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课时4　突破基因工程类大题
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RT－RCR、实时荧光定量、PCR与反向PCR ①2022·全国乙卷，38；②2022·江苏卷，24；①2020·江苏卷，33；②2020·山东卷，25
PCR定点诱变技术 ①2023·辽宁卷，25；①2021·天津卷，16
单酶切导致的正、反接的电泳检测和PCR检测 ①2024·黑吉辽卷，17、25；②2024·全国甲卷，38；③2024·河北卷，24；④2024·湖南卷，15；⑤2024·江西卷，12；⑥2024·浙江6月选考，19、20；①2023·山东卷，25；①2022·福建卷，13
突破1　基因工程的热考题型
题型一　限制酶的选择技巧
(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点选择限制酶
①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点，如图乙)
(2)根据质粒的特点选择限制酶(如图)
[例1] (2024·巴蜀中学适应考)科学家从大量木乃伊中获得少量木乃伊DNA，进行克隆，复制了2400年前的DNA。某生物兴趣小组同学模拟了其中部分研究过程，设计了如下实验(MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ为4种限制性内切核酸酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG)。请回答以下问题：
(1)从解旋过程进行分析，PCR扩增木乃伊基因与体内DNA复制过程不相同的地方是___________________________________________________________
_____________________________________________________(答出两点)。
(2)若将图乙中质粒和图甲中木乃伊基因通过同种限制酶处理后，构建重组质粒，应选用的限制酶是________，选择理由是__________________________
________________________________________________________________。
(3)经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因不能正确表达，最可能的原因是_____________________________________________________
______________________________________________________________。
(4)据图丙分析，培养基除了含有细菌生长繁殖必需的成分外，培养基A、B还应分别含有________。从检测筛选的结果分析，含有目的基因的是________菌落中的细菌。
题型二　PCR中引物的设计与选择
利用PCR扩增目的基因(如干扰素基因)时，设计引物序列的主要依据是有一段已知目的基因(干扰素基因)的核苷酸序列。所以引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。
(1)引物的作用：Taq DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，Taq DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链。不同引物可结合不同的目的基因并进行扩增。
(2)设计引物应遵循的主要原则
①引物长度应大于16个核苷酸，可防止随机结合。
②引物与靶序列间的Tm(指当50%的引物和靶序列表现为双链DNA分子时的温度)不应过低。
③引物不应有发夹结构，即不能有4 bp以上的回文序列。
④2个引物间不应有4 bp以上的互补序列或同源序列。
⑤引物中碱基的分布应尽可能均匀，G＋C含量接近50%。
(3)引物的处理
由于引物延伸从3′端开始，3′端不能进行任何修饰，引物5′端对扩增特异性影响不大，因此，可给予修饰而不影响扩增特异性。引物5′端修饰包括加酶切位点、标记生物素、荧光等。为了使经PCR扩增的目的基因能与载体正常结合，需要在2种引物的5′端添加不同的限制酶的识别序列。其目的是保证目的基因定向插入载体并避免目的基因自身环化。
(4)PCR循环时与引物相关的计算
PCR经过n次循环产生的DNA数为2n，一共有2n＋1条链，其中有2条链是DNA母链，不含引物，其他的每1条链均含1个引物，并且2种引物的数量相等，故PCR过程经过n次循环，需要的引物总个数是2n＋1－2，需要某一种引物的总个数是(2n＋1－2)×(1/2)＝2n－1。一个DNA由1条母链和第1种引物延伸的子链组成，另一个DNA由另1条母链和第2种引物延伸的子链组成，其他的DNA均由2种引物延伸的2条子链组成。
[例2] (2024·黑吉辽卷，25)将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒(辅助
T－DNA转移)和不含有Vir基因、含有T－DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。
注：F1－F3，R1－R3表示引物；T－DNA－LB表示左边界；T－DNA－RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。
(1)从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是
_________________________________________________________________。
提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是
_________________________________________________________________。
(2)本操作中获取目的基因的方法是________和________。
(3)穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是________________________，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是
___________________________________________________________________________________________________________________________________。
(4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用________基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。
(5)为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是________和________。
(6)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是________(单选)。
A.通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞
B.将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达
C.将1～1 362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列
D.用1～1 362合成基因序列和1 363～1 848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白
突破2　PCR定点突变技术
题型一　重叠延伸PCR技术
重叠延伸PCR技术其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(图中的引物2和3，突起处代表与模板链不能互补的突变位点)，分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。如某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图：
题型二　大引物PCR技术
大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。原理如图。
题型三　反向PCR扩增已知序列两侧的未知序列
当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。原理是：用限制酶消化该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。原理如图。
[例1] (2024·广东惠州调研)重叠延伸PCR技术是设计含突变点碱基的互补核苷酸片段的引物，在PCR过程中，互补的核苷酸片段形成重叠，重叠的部分互为模板，通过多次PCR扩增，从而获得突变基因的方法。科学家将枯草芽孢杆菌基因组上的甘油激酶编码基因glpk的第270位氨基酸M突变为I，构建出了对甘油的利用水平大大提升的枯草芽孢杆菌，其原理如下图。请回答下列问题：
(1)含突变点碱基的互补核苷酸片段的引物是图中的________。通过PCR1获得产物AB需要进行________次的PCR扩增。
(2)本实验获得点突变的目的基因两端为平末端，为便于构建基因表达载体，需要将限制酶BamHⅠ和SalⅠ的识别序列分别引入诱变甘油激酶编码基因的两端，操作思路是__________________________________________________________
_________________________________________________________________。
(3)获取目的基因后，构建质粒载体，形成基因表达载体。基因表达载体上保证其能在宿主细胞中扩增的结构是________，保证目的基因能正常转录的结构是_________________________________________________________________。
(4)对甘油激酶的改造属于________工程的应用，其第一步是_________________________________________________________________。
[例2] (2024·南通一模)重叠延伸PCR定点突变过程分为两步，如图1。内皮抑素能通过抑制血管内皮细胞的增殖和血管的生成限制肿瘤细胞的生长。研究人员利用重叠延伸PCR定点突变技术将内皮抑素基因endo改造为能进入癌细胞并有较强抑癌作用的突变基因endo(m)，并再与抗Her2(人表皮生长因子受体2)的纳米抗体基因Dim形成融合基因Dim－endo(m)，导入大肠杆菌并表达，主要过程如图2，其中KanR表示卡那霉素抗性基因，调节基因LacI的表达产物能和操纵基因LacO结合抑制基因的表达，IPTG能与LacI的表达产物结合，诱导目的基因的表达。请回答下列问题。
(1)图1中PCR1和PCR2配制反应体系时需加入不同的________。图2中构建重组质粒时使用的限制酶是________________。
(2)下列①～⑥是相关引物，其中突变1F为引物①，则突变1R、突变2F、突变2R分别为________、________、________。
①5′－GCGGCATGCGGGGCGATCGCGTGACTGCCAGTGCTGTCC－3′
②5′－CCGGAATTCCATATGCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGC－3′
③5′－GATCGCCCCGCATGCCGCGAGAGCCACTGACGAGTCCGC－3′
④5′－GTGGCATGGCTCGGACGCAAACGGGCGCAGGCTG－3′
⑤5′－ATTTCTCGAGTTACTTGGAGGCAGTCATGAAGCTG－3′
⑥5′－CAGCCTGCGCCCGTTTGCGTCCGAGCCATGCCAC－3′
(3)导入重组质粒的大肠杆菌由于调节基因LacI的表达产物能和操纵基因LacO结合，阻止________________酶的移动，抑制Dim－endo(m)的转录。当菌株扩大培养到一定数量后在培养基中加入________________，使Dim－endo(m)持续表达。
(4)研究表明，乳腺癌常出现Her2基因的高表达(不同乳腺癌细胞的表达有差异)，因此Her2被认为是乳腺癌检测和治疗的重要靶点。研究人员用不同浓度Dim－endo(m)融合蛋白处理乳腺癌细胞SKBR3、MDA231、MCF7和正常乳腺细胞HBL100作为实验组，选取正常培养的乳腺癌细胞和正常乳腺细胞作为对照组，一段时间后分别测定对照组和实验组的细胞数并计算抑制率，结果如图所示，抑制率的计算公式是________________________。Dim－endo(m)融合蛋白对不同乳腺癌细胞的抑制率不同，其可能原因是
____________________________________________________________。
(5)纳米抗体是传统抗体的重链可变区片段，只有传统抗体的1/10，但内部存在更多的二硫键，结构更稳定。与传统抗体相比，纳米抗体的优点是_______________________________________________________________
_________________________________________________________________。
课时4　突破基因工程类大题
突破1
[例1]　(1)PCR扩增是完全解旋后进行复制，在高温条件下解旋，不需要解旋酶，而体内DNA复制是边解旋边复制，需要解旋酶解旋
(2)BamHⅠ　用BamHⅠ来切割目的基因和质粒，切割后能保留完整的目的基因和标记基因(合理即可)
(3)同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因与质粒反向连接
(4)青霉素、四环素　4和6
解析　(1)PCR扩增是完全解旋后进行复制，在高温条件下解旋，不需要解旋酶，而体内DNA复制是边解旋边复制，需要解旋酶解旋。(2)能够获取目的基因并切开质粒的限制酶有识别序列为G↓GATCC的BamHⅠ和识别序列为↓GATC的MboⅠ，若使用MboⅠ会同时破坏质粒中的青霉素抗性基因和四环素抗性基因，所以要用BamHⅠ来切割目的基因和质粒，切割后保留了完整的青霉素抗性基因，便于筛选出含有重组质粒的大肠杆菌。(3)因为目的基因和载体是用同种限制酶切割的，同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因与质粒反向连接，导致目的基因不能正确表达。(4)用限制酶BamHⅠ对质粒进行切割时，会破坏四环素抗性基因，但不会破坏青霉素抗性基因，因此导入重组质粒的大肠杆菌能在含有青霉素的培养基上生存，但不能在含有四环素的培养基上生存。所以图丙培养基A和培养基B还应分别含有青霉素、四环素。从检测筛选的结果分析，培养基A中含有菌落4和6，培养基B中不含菌落4和6，故含目的基因的是4和6菌落中的细菌。
[例2]　(1)水解蛋白质，使得DNA与蛋白质分离　溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA
(2)PCR技术扩增　人工合成
(3)RNA聚合酶识别并结合的部位　提高目的基因的转录效率
(4)HygBR　(5)F3　R2　(6)D
解析　(1)从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是水解蛋白质，使得DNA与蛋白质分离。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA。(2)本操作中获取目的基因的方法是人工合成法和PCR技术扩增法。(3)穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是RNA聚合酶识别并结合的部位，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是提高目的基因的转录效率。(4)结合基因表达载体的示意图，根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用HygBR基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。(5)为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是F3和R2。(6)D项所述内容制造了新的蛋白质，属于蛋白质工程。
突破2
[例1]　(1)b和c　3/三　(2)将带有BamHⅠ和SalⅠ的识别序列的DNA片段用限制酶切出平末端，再使用T4 DNA连接酶将其与突变产物的两端相连接　(3)复制原点　启动子和终止子　(4)蛋白质　预期蛋白质的功能
解析　(1)根据题图可知，含突变点碱基的互补核苷酸片段的引物是图中的b和c；PCR过程是核苷酸链从5′端向3′端的延伸过程，从目标DNA链中PCR出产物AB需要进行3次PCR循环(第一次循环扩增出来的新片段很长很长；第二次循环以新的长片段为模板进行，但新片段的一端是引物开头的，所以第二个循环得到的片段就是我们需要的长度，但只是一条链，所以还不能分离出目的基因；第三次循环，当以第二次循环得到的新片段为模板时，因为这个片段的长度就是需要扩增的长度，当第三次循环完成时，这个片段是需要的长度，且是双链DNA，这就得到了需要的目的基因了)。(2)将带有BamHⅠ和SalⅠ的识别序列的DNA片段用限制酶切出平末端，再使用T4 DNA连接酶将其与突变产物的两端相连接，可将限制酶BamHⅠ和SalⅠ的识别序列分别引入诱变甘油激酶编码基因的两端。(3)获取目的基因后，可将其与质粒重组。基因表达载体上保证其能在宿主细胞中扩增的结构是复制原点，保证目的基因能正常转录的结构是启动子(RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终表达出蛋白质)和终止子(位于基因的下游，也是一段特殊的DNA片段，功能：终止mRNA的转录)。(4)蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求，结合题意对甘油激酶的改造属于蛋白质工程的应用，其第一步是预期蛋白质的功能。
[例2]　(1)引物　EcoRⅠ、HindⅢ　(2)③　④　⑥
(3)RNA聚合　IPTG　(4)(1－实验组细胞数/对照组细胞数)×100%　不同乳腺癌细胞Her2基因的表达水平不同，进入癌细胞的Dim－endo(m)融合蛋白的数量有差异；[Dim－endo(m)融合蛋白中的endo(m)对不同乳腺癌细胞的杀伤力不同]
(5)穿透力强，作用持久，免疫原性弱
解析　(1)DNA聚合酶要延伸DNA链，必须要有一个3′端的羟基，没有这个结构，DNA聚合酶无法延伸DNA。引物为DNA聚合酶提供3′端羟基，使得PCR继续，因此必须选用不同的引物，保证它们能够复制；要从含有endo(m)基因的DNA分子中获得endo(m)基因并保留突变位点，只能选用EcoRⅠ、HindⅢ来切割，同时将endo(m)基因插入质粒时需要保留KanR、LacI等，所以选用EcoRⅠ、HindⅢ这两种限制酶来处理DNA分子和质粒。(2)根据引物的作用及特点，如果突变1F为引物①，则突变1R、突变2F、突变2R的引物分别为③、④、⑥。(3)由题干可知，当调节基因LacI的表达产物能和操纵基因LacO结合抑制Dim－endo(m)的转录，而转录过程需要RNA聚合酶来催化，因此LacI的表达产物能和操纵基因LacO结合，阻止RNA聚合酶的移动而阻止转录过程；由题干可知，IPTG能与LacI的表达产物结合，诱导目的基因的表达，因此当菌株扩大培养到一定数量后在培养基中加入IPTG能促进Dim－endo(m)持续表达。(4)抑制率＝(对照组平均细胞数—实验组平均细胞数)/对照组平均细胞数×100%，即抑制率＝(1－实验组平均细胞数/对照组平均细胞数)×100%；由题意可知，不同乳腺癌细胞的Her2基因表达有差异，因此用不同浓度的Dim－endo(m)融合蛋白处理乳腺癌细胞后融合的细胞数量不相同，从而对不同乳腺癌细胞的抑制率不同。(5)纳米抗体内部存在更多的二硫键，其结构更稳定，作用的时间更长；纳米抗体是传统抗体的重链可变区片段，意味着纳米抗体与传统抗体同源性比较近，它的免疫原性比较弱；纳米抗体只有传统抗体的1/10，分子更小，具有较强的穿透力；纳米抗体可以在微生物系统(如细菌、酵母菌、真菌)中大量表达，并且可以通过展示文库中快速筛选，使得纳米抗体具备更低的生产成本优势。(共47张PPT)
突破基因工程类大题
课 时 4
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热点 考情
RT－RCR、实时荧光定量、PCR与反向PCR ①2022·全国乙卷，38；②2022·江苏卷，24；
①2020·江苏卷，33；②2020·山东卷，25
PCR定点诱变技术 ①2023·辽宁卷，25；①2021·天津卷，16
热点 考情
单酶切导致的正、反接的电泳检测和PCR检测 ①2024·黑吉辽卷，17、25；②2024·全国甲卷，38；
③2024·河北卷，24；④2024·湖南卷，15；⑤2024·江西卷，12；⑥2024·浙江6月选考，19、20；
①2023·山东卷，25；①2022·福建卷，13
目 录
突破1
基因工程的热考题型
PCR定点突变技术
突破2
突破1　
基因工程的热考题型
题型一　限制酶的选择技巧
(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点选择限制酶
①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点，如图乙)
(2)根据质粒的特点选择限制酶(如图)
[例1] (2024·巴蜀中学适应考)科学家从大量木乃伊中获得少量木乃伊DNA，进行克隆，复制了2400年前的DNA。某生物兴趣小组同学模拟了其中部分研究过程，设计了如下实验(MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ为4种限制性内切核酸酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG)。请回答以下问题：
(1)从解旋过程进行分析，PCR扩增木乃伊基因与体内DNA复制过程不相同的地方是_______________________________________________________________
________________________________________________________(答出两点)。
(2)若将图乙中质粒和图甲中木乃伊基因通过同种限制酶处理后，构建重组质粒，应选用的限制酶是________，选择理由是_______________________________
___________________________________________________________________。
PCR扩增是完全解旋后进行复制，在高温条件下解旋，不需要解旋酶，而体内DNA复制是边解旋边复制，需要解旋酶解旋
BamHⅠ
用BamHⅠ来切割目的基因和质粒，切割后能保留完整的目的基因和标记基因(合理即可)
(3)经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因不能正确表达，最可能的原因是__________________________________________________________。
(4)据图丙分析，培养基除了含有细菌生长繁殖必需的成分外，培养基A、B还应分别含有______________。从检测筛选的结果分析，含有目的基因的是___________菌落中的细菌。
同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因与质粒反向连接
青霉素、四环素
4和6
解析　(1)PCR扩增是完全解旋后进行复制，在高温条件下解旋，不需要解旋酶，而体内DNA复制是边解旋边复制，需要解旋酶解旋。(2)能够获取目的基因并切开质粒的限制酶有识别序列为G↓GATCC的BamHⅠ和识别序列为↓GATC的MboⅠ，若使用MboⅠ会同时破坏质粒中的青霉素抗性基因和四环素抗性基因，所以要用BamHⅠ来切割目的基因和质粒，切割后保留了完整的青霉素抗性基因，便于筛选出含有重组质粒的大肠杆菌。(3)因为目的基因和载体是用同种限制酶切割的，同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因与质粒反向连接，导致目的基因不能正确表达。
(4)用限制酶BamHⅠ对质粒进行切割时，会破坏四环素抗性基因，但不会破坏青霉素抗性基因，因此导入重组质粒的大肠杆菌能在含有青霉素的培养基上生存，但不能在含有四环素的培养基上生存。所以图丙培养基A和培养基B还应分别含有青霉素、四环素。从检测筛选的结果分析，培养基A中含有菌落4和6，培养基B中不含菌落4和6，故含目的基因的是4和6菌落中的细菌。
题型二　PCR中引物的设计与选择
利用PCR扩增目的基因(如干扰素基因)时，设计引物序列的主要依据是有一段已知目的基因(干扰素基因)的核苷酸序列。所以引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。
(1)引物的作用：Taq DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，Taq DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链。不同引物可结合不同的目的基因并进行扩增。
(2)设计引物应遵循的主要原则
①引物长度应大于16个核苷酸，可防止随机结合。
②引物与靶序列间的Tm(指当50%的引物和靶序列表现为双链DNA分子时的温度)不应过低。
③引物不应有发夹结构，即不能有4 bp以上的回文序列。
④2个引物间不应有4 bp以上的互补序列或同源序列。
⑤引物中碱基的分布应尽可能均匀，G＋C含量接近50%。
(3)引物的处理
由于引物延伸从3′端开始，3′端不能进行任何修饰，引物5′端对扩增特异性影响不大，因此，可给予修饰而不影响扩增特异性。引物5′端修饰包括加酶切位点、标记生物素、荧光等。为了使经PCR扩增的目的基因能与载体正常结合，需要在2种引物的5′端添加不同的限制酶的识别序列。其目的是保证目的基因定向插入载体并避免目的基因自身环化。
(4)PCR循环时与引物相关的计算
PCR经过n次循环产生的DNA数为2n，一共有2n＋1条链，其中有2条链是DNA母链，不含引物，其他的每1条链均含1个引物，并且2种引物的数量相等，故PCR过程经过n次循环，需要的引物总个数是2n＋1－2，需要某一种引物的总个数是(2n＋1－2)×(1/2)＝2n－1。一个DNA由1条母链和第1种引物延伸的子链组成，另一个DNA由另1条母链和第2种引物延伸的子链组成，其他的DNA均由2种引物延伸的2条子链组成。
[例2] (2024·黑吉辽卷，25)将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒(辅助T－DNA转移)和不含有Vir基因、含有T－DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。
注：F1－F3，R1－R3表示引物；T－DNA－LB表示左边界；T－DNA－RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。
(1)从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是_________________________________。
提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是___________________
_________________________________。
水解蛋白质，使得DNA与蛋白质分离
溶解蛋白质等物质，
析出不溶于酒精的DNA
(2)本操作中获取目的基因的方法是______________和________。
(3)穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是______________________________，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是________________________________。
PCR技术扩增
人工合成
RNA聚合酶识别并结合的部位
提高目的基因的转录效率
(4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用________基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。
(5)为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是________和________。
HygBR
F3
R2
(6)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是________(单选)。
A.通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞
B.将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达
C.将1～1 362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列
D.用1～1 362合成基因序列和1 363～
1 848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白
D
解析　(1)从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是水解蛋白质，使得DNA与蛋白质分离。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA。(2)本操作中获取目的基因的方法是人工合成法和PCR技术扩增法。(3)穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是RNA聚合酶识别并结合的部位，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是提高目的基因的转录效率。
(4)结合基因表达载体的示意图，根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用HygBR基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。(5)为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是F3和R2。(6)D项所述内容制造了新的蛋白质，属于蛋白质工程。
突破2　
PCR定点突变技术
题型一　重叠延伸PCR技术
重叠延伸PCR技术其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(图中的引物2和3，突起处代表与模板链不能互补的突变位点)，分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。如某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图：
题型二　大引物PCR技术
大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。原理如图。
题型三　反向PCR扩增已知序列两侧的未知序列
当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。原理是：用限制酶消化该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。原理如图。
[例1] (2024·广东惠州调研)重叠延伸PCR技术是设计含突变点碱基的互补核苷酸片段的引物，在PCR过程中，互补的核苷酸片段形成重叠，重叠的部分互为模板，通过多次PCR扩增，从而获得突变基因的方法。科学家将枯草芽孢杆菌基因组上的甘油激酶编码基因glpk的第270位氨基酸M突变为I，构建出了对甘油的利用水平大大提升的枯草芽孢杆菌，其原理如图。请回答下列问题：
(1)含突变点碱基的互补核苷酸片段的引物是图中的________。通过PCR1获得产物AB需要进行________次的PCR扩增。
(2)本实验获得点突变的目的基因两端为平末端，为便于构建基因表达载体，需要将限制酶BamHⅠ和SalⅠ的识别序列分别引入诱变甘油激酶编码基因的两端，操作思路是__________________________________
__________________________________________________________________________。
b和c
3/三
将带有BamHⅠ和SalⅠ的识别序列的DNA片段用限制酶切出平末端，再使用T4 DNA连接酶将其与突变产物的两端相连接
(3)获取目的基因后，构建质粒载体，形成基因表达载体。基因表达载体上保证其能在宿主细胞中扩增的结构是________，保证目的基因能正常转录的结构是______________________________。
(4)对甘油激酶的改造属于________工程的应用，其第一步是____________________。
复制原点
启动子和终止子
蛋白质
预期蛋白质的功能
解析　(1)根据题图可知，含突变点碱基的互补核苷酸片段的引物是图中的b和c；PCR过程是核苷酸链从5′端向3′端的延伸过程，从目标DNA链中PCR出产物AB需要进行3次PCR循环(第一次循环扩增出来的新片段很长很长；第二次循环以新的长片段为模板进行，但新片段的一端是引物开头的，所以第二个循环得到的片段就是我们需要的长度，但只是一条链，所以还不能分离出目的基因；第三次循环，当以第二次循环得到的新片段为模板时，因为这个片段的长度就是需要扩增的长度，当第三次循环完成时，这个片段是需要的长度，且是双链DNA，这就得到了需要的目的基因了)。
(2)将带有BamHⅠ和SalⅠ的识别序列的DNA片段用限制酶切出平末端，再使用T4 DNA连接酶将其与突变产物的两端相连接，可将限制酶BamHⅠ和SalⅠ的识别序列分别引入诱变甘油激酶编码基因的两端。
(3)获取目的基因后，可将其与质粒重组。基因表达载体上保证其能在宿主细胞中扩增的结构是复制原点，保证目的基因能正常转录的结构是启动子(RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终表达出蛋白质)和终止子(位于基因的下游，也是一段特殊的DNA片段，功能：终止mRNA的转录)。
(4)蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求，结合题意对甘油激酶的改造属于蛋白质工程的应用，其第一步是预期蛋白质的功能。
[例2] (2024·南通一模)重叠延伸PCR定点突变过程分为两步，如图1。内皮抑素能通过抑制血管内皮细胞的增殖和血管的生成限制肿瘤细胞的生长。研究人员利用重叠延伸PCR定点突变技术将内皮抑素基因endo改造为能进入癌细胞并有较强抑癌作用的突变基因endo(m)，并再与抗Her2(人表皮生长因子受体2)的纳米抗体基因Dim形成融合基因Dim－endo(m)，导入大肠杆菌并表达，主要过程如图2，其中KanR表示卡那霉素抗性基因，调节基因LacI的表达产物能和操纵基因LacO结合抑制基因的表达，IPTG能与LacI的表达产物结合，诱导目的基因的表达。请回答下列问题。
(1)图1中PCR1和PCR2配制反应体系时需加入不同的________。图2中构建重组质粒时使用的限制酶是________________。
引物
EcoRⅠ、HindⅢ
(2)下列①～⑥是相关引物，其中突变1F为引物①，则突变1R、突变2F、突变2R分别为________、________、________。
①5′－GCGGCATGCGGGGCGATCGCGTGACTGCCAGTGCTGTCC－3′
②5′－CCGGAATTCCATATGCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGC－3′
③5′－GATCGCCCCGCATGCCGCGAGAGCCACTGACGAGTCCGC－3′
④5′－GTGGCATGGCTCGGACGCAAACGGGCGCAGGCTG－3′
⑤5′－ATTTCTCGAGTTACTTGGAGGCAGTCATGAAGCTG－3′
⑥5′－CAGCCTGCGCCCGTTTGCGTCCGAGCCATGCCAC－3′
③
④
⑥
(3)导入重组质粒的大肠杆菌由于调节基因LacI的表达产物能和操纵基因LacO结合，阻止________________酶的移动，抑制Dim－endo(m)的转录。当菌株扩大培养到一定数量后在培养基中加入________________，使Dim－endo(m)持续表达。
RNA聚合
IPTG
(4)研究表明，乳腺癌常出现Her2基因的高表达(不同乳腺癌细胞的表达有差异)，因此Her2被认为是乳腺癌检测和治疗的重要靶点。研究人员用不同浓度Dim－endo(m)融合蛋白处理乳腺癌细胞SKBR3、MDA231、MCF7和正常乳腺细胞HBL100作为实验组，选取正常培养的乳腺癌细胞和正常乳腺细胞作为对照组，一段时间后分别测定对照组和实验组的细胞数并计算抑制率，结果如图所示，抑制率的计算公式是_____________________________________。Dim－endo(m)融合蛋白对不同乳腺癌细胞的抑制率不同，其可能
原因是_____________________________________
___________________________________________
___________________________________________
________________________________。
(1－实验组细胞数/对照组细胞数)×100%
不同乳腺癌细胞Her2基因的表达水平不同，进入癌细胞的Dim－endo(m)融合蛋白的数量有差异；[Dim－endo(m)融合蛋白中的endo(m)对不同乳腺癌细胞的杀伤力不同]
(5)纳米抗体是传统抗体的重链可变区片段，只有传统抗体的1/10，但内部存在更多的二硫键，结构更稳定。与传统抗体相比，纳米抗体的优点是___________________________________________________________________。
穿透力强，作用持久，免疫原性弱
解析　(1)DNA聚合酶要延伸DNA链，必须要有一个3′端的羟基，没有这个结构，DNA聚合酶无法延伸DNA。引物为DNA聚合酶提供3′端羟基，使得PCR继续，因此必须选用不同的引物，保证它们能够复制；要从含有endo(m)基因的DNA分子中获得endo(m)基因并保留突变位点，只能选用EcoRⅠ、HindⅢ来切割，同时将endo(m)基因插入质粒时需要保留KanR、LacI等，所以选用EcoRⅠ、HindⅢ这两种限制酶来处理DNA分子和质粒。(2)根据引物的作用及特点，如果突变1F为引物①，则突变1R、突变2F、突变2R的引物分别为③、④、⑥。
(3)由题干可知，当调节基因LacI的表达产物能和操纵基因LacO结合抑制Dim－endo(m)的转录，而转录过程需要RNA聚合酶来催化，因此LacI的表达产物能和操纵基因LacO结合，阻止RNA聚合酶的移动而阻止转录过程；由题干可知，IPTG能与LacI的表达产物结合，诱导目的基因的表达，因此当菌株扩大培养到一定数量后在培养基中加入IPTG能促进Dim－endo(m)持续表达。(4)抑制率＝(对照组平均细胞数—实验组平均细胞数)/对照组平均细胞数×100%，即抑制率＝(1－实验组平均细胞数/对照组平均细胞数)×100%；由题意可知，不同乳腺癌细胞的Her2基因表达有差异，因此用不同浓度的Dim－endo(m)融合蛋白处理乳腺癌细胞后融合的细胞数量不相同，从而对不同乳腺癌细胞的抑制率不同。
(5)纳米抗体内部存在更多的二硫键，其结构更稳定，作用的时间更长；纳米抗体是传统抗体的重链可变区片段，意味着纳米抗体与传统抗体同源性比较近，它的免疫原性比较弱；纳米抗体只有传统抗体的1/10，分子更小，具有较强的穿透力；纳米抗体可以在微生物系统(如细菌、酵母菌、真菌)中大量表达，并且可以通过展示文库中快速筛选，使得纳米抗体具备更低的生产成本优势。限时练26 突破基因工程类大题
(时间：40分钟　分值：50分)
【综合提升】　
1.(14分)(2024·厦门外国语学校调研)转录因子FOXO1与DNA结合可提高某些促凋亡基因的转录水平，促进神经元凋亡。让FOXO1基因发生定点突变，使其表达的蛋白第249位点的丝氨酸替换为天冬氨酸，用来模拟FOXO1被蛋白激酶Cdk5磷酸化后的状态。
(1)(8分)定点突变是利用PCR等方法，在引物中引入突变序列，从而实现目的基因的定向改造。以已有的质粒a0为模板(如图1，★代表突变位点)，将质粒a0定点突变成质粒a1。
①为了将突变序列准确地定位在目标序列上，引物部分序列应与FOXO1基因拟突变位点两端的序列________________。将FOXO1基因与GFP(绿色荧光蛋白)基因进行融合的目的是___________________________________________
________________________________________________________________。
②天冬氨酸的密码子为GAC，丝氨酸的密码子为UCU，正向引物★处的碱基序列为____________________________________________________________。
③至少经过________轮PCR，可以得到发生定点突变的质粒a1。
图2　两组实验的扩增产物DNA电泳结果，M为DNA标准参照物，对照组不加模板
④探究引物组合1与引物组合2扩增目的基因的效果，根据图2的实验结果分析，哪对引物更适合作为定点突变的引物？____________(填“引物组合1”或“引物组合2”)，另一引物组合没有扩增产物的原因可能是
_______________________________________________________________。
(2)(2分)在过氧化物诱导下，Cdk5会磷酸化FOXO1 249位点的丝氨酸，科研人员试图探究其在细胞内的分布是否会发生改变。将构建好的质粒a1转染进体外培养的原代神经元中，对照组的神经元需要转染质粒a0。一段时间后，发现对照组的绿色荧光主要集中在细胞核中，而实验组的绿色荧光滞留在细胞质中。推测FOXO1被Cdk5磷酸化后，对凋亡起到抑制作用的原理是
__________________________________________________________________
______________________________________________________。
(3)(4分)为了使课题研究更加完善，现有以下两种实验思路，请补充完整。
思路1：还可对比(2)中对照组与实验组的______________________________
__________________________________________________________________。
思路2：利用某种药物抑制____________________，检测受过氧化物诱导后的FOXO1在细胞中的分布情况。
2.(16分)(2024·江西九校联考)基因工程中的载体分为克隆载体和表达载体。克隆载体用来克隆和扩增DNA片段，而表达载体可使外源基因在宿主细胞中有效表达。胡萝卜抗冻蛋白基因(afp)是人类发现的第一个植物抗冻蛋白基因，对于植物抗冻基因工程具有非常重要的意义。如表为几种限制酶的识别序列及酶切位点，如图表示构建afp基因表达载体的过程，其中PUCm－T、PBI121为人工改造后的质粒，LacZ基因可用于重组质粒的筛选。
限制酶 识别序列
BamHⅠ 5′—G↓GATCC—3′
EcoRⅠ 5′—G↓AATTC—3′
PstⅠ 5′—C↓TGCAG—3′
XbaⅠ 5′—T↓CTAGA—3′
SmaⅠ 5′—CCC↓GGG—3′
(1)(4分)通过PCR可获得大量的afp基因，PCR的原理是________________________，扩增时需选用的引物为____________。
(2)(4分)PCR产物往往在引物端含有多个A聚合的尾，而PUCm－T尾端由多个T聚合，所以在构建克隆载体时不需要用限制酶处理afp和PUCm－T，理由是__________________________________________________________________
_________________________________________________________________。
(3)(4分)LacZ基因编码的β－半乳糖苷酶可催化乳糖水解，培养基中添加的物质IPTG可诱导LacZ基因的表达，将培养基中的白色物质X－gal转化为蓝色物质。据图分析，成功导入克隆载体的大肠杆菌菌落呈________(填“白色”或“蓝色”)，理由是______________________________________________________
_________________________________________________________________
_______________________________________________。
(4)(4分)提取大肠杆菌中的克隆载体后，先用EcoRⅠ处理克隆载体，再将两端形成的黏性末端补平，补平后再用XbaⅠ处理，得到了一端平末端，一端黏性末端的afp，同时选用________________(从表中选择)处理PBI121质粒，然后用DNA连接酶将PBI121与afp进行连接，构建afp基因表达载体。在此过程中，使afp的两端形成不同的末端的意义是___________________________________
________________________________________________________________。
3.(20分)(2024·湖南长郡中学调研)IKK激酶由IKKα、IKKβ和IKKγ三种亚基组成，该酶参与动物体内免疫细胞的分化。临床上发现某重症联合免疫缺陷(SCID)患儿的IKKβ基因编码区第1 183位碱基T突变为C。为研究该患儿发病机制，研究人员应用大引物PCR定点突变技术获得突变基因，并培育出SCID模型小鼠。图1为定点突变获得突变基因的过程。
(1)(7分)在定点突变获取突变基因时，PCR1中使用的引物有________，PCR2中使用的引物有____________。PCR1和PCR2不能在同一个反应体系中进行，原因是__________________________________________________________________
_______________________________________________________________。
(2)(7分)PCR在第一个循环之前通常将DNA样品加热至95 ℃数分钟进行预变性处理，其目的是______________________________________________________
___________________________________________________________________。
由于大引物较长，含C与G的碱基较多，为减少非目标基因的获得，在PCR2复性过程中应采取的措施是____________________________________________
__________________________________________________________________。
(3)(6分)培育模型鼠的过程中，需用限制酶SacⅠ、HindⅢ对突变基因和载体进行双酶切，双酶切的优点是___________________________________
________________________________________________________________。
研究人员经鉴定、筛选获得一只转基因杂合鼠HE，让HE与野生鼠杂交得F1，F1雌雄鼠随机交配得F2。对F2中纯合野生鼠WT、纯合突变鼠HO、杂合鼠HE三种小鼠胸腺淋巴细胞中组成IKK激酶的三种亚基进行提纯和电泳，结果如图2。据此结果推测SCID患者免疫缺陷产生的机制是
__________________________________________________________________
_________________________________________________________________。
限时练26　突破基因工程类大题
1.(1)①能够进行碱基互补配对　根据绿色荧光的分布，定位FOXO1被磷酸化后在细胞中的分布　②GAC　③2　④引物组合2　引物组合1的两个引物碱基互补配对的部分占比较高，降低了与模板链结合的概率　(2)FOXO1被Cdk5磷酸化后，无法进入细胞核，无法提高细胞核内某些促凋亡基因的转录水平(使促凋亡基因转录受阻)　(3)某些促凋亡基因的转录水平/神经元的凋亡程度　蛋白激酶Cdk5活性
解析　(1)①若要将突变序列准确地定位在目标序列上，引物部分序列应该与FOXO1基因拟突变位点两端的序列能够进行碱基互补配对。GFP(绿色荧光蛋白)可以发出绿色荧光，将FOXO1基因与GFP(绿色荧光蛋白)基因进行融合，以根据绿色荧光的分布，定位FOXO1被磷酸化后在细胞中的分布。②丝氨酸的密码子为UCU，图中该位点为AGA∥TCT，AGA对应的密码子为UCU，要想该密码子变为GAC，则AGA∥TCT要变为CTG∥GAC，正向引物★处与CTG互补配对，应为GAC。③至少经过2轮PCR可得到发生定点突变的质粒a1，第一轮PCR只改变了一条链上的碱基，第二轮PCR才会得到质粒a1。④分析图2可知，对照组(不加模板)和引物组合1组没有条带，引物组合2组有条带，说明引物组合2更适合作为定点突变的引物。引物组合1没有扩增产物的原因可能是引物组合1的两个引物碱基互补配对的部分占比较高，降低了与模板链结合的概率。(2)将构建好的质粒a1转染进体外培养的原代神经元中，对照组的神经元转染质粒a0，一段时间后，发现对照组的绿色荧光主要集中在细胞核中，而实验组的绿色荧光滞留在细胞质中。再结合题干信息“转录因子FOXO1与DNA结合可提高某些促凋亡基因的转录水平，促进神经元凋亡”，推测FOXO1被Cdk5磷酸化后，对凋亡起到抑制作用的原理是FOXO1被Cdk5磷酸化后，无法进入细胞核，无法提高细胞核内某些促凋亡基因的转录水平。
2.(1)DNA半保留复制　引物1和引物3
(2)afp的多个A聚合的尾与PUCm－T尾端多个聚合的T可以通过碱基互补配对相连　(3)白色　成功导入克隆载体的大肠杆菌中，afp插入LacZ基因内部，破坏了LacZ基因的结构，无法表达β－半乳糖苷酶，无法将培养基中的白色物质X－gal转化为蓝色物质　(4)XbaⅠ和SmaⅠ　可以防止afp反向连接，防止afp自身环化
解析　(1)PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。通过PCR可获得大量的afp基因。在PCR过程中，引物与解旋后的单链结合，结合在单链DNA的3′端，然后子链从引物的3′端开始延伸。因此，扩增时需选用的引物是引物1、引物3。(2)由于afp的多个A聚合的尾与PUCm－T尾端多个聚合的T可以通过碱基互补配对相连，因此在构建克隆载体时不需要用限制酶处理afp和PUCm－T。(3)据图分析可知，成功导入克隆载体的大肠杆菌中，afp插入了LacZ基因内部，使LacZ基因的结构受到破坏，无法表达β－半乳糖苷酶，无法将培养基中的白色物质X－gal转化为蓝色物质，大肠杆菌菌落呈白色。未成功导入克隆载体的大肠杆菌中，LacZ基因结构正常，可以表达β－半乳糖苷酶，可将培养基中的X－gal转化为蓝色物质，大肠杆菌菌落呈蓝色。(4)提取大肠杆菌中的克隆载体后，先用EcoRⅠ处理克隆载体，再将两端形成的黏性末端补平，补平后再用XbaⅠ处理，得到了一端平末端，一端黏性末端的afp，根据题表可知，应选用XbaⅠ(形成与afp相同的黏性末端)和SmaⅠ(形成平末端)处理PBI121质粒，然后用DNA连接酶将PBI121与afp进行连接，构建afp基因表达载体。afp的两端形成不同的末端，可以避免目的基因自身环化和反向连接。
3.(1)引物A、引物C　引物B、大引物b　引物之间能结合，会干扰引物和模板链的结合，影响PCR过程　(2)增加大分子模板DNA彻底变性的概率　适当提高复性温度　(3)防止质粒和目的基因的自身环化及反向连接　IKKβ基因突变导致IKKβ含量减少，IKK激酶活力降低，不利于免疫细胞的分化
解析　(1)在图1获取突变基因过程中，分析题图可知，在PCR1中，需要两种引物，将来在切取IKKβ基因时，需要在基因的左侧用限制酶HindⅢ来切割，在基因的右侧用限制酶SacⅠ来切割，因此在该基因的左端应有限制酶HindⅢ识别的序列，在基因的右端应有限制酶SacⅠ识别的序列，因此在PCR1中结合到基因右端的引物序列从5′端到3′端的开始部位应含有限制酶SacⅠ识别的序列，所以要用到引物C，从题图中看，另一个引物从5′端到3′端的序列中开始部位应含有突变碱基C，所以要用到引物A。从图中看，在PCR2中，有一个引物结合到了基因的左端，在它从5′端到3′端的序列的开始部位应含有限制酶HindⅢ识别的序列，所以要用到引物B，而另外的一个引物就是大引物中的一条链，它应该结合到基因的右端，且从5′端到3′端的序列中开始部位应含有SacⅠ识别的序列，从图中看，它是大引物b。由于PCR1和PCR2过程使用的引物之间能结合，因而会干扰引物和模板链的结合，影响PCR过程，因此PCR1和PCR2不能在同一个反应体系中进行，需要分开进行。(2)PCR在第一个循环之前通常将DNA样品加热至95 ℃数分钟进行预变性处理，这样可以增加大分子模板DNA彻底变性的概率，为后续的PCR过程创造条件。由于大引物较长，含C与G的碱基较多，为减少非目标基因的获得，在PCR2复性过程中应适当提高复性温度，便于引物与模板链的结合。(3)培育模型鼠的过程中，需用限制酶SacⅠ、HindⅢ对突变基因和载体进行双酶切，双酶切能保证质粒和目的基因的正确连接，避免自身环化及反向连接。研究人员经鉴定、筛选获得一只转基因杂合鼠HE，让HE与野生鼠杂交得F1，F1雌雄鼠随机交配得F2。对F2中纯合野生鼠WT、纯合突变鼠HO、杂合鼠HE三种小鼠胸腺淋巴细胞中组成IKK激酶的三种亚基进行提纯和电泳，结果显示HO小鼠体内不含IKKβ或含量很少，因而可推测IKKβ基因突变导致IKKβ含量减少，IKK激酶活力降低，不利于免疫细胞的分化，进而导致SCID患者表现为免疫缺陷。

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