉(12 g·L－1、15 g·L－1、18 g·
L－1)筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，以获得较高发酵产量，理论上应设置________(填数字)组实验(重复组不计算在内)。
(4)(3分)大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高，其原因是
__________________________________________________________________。
(5)(2分)发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经__________________________________，最终获得发酵产品。
限时练25　单抗与双抗、基因编辑技术及其应用
1.(1)免疫的B淋巴细胞　CD3蛋白　(2)灭活病毒　维持培养液的pH　既能无限增殖，又能产生特异性抗体　(3)双特异性单克隆抗体可以识别两种抗原　既不损伤正常细胞，又减少了用药剂量
解析　(1)给小鼠注射CD19蛋白，是为了从小鼠的脾脏中获得已免疫的B淋巴细胞，该细胞能够产生特定抗体。分析题意，本过程的目的是得到双特异性单克隆抗体，故为保证最终双特异性单克隆抗体的产生，注射的抗原A应是CD3蛋白。(2)过程②和④是诱导动物细胞融合，该过程所用诱导方法与诱导植物细胞融合所用方法的不同之处是用灭活病毒诱导；过程③培养杂交瘤细胞时需提供的气体条件是95%空气和5%CO2的混合气体，其中CO2的主要作用是维持培养液的pH；过程⑤是融合细胞的筛选，筛选后得到的杂交瘤细胞，特点是既能无限增殖，又能产生特异性抗体。(3)与从血清中提取的CD19抗体、抗A抗原的抗体相比，通过双杂交瘤细胞得到双特异性单克隆抗体的优点是能同时识别CD19和A两种抗原，作用效果更显著。双特异性单克隆抗体治疗癌症的效果往往优于抗体CD19和A抗体的联合使用，原因是该双特异性单克隆抗体可以借助单克隆抗体的识别作用，将药物带到癌细胞位置，既不损伤正常细胞，又减少了用药剂量。
2.(1)碱基互补配对　磷酸二酯键
(2)①维持培养液pH　定期更换培养液(或添加一定量的抗生素，或无菌操作)　②EcoR Ⅰ　③Ca2＋(CaCl2)　嘌呤霉素　Ⅱ　Ⅲ　④核苷酸　细胞核形态
解析　(1)图1为CRISPR/Cas9系统作用示意图，该系统能精准识别相关基因是根据碱基互补配对原则实现的，即为sgRNA与目标DNA发生碱基互补配对，同时Cas9酶可催化磷酸二酯键的水解，从而剪切特定DNA片段。(2)①培养动物细胞时，需要一定比例的O2和CO2，其中CO2的主要作用是维持培养液pH，由于细胞会产生次生代谢产物，对细胞具有毒害作用，所以培养基除灭菌外还需要通过定期更换培养液来保证无毒环境，同时可通过添加一定量的抗生素保证无菌环境。②用图2中的质粒以及含Cas9－sgRNA拼接基因的DNA片段构建表达载体时，应选用EcoR Ⅰ进行酶切，因为在质粒和目的基因的两端均含有该酶的切割位点，而BamHⅠ的酶切位点正好在标记基因内，因此不能选择BamHⅠ。③将构建好的表达载体与用Ca2＋(CaCl2)处理的细菌(增加细菌的通透性，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态)置于适宜反应体系中培养。然后将培养的细菌涂布于含嘌呤霉素的平板培养基上进行筛选，凡是能正常生长的菌落即为带有质粒的细菌，37 ℃培养，24 h后挑取菌落，提取质粒作为模板，根据图中目的基因两侧的碱基序列以及引物的碱基顺序，结合碱基互补配对原则可选择图3中引物组合Ⅱ和Ⅲ进行体外DNA复制，通过PCR和电泳技术鉴定是否重组成功。④用鉴定成功的工程菌对HepG2细胞进行转染，培养三天后收集HepG2细胞，提取基因组，由于DNA具有特异性，可对其碱基(或核苷酸)序列进行检测，判断Cas9－sgRNA拼接基因是否导入成功。若从细胞水平进行检测，可以检测HepG2细胞数目增长量或细胞核形态是否变化。
3.(1)在胚乳中特异性表达的基因　使转录在所需要的地方停下来　HindⅢ　EcoRⅠ
(2)农杆菌转化　是否转录出mRNA　抗原—抗体杂交
(3)1/4　纯合体自交后代不发生性状分离
(4)体液　细胞 (5)水稻易于种植，容易获得疫苗；水稻的产量较高，能够获得大量的疫苗(合理即可)
解析　(1)若使r2HN仅在水稻胚乳中表达，则GtP应为在胚乳中特异性表达的基因启动子。终止子是基因下游的一端有特殊序列结构的DNA片段，使转录在所需要的地方停下来。r2HN应插入启动子GtP和终止子Nos之间，由于GtP中有限制酶KpnⅠ的识别序列，而SacⅠ的一个识别序列位于终止子之后，因此不能选择这两种限制酶切割，应选择HindⅢ和EcoRⅠ对r2HN和载体进行酶切。
(2)通常采用农杆菌转化法将目的基因导入水稻的愈伤组织。检测r2HN是否表达，可以采用PCR技术检测该基因是否转录出mRNA，通过抗原—抗体杂交技术检测是否翻译出相关蛋白质。(3)设r2HN为基因N，则单一位点插入目的基因的植株的基因型为Nn，其自交后代的基因型及比例为NN∶Nn∶nn＝1∶2∶1，r2HN纯合体植株的比例为1/4。纯合体自交后代不会发生性状分离，因此选择纯合体进行后续研究。(4)抗体参与体液免疫，CD8＋T细胞为细胞毒性T细胞，参与细胞免疫。分析题图，实验组的抗体水平及CD8＋T细胞水平的相对值都高于对照组，说明获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的体液免疫和细胞免疫。(5)水稻属于常见的农作物，易于种植，其作为生物反应器容易获得疫苗；水稻的产量高，作为生物反应器容易从胚乳中获得大量疫苗。
4.(1)在PCR反应中，需要利用高温使DNA双链解旋，普通的DNA聚合酶在高温下会变性失活，而TaqDNA聚合酶能够耐高温，在高温条件下依然具有活性(合理即可)
(2)在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环素的培养基中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落由导入目的基因的菌株形成
(3)乳酸或酒精和CO2　9
(4)大肠杆菌进行细胞呼吸时会释放大量热量(合理即可)
(5)提取、分离和纯化
解析　(1)在PCR反应中，需要利用高温使DNA双链解旋，普通的DNA聚合酶在高温下会变性失活，而Taq DNA聚合酶能够耐高温，在高温条件下依然具有活性，因此扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶。(2)质粒中含有四环素抗性基因和氯霉素抗性基因，而四环素抗性基因中含有限制酶BamHⅠ和SalⅠ的酶切位点，用限制酶BamHⅠ和SalⅠ处理质粒会破坏四环素抗性基因，而氯霉素抗性基因完整。使用限制酶BamHⅠ和SalⅠ处理质粒和X基因，连接后转化大肠杆菌，并涂布在无抗生素的平板上。在此基础上，若要进一步筛选含目的基因的菌株，则需要在平板中添加氯霉素，能够生长的菌落可能含有重组质粒或空质粒，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法(用无菌绒布轻盖在已长好菌落的原培养基上，然后不转动任何角度，“复印”至新的培养基上)影印到添加了四环素的培养基中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落由含目的基因的菌株形成。(3)如果培养基中碳源相对较多，容易使其氧化不彻底，形成较多的乳酸或酒精和CO2，引起发酵液pH下降。由于木薯淀粉和酵母粉的浓度各有3个，若要筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，以获得较高发酵产量，理论上应设置3×3＝9(组)实验。(4)大肠杆菌进行细胞呼吸时会释放大量热量，因此大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高。(5)如果产品是代谢物，可根据产物的性质采取适当的提取、分离和纯化措施来获得产品。由于本实验的目的是提高丁二醇的产量，即获得代谢物。因此发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经提取、分离和纯化，最终获得发酵产品。

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