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　发酵工程
1．传统发酵技术及发酵工程
(1)理清“3”种传统食品的制作技术
(2)制作果酒、果醋的装置图解读
①各部位的作用
Ⅰ.充气口：在醋酸发酵时连接充气泵进行充气。
Ⅱ.排气口：排出酒精发酵时产生的CO2。
Ⅲ.与排气口相连的长而弯曲的胶管：防止空气中微生物的污染。
Ⅳ.出料口：用于取样。
②该装置的使用方法
使用该装置制酒时，应该关闭充气口；制醋时，应将充气口连接充气泵，输入氧气。
(3)泡菜腌制过程中，乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐的变化
(4)发酵工程的基本环节
[点拨]　传统发酵食品制作过程中利用的是天然存在的菌种，不仅菌种存在差异，杂菌也是多样；而现代工业发酵工程通常通过微生物培养技术获得单一菌种进行发酵。
2．微生物培养、分离与计数
(1)无菌技术常用方法
(2)微生物的纯化技术
①制备马铃薯琼脂培养基
②两种纯化微生物方法的比较
特别提醒　a．为了确定培养基的灭菌是否合格，微生物实验一般会设置空白对照：随机取若干灭菌后的空白平板培养基在适宜条件下培养一段时间，观察培养基上是否有菌落生成。
b．观察菌落需要用固体培养基，因此培养基要添加凝固剂，如琼脂。
c．平板倒置既可以防止皿盖上的水珠落入培养基，又可以避免培养基中的水分过快的挥发。
(3)微生物分离与计数的两个实例
特别提醒　关注两种对照组与一种重复组
①将一未接种的选择培养基与接种的选择培养基一起培养——用于确认培养基灭菌是否彻底(制备是否合格)。
②将一接种的普通培养基与接种的选择培养基一起培养——用于确认选择培养基是否起“筛选”作用。
③进行微生物计数时，每一稀释度下至少涂布三个平板，即设置重复组，是为了求平均值，提高计数准确度。
易错辨析
1．判断下列有关传统发酵食品的制作技术的叙述
(1)果酒的家庭制作与啤酒的工业化生产相比，发酵前都需要对原料进行灭菌，发酵结束后都必须进行消毒以延长保存期(　　)
(2)制作果酒的葡萄汁不宜超过发酵瓶体积的2/3，制作泡菜的盐水要淹没全部菜料(　　)
(3)葡萄果皮上有酵母菌和醋酸菌，制作好葡萄酒后，可直接通入无菌空气制作葡萄醋(　　)
(4)果醋发酵时，发酵液产生的气泡量明显少于果酒发酵时(　　)
(5)向泡菜坛盖边沿的水槽中注满水形成内部无菌环境(　　)
(6)青霉素具有杀菌作用，因此青霉素的工业化生产过程中发酵罐不需严格灭菌(　　)
2．判断下列有关微生物的基本培养技术的叙述
(1)将培养基分装于培养皿中后灭菌，可降低培养基污染的概率(　　)
(2)平板接种常用在微生物培养中，不含氮源的平板不能用于微生物培养，平板涂布时涂布器使用前必须进行消毒(　　)
(3)对航天器及洁净的组装车间进行环境微生物检测时需采用平板划线法等分离培养微生物，观察菌落特征(　　)
(4)涂布用的菌液的菌浓度应控制在30～300个/mL(　　)
(5)在分离产脲酶菌的实验中可分解酚红指示剂使其褪色的菌株是产脲酶菌株(　　)
1．(2024·湖北，1)制醋、制饴、制酒是我国传统发酵技术。醋酸菌属于好氧型原核生物，常用于食用醋的发酵。下列叙述错误的是(　　)
A．食用醋的酸味主要来源于乙酸
B．醋酸菌不适宜在无氧条件下生存
C．醋酸菌含有催化乙醇氧化成乙酸的酶
D．葡萄糖在醋酸菌中的氧化分解发生在线粒体内
2．(2023·山东，12)以下是以泡菜坛为容器制作泡菜时的4个处理：①沸盐水冷却后再倒入坛中；②盐水需要浸没全部菜料；③盖好坛盖后，向坛盖边沿的水槽中注满水；④检测泡菜中亚硝酸盐的含量。下列说法正确的是(　　)
A．①主要是为了防止菜料表面的醋酸杆菌被杀死
B．②的主要目的是用盐水杀死菜料表面的杂菌
C．③是为了使气体只能从泡菜坛排出而不能进入
D．④可检测到完整发酵过程中亚硝酸盐含量逐渐降低
3．(2024·山东，14)在发酵过程中，多个黑曲霉菌体常聚集成团形成菌球体，菌球体大小仅由菌体数量决定。黑曲霉利用糖类发酵产生柠檬酸时需要充足的氧。菌体内铵离子浓度升高时，可解除柠檬酸对其合成途径的反馈抑制。下列说法错误的是(　　)
A．相同菌体密度下，菌球体越大柠檬酸产生速率越慢
B．发酵中期添加一定量的硫酸铵可提高柠檬酸产量
C．发酵过程中pH下降可抑制大部分细菌的生长
D．发酵结束后，将过滤所得的固体物质进行干燥即可获得柠檬酸产品
4．(2024·江西，11)井冈霉素是我国科学家发现的一种氨基寡糖类抗生素，它由吸水链霉菌井冈变种(JGs，一种放线菌，菌体呈丝状生长)发酵而来，在水稻病害防治等领域中得到广泛应用。下列关于JGs发酵生产井冈霉素的叙述，正确的是(　　)
A．JGs可发酵生产井冈霉素，因为它含有能够编码井冈霉素的基因
B．JGs接入发酵罐前需要扩大培养，该过程不影响井冈霉素的产量
C．提高JGs发酵培养基中营养物质的浓度，会提高井冈霉素的产量
D．稀释涂布平板法不宜用于监控JGs发酵过程中活细胞数量的变化
5．(2024·黑吉辽，19改编)某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病，其筛选流程及抗性检测如图。下列操作正确的是(　　)
A．在大量感染香蕉枯萎病的香蕉种植园内，从感病植株上采集样品
B．将采集的样品充分消毒后，用蒸馏水冲洗，收集冲洗液进行无菌检测
C．将无菌检测合格的样品研磨，经稀释涂布平板法分离得到内生菌的单菌落
D．判断内生菌的抗性效果需比较接种内生菌的平板上的病原菌菌斑大小
题后总结　生物实验中常用到的水有清水、无菌水和生理盐水三类。清水常用于植物实验，生理盐水常用于动物实验，无菌水常用于微生物实验。
6．(2024·湖南，6)微生物平板划线和培养的具体操作如图所示，下列操作正确的是(　　)
A．①②⑤⑥ B．③④⑥⑦
C．①②⑦⑧ D．①③④⑤
1．(2024·湖北省新高考协作体高三一模)黄酒是世界上最古老的酒类之一，黄酒的制作流程主要为制曲→浸米→蒸煮(浸好的小米加入开水中煮熟)→拌曲→入缸发酵→压榨→装瓶。下列叙述正确的是(　　)
A．浸米有利于淀粉水解产生酒精从而提高酒的产量
B．入缸发酵时不能将搅拌好的煮熟小米装满发酵缸
C．浸好的小米煮熟后为避免杂菌污染需要立刻拌曲
D．为利于黄酒发酵，发酵温度应控制在30～35 ℃之间
2．(2024·青岛高三一模)黄桃精酿啤酒的制作工艺与普通啤酒有所不同，生产工艺流程为：麦芽→粉碎→糖化→过滤→煮沸→主发酵→后发酵(添加黄桃汁)→低温冷藏→成品→罐装。下列说法正确的是(　　)
A．利用大麦作原料时，淀粉是酵母菌的直接碳源
B．啤酒发酵过程中大部分糖的分解和代谢物的生成都在后发酵阶段完成
C．糖化是让麦芽糖分解形成糖浆，煮沸能够使酶失活及对糖浆灭菌
D．“精酿”啤酒发酵完成后，通常不需要进行过滤和消毒处理
3．使用时间过长的玩具表面可能会有细菌，可能会导致儿童患接触性皮炎。为了检测某玩具表面是否存在大肠杆菌，某团队进行了相关实验(如图所示)，该团队使用伊红—亚甲蓝染液(用于鉴别大肠杆菌，能使其菌落呈深紫色，并带有金属光泽)对培养基C进行染色，初步统计大肠杆菌的数量，图中1～6表示不同菌落。下列说法错误的是(　　)
A．对菌液进行系列梯度稀释，平板菌落数为30～300时适合进行计数
B．配制平板A时只需要加入碳源、氮源、水、无机盐这几类物质即可
C．图中平板B的接种方法为稀释涂布平板法，初步判断3是大肠杆菌的菌落
D．为保护儿童健康，平时可用75%的酒精对玩具进行擦拭消毒
4．(2024·菏泽高三二模)稻瘟菌引起的水稻稻瘟病是危害最为严重的真菌病害之一。土壤中某些微生物能合成并分泌几丁质酶，能抑制稻瘟菌的生长，可用于稻瘟病的防治。科研人员试图从土壤中筛选出能高效降解几丁质的菌株，通过微生物培养获得几丁质酶。下列说法错误的是(　　)
A．筛选土壤中目的微生物时需用以几丁质为唯一碳源的培养基
B．纯化培养时，可选择稀释涂布平板法或平板划线法接种
C．在以几丁质为唯一碳源的培养基上生长的菌落均能分泌几丁质酶
D．可依据单菌落周围“水解圈直径/菌落直径”的值来筛选目的菌株
5．(2024·岳阳高三二模)双层平板法是利用底层和上层均为牛肉膏蛋白胨培养基对噬菌体进行检测的方法。先在无菌培养皿中倒入琼脂含量是2%的培养基凝固成底层平板，再将琼脂含量是1%的培养基融化并冷却至45～48 ℃，加入宿主细菌和待测噬菌体稀释悬液的混合液，充分混匀后立即倒入底层平板上形成双层平板。一段时间后，在上层平板同一平面可见噬菌体侵染周围细菌导致宿主细胞裂解死亡形成的空斑(噬菌斑)。通常一个噬菌斑来自原液中的一个噬菌体。可根据噬菌斑的数目计算原液中噬菌体的数量，如图所示。下列叙述正确的是(　　)
A．上层培养基中琼脂浓度较低，因此形成的噬菌斑较大，更有利于计数
B．加入混合液后，使用灭菌后的涂布器将混合液均匀地涂布在培养基表面
C．牛肉膏蛋白胨培养基可作为选择培养基选择出噬菌体的宿主细胞
D．双层平板法获得的噬菌斑容易发生上下重叠现象
6．(2024·梅州高三一模)某兴趣小组为研究“使用公筷对餐后菜品细菌数量的影响”，将每道菜分为3盘，一盘取样冷藏，一盘使用公筷，一盘不用公筷，实验过程如图。下列相关操作或叙述正确的是(　　)
A．将细菌接种在固体培养基X上可采用平板划线法
B．根据菌落的特征可以准确判断细菌的种类
C．配制的培养基需经湿热灭菌后调整pH，冷却后倒平板
D．固体培养基X对菜品中的细菌没有选择性
答案精析
建网络　抓主干
①平板划线法　②酵母菌　③有氧
核心提炼
易错辨析
1．(1)×　家庭制作果酒时需要用到水果表面的酵母菌，所以不能对原料灭菌；家庭制作果酒发酵结束后不需要消毒处理。
(2)√
(3)×　醋酸菌为好氧细菌，且果醋发酵温度高于果酒发酵，因此制作好葡萄酒后，除通入无菌空气外，还需要适当提高发酵装置的温度。
(4)√
(5)×　向泡菜坛盖边沿的水槽中注满水形成内部无氧环境，不能形成无菌环境。
(6)×　由于某些杂菌能分泌青霉素酶，从而分解青霉素，为防止杂菌生长，发酵罐需要严格灭菌。
2．(1)×　培养基应先灭菌再分装于培养皿中。
(2)×　不含有氮源的平板可用来培养利用空气中氮气的微生物；平板涂布时涂布器使用前必须进行灭菌处理，以防止外来杂菌的污染。
(3)×　航天器及洁净的组装车间环境微生物很少，分离培养微生物，观察菌落特征，不采用平板划线法，应采用稀释涂布平板法等分离培养微生物。
(4)×　为了保证结果准确，一般选择菌落数为30～300的平板进行计数，而非涂布用的菌浓度控制在30～300个/mL。
(5)×　在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶催化尿素分解产生氨，氨会使培养基的pH升高，酚红指示剂将变红，因此在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，能对分离的菌种做进一步鉴定。
真题演练
1．D　[食用醋的酸味主要来自醋酸，醋酸学名为乙酸，A正确；醋酸菌是好氧型细菌，不适宜在无氧的条件下生存，B正确；在制醋时，缺失原料的情况下，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为乙酸，因此醋酸菌体内含有催化乙醇氧化成乙酸的酶，C正确；醋酸菌属于细菌，没有核膜包被的细胞核和众多细胞器，因此没有线粒体，D错误。]
2．C　[沸盐水冷却后再倒入坛中，盐水煮沸是为了杀灭杂菌，冷却之后使用是为了保证乳酸菌等微生物的生命活动不受影响，A错误；盐水需要浸没全部菜料，制造无氧环境，有利于乳酸菌的无氧呼吸，B错误；盖好坛盖后，向坛盖边沿的水槽中注满水，是为了隔绝空气、防止杂菌污染等，C正确；腌制泡菜过程中亚硝酸盐的含量先增多后减少，D错误。]
3．D　[黑曲霉利用糖类发酵产生柠檬酸时需要充足的氧，相同菌体密度下，菌球体越大越不利于菌体与氧气接触，则柠檬酸产生速率越慢，A正确；菌体内铵离子浓度升高时，可解除柠檬酸对其合成途径的反馈抑制，发酵中期添加一定量的硫酸铵，提高了铵离子浓度，菌体内可提高柠檬酸产量，B正确；发酵过程中pH下降导致细菌生命活动所必需的酶失活，可抑制大部分细菌的生长，C正确，发酵结束后，将过滤所得的固体物质进行分离纯化、浓缩、干燥等一系列操作后才能获得柠檬酸产品，D错误。]
4．D　[基因表达的产物是蛋白质，而井冈霉素是JGs发酵生产的一种氨基寡糖类抗生素，因此推测JGs含有能够编码合成井冈霉素相关酶的基因，A错误；JGs接入发酵罐前需要扩大培养，该过程会增加JGs的数量，进而影响井冈霉素的产量，使井冈霉素的产量得到提高，B错误；在一定范围内提高JGs发酵培养基中营养物质的浓度，会提高井冈霉素的产量，但若浓度过大，反而会降低井冈霉素的产量，C错误；根据题意可知，JGs菌体呈丝状生长，所以形成的菌落难以区分，因此稀释涂布平板法不宜用于监控JGs发酵过程中活细胞数量的变化，D正确。]
5．C　[某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病，故在大量感染香蕉枯萎病的香蕉种植园内，从未感病植株上采集样品，A错误；获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染；将采集的样品充分消毒后，用无菌水冲洗，收集冲洗液进行无菌检测，B错误；题图可知，样品研磨后进行了稀释涂布，可见将无菌检测合格的样品研磨，经稀释涂布平板法分离得到内生菌的单菌落，C正确；由题图抗性检测可知，判断内生菌的抗性效果需设置对照组和实验组，对照组不接种内生菌得到病原菌菌斑，实验组接种内生菌得到病原菌菌斑，然后比较对照组和实验组的菌斑大小，实验组病原菌菌斑越小表明内生菌抗性效果越好，D错误。]
6．D　[分析题图可知，拔出棉塞后完全握住棉塞会造成杂菌污染，应握住棉塞上部，②错误；划线时不能将培养皿完全打开，应在酒精灯火焰附近将培养皿打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划三至五条平行线，盖上皿盖，⑥错误；划线时第5次的划线不能与第1次的划线相连，⑦错误；平板应倒置培养，⑧错误。综上，正确的操作有①③④⑤。]
模拟预测
1．B　[浸米有利于淀粉水解产生葡萄糖，酵母菌经无氧呼吸将葡萄糖氧化分解才能生成酒精，A错误；入缸发酵时不能将搅拌好的煮熟小米装满发酵缸，以防止酵母菌进行酒精发酵过程中产生二氧化碳造成发酵液溢出，B正确；浸好的小米煮熟后温度较高，立刻拌曲会杀死酒曲中的酵母菌，不利于后续发酵，C错误；黄酒发酵的菌种为酵母菌，为利于黄酒发酵，发酵温度应控制在18～30 ℃之间，D错误。]
2．D　[利用大麦作原料时，葡萄糖是酵母菌的直接碳源，A错误。啤酒发酵过程分为主发酵和后发酵；大部分糖的分解和代谢物的生成都在主发酵阶段完成，B错误。糖化是让淀粉分解形成糖浆，C错误。]
3．B　[平板A为固体培养基，配制时还需要加入琼脂作为凝固剂，B错误。]
4．C　[筛选土壤中目的微生物即降解几丁质的微生物时，应用几丁质为唯一碳源的培养基进行筛选，A正确；纯化培养时，可选择稀释涂布平板法或平板划线法接种，两种方法均可得到单菌落，B正确；在以几丁质为唯一碳源的培养基上生长的菌落不一定都能分泌几丁质酶，可能部分是以几丁质的分解产物为碳源的微生物，C错误；水解圈是微生物产生几丁质酶水解几丁质产生的，“水解圈直径/菌落直径”的值越大，说明该菌降解能力越强，故可依据单菌落周围“水解圈直径/菌落直径”的值来筛选目的菌株，D正确。]
5．A　[双层平板法因上层培养基中琼脂含量较少，故形成的噬菌斑较大，更有利于计数，A正确；将琼脂含量是1%的培养基融化并冷却至45～48 ℃，然后加入宿主细菌和待测噬菌体稀释悬液的混合液，充分混匀后立即倒入底层平板上形成双层平板，是培养基和混合液一起倒平板，不是混合液涂布在培养基表面，B错误；牛肉膏蛋白胨培养基不是选择培养基，选择培养基是允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，C错误；双层平板法所形成的全部噬菌斑都基本处于同一平面上，因此不仅每一个噬菌斑的大小接近、边缘清晰，而且不易发生上下噬菌斑的重叠现象，D错误。]
6．D　[据题意可知，在固体培养基X上接种后还需进行计数，故只能用稀释涂布平板法接种而不能用平板划线法，A错误；在一定的培养条件下，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征，根据菌落的形状、大小、颜色等特征，可以初步区分出不同种微生物，但不能准确判断，B错误；配制的培养基需调整pH后经湿热灭菌，冷却后倒平板，C错误；固体培养基X没有做任何处理，所以对菜品中的细菌没有选择性，D正确。](共91张PPT)
发酵工程
保分点专攻 1　
建网络 抓主干
是否含凝固剂
类型
步骤
培
养
基
平板划线法
从传统发酵技术到发酵工程
微生物的
基本培养
技术
固体培养基
液体培养基
基本配方
水、碳源、氮源、无机盐
无菌
技术
类型
消毒和灭菌
微生物的
纯培养
接种
方法
制备培养基(配制培养基→灭菌 →倒平板)→接种→分离→培养
①___________
稀释涂布平板法
微生物的
选择培养
和计数
土壤中分
解尿素的
细菌的分
离和计数
培养基
的特点
以尿素为唯一氮源
计数
方法
稀释涂布平板法
显微镜直接计数法
活菌计数法
不能区分死菌与活菌
选
择
培
养
基
不能计数
建网络 抓主干
条件
菌种
从传统发酵技术到发酵工程
传统发
酵技术
的应用
泡菜的制作
乳酸菌
果酒制作
基本
环节
无氧
条件
菌种
②________
无氧
果醋制作
条件
菌种
醋酸菌
③_____
发酵工
程及其
应用
获得产品
↑
分离、提纯产物
↑
发酵罐内发酵
↑
扩大
培养
接种
灭菌
配制培养基
选育
菌种
发酵工程的应用
食品工业、医药工业、农牧业
酵母菌
有氧
一 核心提炼
1.传统发酵技术及发酵工程
(1)理清“3”种传统食品的制作技术
(2)制作果酒、果醋的装置图解读
①各部位的作用
Ⅰ.充气口：在醋酸发酵时连接充气泵进行充气。
Ⅱ.排气口：排出酒精发酵时产生的CO2。
Ⅲ.与排气口相连的长而弯曲的胶管：防止空气中微生物的污染。
Ⅳ.出料口：用于取样。
②该装置的使用方法
使用该装置制酒时，应该关闭充气口；制醋时，应将充气口连接充气泵，输入氧气。
(3)泡菜腌制过程中，乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐的变化
(4)发酵工程的基本环节
[点拨]　传统发酵食品制作过程中利用的是天然存在的菌种，不仅菌种存在差异，杂菌也是多样；而现代工业发酵工程通常通过微生物培养技术获得单一菌种进行发酵。
2.微生物培养、分离与计数
(1)无菌技术常用方法
(2)微生物的纯化技术
①制备马铃薯琼脂培养基
②两种纯化微生物方法的比较
a.为了确定培养基的灭菌是否合格，微生物实验一般会设置空白对照：随机取若干灭菌后的空白平板培养基在适宜条件下培养一段时间，观察培养基上是否有菌落生成。
b.观察菌落需要用固体培养基，因此培养基要添加凝固剂，如琼脂。
c.平板倒置既可以防止皿盖上的水珠落入培养基，又可以避免培养基中的水分过快的挥发。
(3)微生物分离与计数的两个实例
关注两种对照组与一种重复组
①将一未接种的选择培养基与接种的选择培养基一起培养——用于确认培养基灭菌是否彻底(制备是否合格)。
②将一接种的普通培养基与接种的选择培养基一起培养——用于确认选择培养基是否起“筛选”作用。
③进行微生物计数时，每一稀释度下至少涂布三个平板，即设置重复组，是为了求平均值，提高计数准确度。
1.判断下列有关传统发酵食品的制作技术的叙述
(1)果酒的家庭制作与啤酒的工业化生产相比，发酵前都需要对原料进行灭菌，发酵结束后都必须进行消毒以延长保存期(　　)
提示：家庭制作果酒时需要用到水果表面的酵母菌，所以不能对原料灭菌；家庭制作果酒发酵结束后不需要消毒处理。
×
(2)制作果酒的葡萄汁不宜超过发酵瓶体积的2/3，制作泡菜的盐水要淹没全部菜料(　　)
√
(3)葡萄果皮上有酵母菌和醋酸菌，制作好葡萄酒后，可直接通入无菌空气制作葡萄醋(　　)
提示：醋酸菌为好氧细菌，且果醋发酵温度高于果酒发酵，因此制作好葡萄酒后，除通入无菌空气外，还需要适当提高发酵装置的温度。
×
(4)果醋发酵时，发酵液产生的气泡量明显少于果酒发酵时(　　)
√
(5)向泡菜坛盖边沿的水槽中注满水形成内部无菌环境(　　)
提示：向泡菜坛盖边沿的水槽中注满水形成内部无氧环境，不能形成无菌环境。
×
(6)青霉素具有杀菌作用，因此青霉素的工业化生产过程中发酵罐不需严格灭菌(　　)
提示：由于某些杂菌能分泌青霉素酶，从而分解青霉素，为防止杂菌生长，发酵罐需要严格灭菌。
×
2.判断下列有关微生物的基本培养技术的叙述
(1)将培养基分装于培养皿中后灭菌，可降低培养基污染的概率(　　)
提示：培养基应先灭菌再分装于培养皿中。
×
(2)平板接种常用在微生物培养中，不含氮源的平板不能用于微生物培养，平板涂布时涂布器使用前必须进行消毒(　　)
提示：不含有氮源的平板可用来培养利用空气中氮气的微生物；平板涂布时涂布器使用前必须进行灭菌处理，以防止外来杂菌的污染。
×
(3)对航天器及洁净的组装车间进行环境微生物检测时需采用平板划线法等分离培养微生物，观察菌落特征(　　)
提示：航天器及洁净的组装车间环境微生物很少，分离培养微生物，观察菌落特征，不采用平板划线法，应采用稀释涂布平板法等分离培养微生物。
×
(4)涂布用的菌液的菌浓度应控制在30～300个/mL(　　)
提示：为了保证结果准确，一般选择菌落数为30～300的平板进行计数，而非涂布用的菌浓度控制在30～300个/mL。
×
(5)在分离产脲酶菌的实验中可分解酚红指示剂使其褪色的菌株是产脲酶菌株(　　)
提示：在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶催化尿素分解产生氨，氨会使培养基的pH升高，酚红指示剂将变红，因此在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，能对分离的菌种做进一步鉴定。
×
二 真题演练
1.(2024·湖北，1)制醋、制饴、制酒是我国传统发酵技术。醋酸菌属于好氧型原核生物，常用于食用醋的发酵。下列叙述错误的是
A.食用醋的酸味主要来源于乙酸
B.醋酸菌不适宜在无氧条件下生存
C.醋酸菌含有催化乙醇氧化成乙酸的酶
D.葡萄糖在醋酸菌中的氧化分解发生在线粒体内
√
食用醋的酸味主要来自醋酸，醋酸学名为乙酸，A正确；
醋酸菌是好氧型细菌，不适宜在无氧的条件下生存，B正确；
在制醋时，缺失原料的情况下，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为乙酸，因此醋酸菌体内含有催化乙醇氧化成乙酸的酶，C正确；
醋酸菌属于细菌，没有核膜包被的细胞核和众多细胞器，因此没有线粒体，D错误。
2.(2023·山东，12)以下是以泡菜坛为容器制作泡菜时的4个处理：①沸盐水冷却后再倒入坛中；②盐水需要浸没全部菜料；③盖好坛盖后，向坛盖边沿的水槽中注满水；④检测泡菜中亚硝酸盐的含量。下列说法正确的是
A.①主要是为了防止菜料表面的醋酸杆菌被杀死
B.②的主要目的是用盐水杀死菜料表面的杂菌
C.③是为了使气体只能从泡菜坛排出而不能进入
D.④可检测到完整发酵过程中亚硝酸盐含量逐渐降低
√
沸盐水冷却后再倒入坛中，盐水煮沸是为了杀灭杂菌，冷却之后使用是为了保证乳酸菌等微生物的生命活动不受影响，A错误；
盐水需要浸没全部菜料，制造无氧环境，有利于乳酸菌的无氧呼吸，B错误；
盖好坛盖后，向坛盖边沿的水槽中注满水，是为了隔绝空气、防止杂菌污染等，C正确；
腌制泡菜过程中亚硝酸盐的含量先增多后减少，D错误。
3.(2024·山东，14)在发酵过程中，多个黑曲霉菌体常聚集成团形成菌球体，菌球体大小仅由菌体数量决定。黑曲霉利用糖类发酵产生柠檬酸时需要充足的氧。菌体内铵离子浓度升高时，可解除柠檬酸对其合成途径的反馈抑制。下列说法错误的是
A.相同菌体密度下，菌球体越大柠檬酸产生速率越慢
B.发酵中期添加一定量的硫酸铵可提高柠檬酸产量
C.发酵过程中pH下降可抑制大部分细菌的生长
D.发酵结束后，将过滤所得的固体物质进行干燥即可获得柠檬酸产品
√
黑曲霉利用糖类发酵产生柠檬酸时需要充足的氧，相同菌体密度下，菌球体越大越不利于菌体与氧气接触，则柠檬酸产生速率越慢，A正确；
菌体内铵离子浓度升高时，可解除柠檬酸对其合成途径的反馈抑制，发酵中期添加一定量的硫酸铵，提高了铵离子浓度，菌体内可提高柠檬酸产量，B正确；
发酵过程中pH下降导致细菌生命活动所必需的酶失活，可抑制大部分细菌的生长，C正确，
发酵结束后，将过滤所得的固体物质进行分离纯化、浓缩、干燥等一系列操作后才能获得柠檬酸产品，D错误。
4.(2024·江西，11)井冈霉素是我国科学家发现的一种氨基寡糖类抗生素，它由吸水链霉菌井冈变种(JGs，一种放线菌，菌体呈丝状生长)发酵而来，在水稻病害防治等领域中得到广泛应用。下列关于JGs发酵生产井冈霉素的叙述，正确的是
A.JGs可发酵生产井冈霉素，因为它含有能够编码井冈霉素的基因
B.JGs接入发酵罐前需要扩大培养，该过程不影响井冈霉素的产量
C.提高JGs发酵培养基中营养物质的浓度，会提高井冈霉素的产量
D.稀释涂布平板法不宜用于监控JGs发酵过程中活细胞数量的变化
√
基因表达的产物是蛋白质，而井冈霉素是JGs发酵生产的一种氨基寡糖类抗生素，因此推测JGs含有能够编码合成井冈霉素相关酶的基因，A错误；
JGs接入发酵罐前需要扩大培养，该过程会增加JGs的数量，进而影响井冈霉素的产量，使井冈霉素的产量得到提高，B错误；
在一定范围内提高JGs发酵培养基中营养物质的浓度，会提高井冈霉素的产量，但若浓度过大，反而会降低井冈霉素的产量，C错误；
根据题意可知，JGs菌体呈丝状生长，所以形成的菌落难以区分，因此稀释涂布平板法不宜用于监控JGs发酵过程中活细胞数量的变化，D正确。
5.(2024·黑吉辽，19改编)某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病，其筛选流程及抗性检测如图。下列操作正确的是
A.在大量感染香蕉枯萎病的香蕉
种植园内，从感病植株上采集
样品
B.将采集的样品充分消毒后，用蒸馏水冲洗，收集冲洗液进行无菌检测
C.将无菌检测合格的样品研磨，经稀释涂布平板法分离得到内生菌的单
菌落
D.判断内生菌的抗性效果需比较接种内生菌的平板上的病原菌菌斑大小
√
某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病，故在大量感染香蕉枯萎病的
香蕉种植园内，从未感病植株上采集样品，A错误；
获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染；将采集的样品充分消毒后，用无菌水冲洗，收集冲洗液进行无菌检测，B错误；
题图可知，样品研磨后进行了稀释涂布，可见将无菌检测合格的样品研磨，经稀释涂布平板法分离得到内生菌的单菌落，C正确；
由题图抗性检测可知，判断内生菌的抗性效果需设置对照组和实验组，对照组不接种内生菌得到病原菌菌斑，实验组接种内生菌得到病原菌菌斑，然后比较对照组和实验组的菌斑大小，实验组病原菌菌斑越小表明内生菌抗性效果越好，D错误。
生物实验中常用到的水有清水、无菌水和生理盐水三类。清水常用于植物实验，生理盐水常用于动物实验，无菌水常用于微生物实验。
6.(2024·湖南，6)微生物平板划线和培养的具体操作如图所示，下列操作正确的是
A.①②⑤⑥ B.③④⑥⑦
C.①②⑦⑧ D.①③④⑤
√
分析题图可知，拔出棉塞后完全握住棉塞会造成杂菌污染，应握住棉塞上部，②错误；
划线时不能将培养皿完全打开，应在酒精灯火焰附近将培养皿打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划三至五条平行线，盖上皿盖，⑥错误；
划线时第5次的划线不能与第1次的划线相连，⑦错误；
平板应倒置培养，⑧错误。
综上，正确的操作有①③④⑤。
三 模拟预测
1.(2024·湖北省新高考协作体高三一模)黄酒是世界上最古老的酒类之一，黄酒的制作流程主要为制曲→浸米→蒸煮(浸好的小米加入开水中煮熟)→拌曲→入缸发酵→压榨→装瓶。下列叙述正确的是
A.浸米有利于淀粉水解产生酒精从而提高酒的产量
B.入缸发酵时不能将搅拌好的煮熟小米装满发酵缸
C.浸好的小米煮熟后为避免杂菌污染需要立刻拌曲
D.为利于黄酒发酵，发酵温度应控制在30～35 ℃之间
√
浸米有利于淀粉水解产生葡萄糖，酵母菌经无氧呼吸将葡萄糖氧化分解才能生成酒精，A错误；
入缸发酵时不能将搅拌好的煮熟小米装满发酵缸，以防止酵母菌进行酒精发酵过程中产生二氧化碳造成发酵液溢出，B正确；
浸好的小米煮熟后温度较高，立刻拌曲会杀死酒曲中的酵母菌，不利于后续发酵，C错误；
黄酒发酵的菌种为酵母菌，为利于黄酒发酵，发酵温度应控制在18～30 ℃之间，D错误。
2.(2024·青岛高三一模)黄桃精酿啤酒的制作工艺与普通啤酒有所不同，生产工艺流程为：麦芽→粉碎→糖化→过滤→煮沸→主发酵→后发酵(添加黄桃汁)→低温冷藏→成品→罐装。下列说法正确的是
A.利用大麦作原料时，淀粉是酵母菌的直接碳源
B.啤酒发酵过程中大部分糖的分解和代谢物的生成都在后发酵阶段完成
C.糖化是让麦芽糖分解形成糖浆，煮沸能够使酶失活及对糖浆灭菌
D.“精酿”啤酒发酵完成后，通常不需要进行过滤和消毒处理
√
利用大麦作原料时，葡萄糖是酵母菌的直接碳源，A错误。
啤酒发酵过程分为主发酵和后发酵；大部分糖的分解和代谢物的生成都在主发酵阶段完成，B错误。
糖化是让淀粉分解形成糖浆，C错误。
3.使用时间过长的玩具表面可能会有细菌，可能会导致儿童患接触性皮炎。为了检测某玩具表面是否存在大肠杆菌，某团队进行了相关实验(如图所示)，该团队使用伊红—亚甲蓝染液(用于鉴别大肠杆菌，能使其菌落呈深紫色，并带有金属光泽)对培养基C进行染色，初步统计大肠杆菌的数量，图中1～6表示不同菌落。下列说法错误的是
A.对菌液进行系列梯度稀释，平板菌
落数为30～300时适合进行计数
B.配制平板A时只需要加入碳源、氮源、水、无机盐这几类物质即可
C.图中平板B的接种方法为稀释涂布平板法，初步判断3是大肠杆菌的菌落
D.为保护儿童健康，平时可用75%的酒精对玩具进行擦拭消毒
√
平板A为固体培养基，配制时还需要加入琼脂作为凝固剂，B错误。
4.(2024·菏泽高三二模)稻瘟菌引起的水稻稻瘟病是危害最为严重的真菌病害之一。土壤中某些微生物能合成并分泌几丁质酶，能抑制稻瘟菌的生长，可用于稻瘟病的防治。科研人员试图从土壤中筛选出能高效降解几丁质的菌株，通过微生物培养获得几丁质酶。下列说法错误的是
A.筛选土壤中目的微生物时需用以几丁质为唯一碳源的培养基
B.纯化培养时，可选择稀释涂布平板法或平板划线法接种
C.在以几丁质为唯一碳源的培养基上生长的菌落均能分泌几丁质酶
D.可依据单菌落周围“水解圈直径/菌落直径”的值来筛选目的菌株
√
筛选土壤中目的微生物即降解几丁质的微生物时，应用几丁质为唯一碳源的培养基进行筛选，A正确；
纯化培养时，可选择稀释涂布平板法或平板划线法接种，两种方法均可得到单菌落，B正确；
在以几丁质为唯一碳源的培养基上生长的菌落不一定都能分泌几丁质酶，可能部分是以几丁质的分解产物为碳源的微生物，C错误；
水解圈是微生物产生几丁质酶水解几丁质产生的，“水解圈直径/菌落直径”的值越大，说明该菌降解能力越强，故可依据单菌落周围“水解圈直径/菌落直径”的值来筛选目的菌株，D正确。
5.(2024·岳阳高三二模)双层平板法是利用底层和上层均为牛肉膏蛋白胨培养基对噬菌体进行检测的方法。先在无菌培养皿中倒入琼脂含量是2%的培养基凝固成底层平板，再将琼脂含量是1%的培养基融化并冷却至45～48 ℃，加入宿主细菌和待测噬菌体稀释悬液的混合液，充分混匀后立即倒入底层平板上形成双层平板。一段时间后，在上层平板同一平面可见噬菌体侵染周围细菌导致宿主细胞裂解死亡形成的空斑(噬菌斑)。通常一个噬菌斑来自原液中的一个噬菌体。可根据噬菌斑的数目计算原液中噬菌体的数量，如图所示。下列叙述正确的是
A.上层培养基中琼脂浓度较低，因此形成的噬菌斑
较大，更有利于计数
B.加入混合液后，使用灭菌后的涂布器将混合液均
匀地涂布在培养基表面
C.牛肉膏蛋白胨培养基可作为选择培养基选择出噬菌体的宿主细胞
D.双层平板法获得的噬菌斑容易发生上下重叠现象
√
双层平板法因上层培养基中琼脂含量较少，
故形成的噬菌斑较大，更有利于计数，A
正确；
将琼脂含量是1%的培养基融化并冷却至45
～48 ℃，然后加入宿主细菌和待测噬菌体稀释悬液的混合液，充分混匀后立即倒入底层平板上形成双层平板，是培养基和混合液一起倒平板，不是混合液涂布在培养基表面，B错误；
牛肉膏蛋白胨培养基不是选择培养基，选择培养基是允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，C错误；
双层平板法所形成的全部噬菌斑都基本处于同一平面上，因此不仅每一个噬菌斑的大小接近、边缘清晰，而且不易发生上下噬菌斑的重叠现象，D错误。
6.(2024·梅州高三一模)某兴趣小组为研究“使用公筷对餐后菜品细菌数量的影响”，将每道菜分为3盘，一盘取样冷藏，一盘使用公筷，一盘不用公筷，实验过程如图。下列相关操作或叙述正确的是
A.将细菌接种在固体培养基X
上可采用平板划线法
B.根据菌落的特征可以准确判
断细菌的种类
C.配制的培养基需经湿热灭菌后调整pH，冷却后倒平板
D.固体培养基X对菜品中的细菌没有选择性
√
据题意可知，在固体培养基X
上接种后还需进行计数，故只
能用稀释涂布平板法接种而不
能用平板划线法，A错误；
在一定的培养条件下，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征，根据菌落的形状、大小、颜色等特征，可以初步区分出不同种微生物，但不能准确判断，B错误；
配制的培养基需调整pH后经湿热灭菌，冷却后倒平板，C错误；
固体培养基X没有做任何处理，所以对菜品中的细菌没有选择性，D正确。
四 专题强化练
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答案
对一对
题号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
答案 A C D B D A A C A D
题号 11
答案 (1)通过选择培养增加降解莠去津的细菌数量　(2)涂布器　偏低　当两个或两个以上的细胞聚集在一起长成的是一个菌落　(3)有透明带　氮气　(4)将配制的培养基灭菌后不接种，与实验组放在相同且适宜的条件下培养
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对一对
题号 12
答案 (1)稀释涂布平板法　使细菌分散成单个细胞，在平板上获得单菌落　(2)菌种①和③可降解分散蓝2BLN，分散蓝2BLN被降解后蓝色消失形成透明圈　菌种③　(3)随着接种量的增大，GN－1菌株对分散蓝2BLN的脱色率逐渐提高　不确定是　没有设置接种量大于20%的组别，不能确定接种量大于20%后的脱色效果
题号 13
答案 (1)显微镜直接计数法将活菌和死菌一起计数，活菌计数法中存在多个活菌形成一个菌落的情况且只计数活菌　(2)5 000　(3)杀死涂布器上可能存在的微生物，防止微生物污染　防止温度过高杀死菌种　(4)A　A消毒液活细胞减少量最多，且杀菌时间较短，效率最高　(5)深紫
答案
1.(2024·烟台高三一模)用“麦汁酸化”法酿造的酸啤酒既有麦芽清香，又酸甜适口。它是通过微生物发酵将麦汁中的麦芽糖和其他糖类转化为醋酸和乳酸，再结合酒精发酵制作而成。下列说法错误的是
A.前期利用醋酸菌和乳酸菌在同一容器中同时进行醋酸和乳酸发酵
B.达到一定酸度的麦汁需经熬煮、冷却后才可接种抗酸性高的酵母菌
C.后期发酵产生酒精时，应将发酵温度控制在18～30 ℃范围内
D.酒精发酵时发酵罐内液面不再有气泡产生，说明发酵基本完毕
√
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答案
醋酸菌是好氧细菌，在无氧条件下不能存活，而乳酸菌是厌氧细菌，在有氧条件下不能存活，所以醋酸菌与乳酸菌在同一容器中发酵时，不能同时产生醋酸和乳酸，A错误。
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答案
2.(2024·锦州高三模拟)明代冯时化《酒史》记载：“每至桑落时，取其寒暄所得，以井水酿酒甚佳。”意思是每到桑叶飘落的季节，井水的温度最适宜酿酒，所酿造的酒品质最好。有关桑叶酒的酿制，下列说法错误的是
A.用密闭容器进行桑叶酒发酵时，需定期放气
B.采用井水酿制，主要是因为井水温度有利于微生物发酵
C.酿制中期起泡现象是微生物有氧呼吸产生的CO2释放形成的
D.桑叶酒发酵时，可用酸性重铬酸钾测定酒精含量的变化
√
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答案
酿酒时酵母菌无氧呼吸产生CO2，需定期放气，A正确；
酿制中期起泡现象是微生物无氧呼吸产生的CO2释放形成的，C错误；
桑叶酒发酵时产生酒精，橙色的重铬酸钾溶液在酸性条件下与酒精发生化学反应变成灰绿色，可根据颜色深浅测定酒精含量的变化，D正确。
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答案
3.(2024·贵阳六校高三联考)研究人员将结核杆菌分别接种在含有不同浓度抗生素A与B的培养基中(“＋”代表含抗生素，“＋”的多少代表抗生素浓度，“－”代表不含抗生素)，对两种
抗生素的药性进行分析。在37 ℃
环境下培养24小时后，细菌生长
情况如图。下列叙述正确的是
A.科学家利用厌氧发酵技术使抗生素中青霉素的生产实现了产业化
B.与单独使用抗生素A相比，联合使用抗生素B的抑菌作用更强
C.为排除杂菌的影响，倒平板前可对培养基采用煮沸灭菌或者高压蒸汽灭菌
D.该实验使用稀释涂布平板法接种结核杆菌，待菌液被吸收后方可倒置培养
√
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答案
青霉菌(产生青霉素)是异养需氧型真菌，因此青霉素的发酵过程需要氧气参与，以便微生物能够进行正常的代谢活动，A错误；
根据图中平板上菌落的分布可知，与单独使用抗生素A相比，联合使用抗生素B不能增强对结核杆菌的抑制作用，B错误；
为排除杂菌的影响，应该用高压蒸汽灭菌法对培养基进行灭菌，然后冷却到50 ℃左右倒平板，C错误；
由图可看出培养基表面菌落分布均匀，是利用了稀释涂布平板法接种结核杆菌，待菌液被培养基吸收后方可倒置培养，D正确。
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4.(2024·张掖高三模拟)某些酵母菌可以利用工业废甲醇作为碳源进行培养，这样既可减少污染又可降低生产成本。研究人员拟从土壤样品中分离该类酵母，并进行大量培养，如图为操作流程。下列说法正确的是
A.步骤②所用的培养基应以甲醇为
碳源
B.步骤③中应将温度约50 ℃的培养
基倒入培养皿混匀
C.进行步骤④前需从分离平板中挑取多个菌落，分别测定酵母细胞中甲
醇的含量
D.步骤⑤可用真空发酵的方法来提取发酵产物
√
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步骤②是对土样中的菌种进行
稀释，使用的是无菌水，不是
培养基，A错误；
步骤③中应将温度约50 ℃的培养基倒入培养皿，这是为了保证培养基在倒入培养皿并与稀释液混合时能够迅速且均匀地凝固，从而形成适合微生物生长的环境，温度过高或过低都可能影响微生物的生长和菌落的均匀分布，从而影响到分离和纯化的效果，B正确；
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步骤④为利用平板划线法分离
纯化的过程，需从分离平板中
挑取一个菌落进行划线，且不
需要测定酵母细胞中甲醇的含量，C错误；
酵母菌是兼性厌氧型微生物，扩大培养过程中需要酵母菌进行有氧呼吸大量繁殖，不能用真空发酵的方法，D错误。
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5.(2024·衡水高三模拟)聚苯乙烯是制造碗装泡面盒、发泡快餐盒的材料。某兴趣小组试图从土壤中分离能分解聚苯乙烯的细菌，相关流程如图所示。下列叙述正确的是
A.若稀释倍数都为10，则x
应为8
B.接种时应在酒精灯火焰旁进行，可将培养皿皿盖完全打开
C.将涂布器放在火焰上燃烧后立即进行涂布
D.应至少涂布三个平板，求菌落数的平均值
√
若稀释倍数都为10，则x应为18，A错误；
接种时应在酒精灯火焰旁进行，但不能将培养皿皿盖完全打开，B错误；
将涂布器放在火焰上燃烧，等冷却后再进行涂布，C错误。
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答案
6.(2024·山东，15)酵母菌在合成色氨酸时需要3种酶X、Y和Z，trpX、trpY和trpZ分别为相应酶的编码基因突变的色氨酸依赖型突变体。已知3种酶均不能进出细胞，而色氨酸合成途径的中间产物积累到一定程度时可分泌到胞外。将这3种突变体均匀划线接种到含有少量色氨酸的培养基上，生长情况如图。据图分析，3种酶在该合成途径中的作用顺序为
A.X→Y→Z
B.Z→Y→X
C.Y→X→Z
D.Z→X→Y
√
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答案
trpZ两端均不能繁殖，就说明Z是最终作用物质；而trpX两端均能繁殖，它旁边的trpY和trpZ却不能繁殖，就说明X先作用。综上，顺序为X→Y→Z。
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7.我国科技工作者发明“二步发酵法”生产维生素C的工艺是世界首创。第一步发酵用醋酸杆菌合成分泌维生素C前体，第二步发酵用氧化葡萄糖酸杆菌(“小菌”)和假单胞杆菌(“大菌”)混合菌种作为伴生菌，能促进产酸菌生长和产酸。如图为二步发酵法的生产流程。下列说法正确的是
A.可以利用平板划线法纯化混
菌发酵法所需的目的菌
B.单独筛选高效的产酸菌和伴
生菌即可用于混菌发酵
C.伴生菌与产酸菌二者互利共生，不存在种间竞争
D.生产过程采用混菌发酵法不需要严格的无菌操作
√
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答案
产酸菌和伴生菌应共同进行筛选，才能获得最佳的生产维生素C的菌种，单独筛选出的高效的产酸菌和伴生菌不一定适配，B错误；
伴生菌与产酸菌会共同竞争空间等资源，二者存在种间竞争，C错误；
采用混菌发酵法时，需要进行严格的无菌操作，D错误。
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答案
8.(2024·福州高三三模)青霉菌是一种好氧微生物，在青霉菌发酵时，在合成的开始阶段青霉素和头孢霉素有共同的前体，不久出现分支。生产抗生素的发酵罐如图所示，以下
叙述正确的是
A.由于青霉素的抗菌作用，通入
发酵罐的空气无需灭菌
B.搅拌能够使氧气与培养液快速
混合，但不利于散热
C.将外源扩环酶基因导入青霉菌，可增加头孢霉素产量
D.青霉菌的发酵最终获得的青霉素是一种单细胞蛋白
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答案
青霉素本身具有杀菌作用，但不能杀灭所有的微生物，因此，发酵罐需要严格灭菌，通入发酵罐的空气需要灭菌，A错误；
搅拌能够使氧气与培养液快速混合，同时有利于散热，B错误；
青霉菌发酵时，在合成的开始阶段青霉素和头孢霉素有共同的前体，将外源扩环酶基因导入青霉菌，可增加头孢霉素产量，C正确；
微生物菌体本身属于单细胞蛋白，青霉素属于代谢产物不是单细胞蛋白，D错误。
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答案
9.(2024·济宁高三二模)大肠杆菌、沙门氏菌能引起家禽和家畜的肠道疾病。暹罗芽孢杆菌代谢物具有广谱抗菌性，为检测其对沙门氏菌和大肠杆菌的抑菌能力进行图示实验。下列说法正确的是
A.制备图示培养基需要在灭菌前调节
pH
B.该抑菌实验还需要设计等量生理盐
水作为对照
C.图示X为离心后得到的下层沉淀，
含有暹罗芽孢杆菌代谢物
D.从抑菌圈边缘挑取菌落涂布平板
重复实验，抑菌圈直径变大
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答案
该抑菌实验为检测暹罗芽孢杆菌代谢物对沙门氏菌和大肠杆菌的抑菌能力，互为对照，因此进行图示实验不需设计等量生理盐水作为对照，B错误；
图示X为离心后得到的上清液，含有代谢物，C错误；
在抑菌圈边缘生长的细菌可能是耐药菌，从抑菌圈边缘挑取菌落涂布平板
重复实验，抑菌圈平均直径变小，D错误。
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答案
10.(2024·南通高三三模)生产啤酒的主要工艺流程如图所示，下列叙述错误的是
A.过程①中大麦种子发芽释放淀
粉酶参与过程②中的糖化过程
B.过程②中焙烤杀死大麦种子胚，
碾磨缩短糖化的时间
C.过程②蒸煮时加入啤酒花可增加啤酒的苦度等风味
D.过程③主发酵阶段进行酵母菌繁殖，后发酵阶段产生代谢产物
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答案
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过程①为发芽过程，该过程中大麦会产生淀粉酶，便于大麦中淀粉分解成葡萄糖，为主发酵过程做准备，该酶在糖化阶段起作用，A正确；
啤酒发酵过程包括两个阶段：主发酵和后发酵，其中啤酒的发酵过程中酵母菌的繁殖、大部分糖的分解和代谢产物的生成都在主发酵阶段完成，D错误。
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答案
11.莠去津，又名阿特拉津，是一种含氮的有机化合物，它是世界上使用最广泛的除草剂之一，由于其在环境中残留期长(4～57周)，是近年备受关注的疑似持久性有机污染物(POPs)，为修复被其污染的土壤，按下面程序选育能降解莠去津的细菌(目的菌)。已知莠去津在水中溶解度低，含过量莠去津的固体培养基不透明。据图回答下列问题：
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答案
(1)由图推断，从A瓶到C瓶液体培养的目的是_______________
_______________________。
通过选择培养增
加降解莠去津的细菌数量
A瓶到C瓶中的培养液是以莠去津为唯一氮源的培养基，属于选择培养基，A瓶到C瓶液体培养的目的是初步选择能降解莠去津的细菌(目的菌)同时增加该菌的数量。
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答案
(2)从图中看将C瓶菌种接种到固体培养基的过程使用的接种工具是_______，该方法计算得到的菌数往往比实际值______(填“偏低”或“偏高”)，原因是______________________________________________
_____。
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答案
涂布器
偏低
当两个或两个以上的细胞聚集在一起长成的是一个
菌落
从图中看将C瓶菌种接种到固体培养基的方法为稀释涂布平板法，因此该过程使用的接种工具是涂布器，该方法计算得到的菌数往往比实际值偏低，主要是因为当两个或两个以上的细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，进而导致统计的结果偏低。
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答案
(3)一段时间后，培养基出现无透明带菌落和有透明带菌落两种菌落，我们筛选的目的菌是___________菌落中的细菌，另外一种菌落利用的氮源很可能是______。
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答案
有透明带
氮气
一段时间后，培养基出现无透明带菌落和有透明带菌落两种菌落，需要筛选的目的菌是有透明带菌落中的细菌，即因为培养基中的莠去津被细菌利用而被分解因而出现透明带，另外一种菌落利用的氮源很可能是空气中的氮气。
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答案
(4)为弄清固体培养基中的非目的菌落来自C瓶菌种还是培养基，要如何设置对照组？___________________________________________________
_____________。
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答案
将配制的培养基灭菌后不接种，与实验组放在相同且适宜的条件下培养
为弄清固体培养基中的非目的菌落来自C瓶菌种还是培养基，需要设置对照组，对照组应该为空白对照，将配制的培养基灭菌后不接种，与实验组放在相同且适宜的条件下培养。
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答案
12.研究发现，从活性污泥中能筛选出对蓝色的2BLN染料废水具有高效脱色能力的菌株，它们通过降解具有生物毒性的分散蓝2BLN而降低废水危害。图1表示目标菌株GN－1的筛选流程，图2表示GN－1菌株接种量对脱色效果影响的实验结果。回答下列问题：
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答案
(1)图中将菌液接种到含分散蓝2BLN的LB固体培养基上所用的接种方法是______________，该接种方法要求对菌液做充分的稀释，目的是_____
_____________________________________。
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答案
稀释涂布平板法
使细
菌分散成单个细胞，在平板上获得单菌落
根据培养基中菌落的分布可知，向含分散蓝2BLN的LB固体培养基上进行接种的方法是稀释涂布平板法。用稀释涂布平板法接种时，要对菌液进行充分的稀释，可以使细菌分散成单个细胞，在平板上获得单菌落。
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答案
(2)图1中菌种①和③的周围出现
透明圈，透明圈形成的原理是
___________________________
___________________________
___________________。菌种①
～④中，最符合要求的是__________。
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答案
菌种①和③可降解分散蓝2BLN，分散蓝2BLN被降解后蓝色消失形成透明圈
菌种③
图1中的菌种①和③可以降解分散蓝2BLN，从而使菌落周围的蓝色消失，形成透明圈。菌种③周围透明圈直径与菌落直径的比值较大，所以菌种③降解分散蓝2BLN的能力较强。
(3)据图2可知，GN－1菌株接种量对脱色效
果的影响是___________________________
_______________________________，其中
20%__________(填“是”“不是”或“不
确定是”)最佳接种量，主要原因是______
____________________________________________________________。
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答案
随着接种量的增大，GN－1菌株对分散蓝2BLN的脱色率逐渐提高
不确定是
设置接种量大于20%的组别，不能确定接种量大于20%后的脱色效果
没有
分析图2可知，随着GN－1菌株接种量的增大，GN－1菌株对分散蓝2BLN的脱色率逐渐提高。20%不一定是最佳接种量，因为没有设置接种量大于20%的组别，不能确定接种量大于20%后的脱色效果。
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答案
13.(2024·全国甲，37)合理使用消毒液有助于减少传染病的传播。某同学比较了3款消毒液A、B、C杀灭细菌的效果，结果如图所示。回答下列问题：
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答案
(1)该同学采用显微镜直接计数法和活菌计数法分别测定同一样品的细菌数量，发现测得的细菌数量前者大于后者，其原因是_________________
______________________________________________________________________________。
将活菌和死菌一起计数，活菌计数法中存在多个活菌形成一个菌落的情况且只计数活菌
显微镜直接计数法
(2)该同学从100 mL细菌原液中取1 mL加入无菌水中得到10 mL稀释菌液，再从稀释菌液中取200 μL涂布平板，菌落计数的结果为100，据此推算细菌原液中细菌浓度为______个/mL。
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答案
5 000
从100 mL细菌原液中取1 mL加入无菌水中得到10 mL稀释菌液，即稀释了10倍，再从稀释菌液中取200 μL涂布平板，即0.2 mL，已知菌落计数的结果为100。则1 mL细菌原液中细菌浓度＝(菌落数÷菌液体积)×稀释倍数＝(100个÷0.2 mL)×10＝5 000(个/mL)。
(3)菌落计数过程中，涂布器应先在酒精灯上灼烧，冷却后再涂布。灼烧的目的是_______
_______________________________________，冷却的目的是_____________________。
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答案
布器上可能存在的微生物，防止微生物污染
杀死涂
防止温度过高杀死菌种
(4)据图可知杀菌效果最好的消毒液是____，判断依据是______________
_____________________________________(答出两点即可)。
(5)鉴别培养基可用于反映消毒液杀灭大肠杆菌的效果。大肠杆菌在伊红－亚甲蓝培养基上生长的菌落呈______色。
A
减少量最多，且杀菌时间较短，效率最高
A消毒液活细胞
深紫　细胞工程
1．植物组织培养技术——原理：植物细胞的全能性
(1)植物组织培养中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压。
(2)脱分化阶段不需要光，再分化阶段需要光。
(3)生长素与细胞分裂素的比值高时，促进根的分化、抑制芽的形成；比值低时，促进芽的分化、抑制根的形成；比值适中时，促进愈伤组织的形成。
(4)体内细胞未表现全能性的原因：在特定的时间和空间条件下，细胞中的基因会选择性地表达。
2．植物体细胞杂交技术——原理：植物细胞的全能性、细胞膜的流动性
(1)原生质体融合成功的标志是再生出细胞壁。植物体细胞杂交完成的标志是培育出杂种植株。
(2)植物体细胞杂交的培养基中要添加蔗糖溶液且浓度略大于原生质体内的浓度，这样不仅能为原生质体提供营养，还能维持一定的渗透压，使原生质体保持正常的形态。
3．针对两类目标(试管苗、细胞产物)的培养流程
(1)植物细胞培养技术是工厂化生产相关代谢产物的一条有效途径，在生产中通常要培养到愈伤组织阶段。因为此时细胞分裂能力旺盛，代谢快，有利于产物生成。
(2)植物组织培养的原理是植物细胞的全能性，植物细胞培养的原理是细胞增殖。
4．动物细胞培养(以贴壁细胞为例)——原理：细胞增殖
(1)动物细胞培养过程
①保障无菌、无毒的措施：对培养液和所有培养用具进行灭菌处理以及在无菌条件下进行操作，定期更换培养液。
②动物细胞培养所需气体主要有O2和CO2。O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH。在进行细胞培养时，通常采用培养皿或松盖培养瓶，并将它们置于含有95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中进行培养。
③动物细胞培养过程中两次使用胰蛋白酶的作用不同。第一次：处理剪碎的组织，使其分散成单个细胞；第二次：使贴壁生长的细胞从瓶壁上脱落下来分散成单个细胞。
④区分原代培养和传代培养的关键：是否分瓶培养。
(2)干细胞
5．单克隆抗体的制备——原理：细胞膜的流动性、细胞增殖
6．动物体细胞核移植技术——原理：动物细胞核的全能性
(1)体细胞核移植获得的克隆动物与提供细胞核的亲本性状可能不同的三个原因：①克隆动物遗传物质来自两个亲本；②发育过程中可能发生基因突变或染色体变异；③外界环境可能引起不可遗传的变异。
(2)克隆动物的产生属于无性繁殖过程，而试管动物则是在体外受精形成受精卵，由受精卵发育成的个体，因此属于有性繁殖。
7．哺乳动物的早期胚胎发育过程
(1)受精过程中的两个标志：受精的标志是观察到两个极体或雌、雄原核；受精完成的标志是雌、雄原核融合完成。
(2)桑葚胚是由受精卵分裂形成的，没有分化；而囊胚虽然已进行细胞分化，但囊胚的内细胞团仍具有全能性。
8．胚胎移植的操作流程
(1)胚胎移植过程中的两次检查：第一次对收集的胚胎进行检查；第二次对受体母畜是否妊娠进行检查。
(2)胚胎移植产生的后代是有性生殖还是无性生殖，取决于胚胎发育的起点。若后代是由受精卵形成的，则为有性生殖；若后代是由核移植技术形成的重组细胞或胚胎分割形成的胚胎发育而成，则为无性生殖。
(3)用于移植的胚胎来源：体内正常受精的胚胎、核移植的胚胎和体外受精获得的胚胎、转基因获得的胚胎、胚胎分割获得的胚胎等。
9．胚胎移植的生理学基础
10．胚胎分割
易错辨析
1．判断下列有关细胞工程的叙述
(1)在蓝莓组织培养过程中，宜选用蓝莓成熟叶片为材料制备外植体(　　)
(2)次生代谢物是植物所必需的，但含量少，应选择产量高的细胞进行培养(　　)
(3)营养供应充足时，传代培养的胚胎干细胞不会发生接触抑制(　　)
(4)在制备单克隆抗体过程中可利用抗原—抗体结合的原理筛选出能分泌多种抗体的单个杂交瘤细胞(　　)
(5)将骨髓瘤细胞和B淋巴细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞(　　)
2．判断下列有关胚胎工程的叙述
(1)通常采用培养法或化学诱导法使精子获得能量后进行体外受精(　　)
(2)为获得更多的囊胚，采用激素注射促进雄鼠产生更多的精子(　　)
(3)将黑色小鼠囊胚的内细胞团部分细胞注射到白色小鼠囊胚腔中，接受注射的囊胚发育为黑白相间的小鼠(Mc)，获得Mc的生物技术属于核移植(　　)
1．(2024·甘肃，15)兰州百合栽培过程中易受病毒侵染，造成品质退化。某研究小组尝试通过组织培养技术获得脱毒苗，操作流程如图。下列叙述正确的是(　　)
A．①为脱分化过程，1号培养基中的愈伤组织是排列规则的薄壁组织团块
B．②为再分化过程，愈伤组织细胞分化时可能会发生基因突变或基因重组
C．3号培养基用于诱导生根，其细胞分裂素浓度与生长素浓度的比值大于1
D．百合分生区附近的病毒极少，甚至无病毒，可以作为该研究中的外植体
2．(2024·湖北，11)植物甲抗旱、抗病性强，植物乙分蘖能力强、结实性好。科研人员通过植物体细胞杂交技术培育出兼有甲、乙优良性状的植物丙，过程如图所示。下列叙述错误的是(　　)
A．过程①中酶处理的时间差异，原因可能是两种亲本的细胞壁结构有差异
B．过程②中常采用灭活的仙台病毒或PEG诱导原生质体融合
C．过程④和⑤的培养基中均需要添加生长素和细胞分裂素
D．可通过分析植物丙的染色体，来鉴定其是否为杂种植株
3．(2024·黑吉辽，14)从小鼠胚胎中分离获取胚胎成纤维细胞进行贴壁培养，在传代后的不同时间点检测细胞数目，结果如图。下列叙述正确的是(　　)
A．传代培养时，培养皿需密封防止污染
B．选取①的细胞进行传代培养比②更合理
C．直接用离心法收集细胞进行传代培养
D．细胞增长进入平台期可能与细胞密度过大有关
4．(2021·辽宁，13)如图是利用体细胞核移植技术克隆优质奶牛的简易流程图，下列有关叙述正确的是(　　)
A．后代丁的遗传性状由甲和丙的遗传物质共同决定
B．过程①需要提供95%空气和5%CO2的混合气体
C．过程②常使用显微操作去核法对受精卵进行处理
D．过程③将激活后的重组细胞培养至原肠胚后移植
5．(2024·江西，16改编)某病毒颗粒表面有一特征性的大分子结构蛋白S(含有多个不同的抗原决定基，每一个抗原决定基能够刺激机体产生一种抗体)。为了建立一种灵敏、高效检测S蛋白的方法，研究人员采用杂交瘤技术制备了抗－S单克隆抗体(如图)。下列说法错误的是(　　)
A．利用胶原蛋白酶处理，可分散贴壁生长的骨髓瘤细胞
B．制备的单克隆抗体A和单克隆抗体B是相同的单克隆抗体
C．用于生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可传代培养，也可冻存
D．单克隆抗体A和单克隆抗体B都能够特异性识别S蛋白
6．(2024·湖北，5)波尔山羊享有“世界山羊之王”的美誉，具有生长速度快、肉质细嫩等优点。生产中常采用胚胎工程技术快速繁殖波尔山羊。下列叙述错误的是(　　)
A．选择遗传性状优良的健康波尔母山羊进行超数排卵处理
B．胚胎移植前可采集滋养层细胞进行遗传学检测
C．普通品质的健康杜泊母绵羊不适合作为受体
D．生产中对提供精子的波尔公山羊无需筛选
1．(2024·济南高三模拟)甘草是中医使用最多的药材之一，其提取物中的黄酮具有抗衰老、抗炎等作用。如图表示利用悬浮培养生产甘草黄酮的过程。下列叙述正确的是(　　)
A．可用次氯酸钠和酒精对种子进行灭菌
B．图中添加果胶酶的主要目的是获得原生质体
C．对细胞悬液进行人工诱变，其变异率常高于对器官或个体进行诱变
D．图示过程能体现植物细胞的全能性
2．(2024·淮南高三三模)青霉素发酵是高耗氧过程，为保证发酵过程中青霉素的持续高产，研究人员将透明颤菌的血红蛋白引入青霉菌，设计方案如图所示。下列叙述正确的是(　　)
A．过程①②需要用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁获得原生质体
B．过程③通常在低渗溶液中采用PEG融合法诱导原生质体融合
C．除上述方案，通过杂交育种的方式也可以培养出该杂种菌株
D．可利用缺乏甲硫氨酸和精氨酸的基本培养基筛选出融合细胞
3．(2022·山东，15)如图所示，将由2种不同的抗原分别制备的单克隆抗体分子，在体外解偶联后重新偶联可制备双特异性抗体，简称双抗。下列说法错误的是(　　)
A．双抗可同时与2种抗原结合
B．利用双抗可以将蛋白类药物运送至靶细胞
C．筛选双抗时需使用制备单克隆抗体时所使用的2种抗原
D．同时注射2种抗原可刺激B细胞分化为产双抗的浆细胞
4．多种方法获得的早期胚胎，均需移植给受体才能获得后代。如图列举了几项技术成果。下列叙述正确的是(　　)
A．经胚胎移植产生的后代与受体均保持一致
B．①需获得M Ⅱ期的去核卵母细胞
C．②能大幅改良动物性状
D．③可通过②技术实现扩大化生产，①②可通过③技术实现性状改良
5．(2024·南京高三二模)我国科学家成功构建了具有高比例胚胎干细胞的活产嵌合体猴。如图所示，研究人员将4CL体系下培育的、可表达绿色荧光蛋白的供体猕猴的胚胎干细胞(简称4CL干细胞)注射至与其遗传信息不同的猕猴胚胎中，最终得到嵌合体猴。下列叙述正确的是(　　)
A．为防止细菌污染，培养4CL干细胞时可向培养液中加入适量的干扰素
B．4CL干细胞注入桑葚胚后会与其他胚胎细胞发生融合进而形成嵌合体
C．对嵌合囊胚或原肠胚进行胚胎分割后移植，可以产生更多的嵌合体猴
D．嵌合体猴部分细胞可发出绿色荧光，其遗传信息不一定能遗传给后代
6．(2024·青岛高三二模)2023年11月，青岛农业大学成功完成了我国优良地方猪种里岔黑猪的克隆工作，获得20头雄性里岔黑猪。下列说法正确的是(　　)
A．可以使用差速离心的方法去除由核膜包被的卵母细胞的细胞核
B．利用电融合法使供受体细胞融合，供体核进入卵母细胞，形成重构胚
C．在胚胎移植之前，需要切取滋养层细胞做DNA分析，鉴定性别
D．克隆出的20头雄性里岔黑猪的遗传物质均只与供体细胞有关
答案精析
建网络　抓主干
①植物细胞的全能性　②胚胎干细胞　③单克隆抗体的制备
核心提炼
易错辨析
1．(1)×　一般选用代谢旺盛、再生能力强的器官或组织为材料制备外植体。
(2)×　次生代谢物不是植物基本的生命活动所必需的。
(3)×　营养供应充足时，传代培养的胚胎干细胞分裂生长到表面相互接触时会发生接触抑制。
(4)×　由于一种B淋巴细胞经分化形成浆细胞后通常只能产生一种抗体，故筛选出的单个杂交瘤细胞无法分泌多种抗体。
(5)×　将骨髓瘤细胞和B淋巴细胞混合，经诱导后融合的细胞不都是杂交瘤细胞，还有B淋巴细胞自身融合的细胞、骨髓瘤细胞自身融合的细胞，需要进行筛选。
2．(1)×　精子获能是使精子获得受精的能力，不是获得能量。
(2)×　为获得更多的囊胚，应采用激素注射促进雌鼠产生更多的卵子。
(3)×
真题演练
1．D　[观察题图可知，分生组织经过程①获得愈伤组织，因此①为脱分化，1号培养基中的愈伤组织是不定形(排列不规则)的薄壁组织团块，A错误；愈伤组织经过程②长出芽，因此②为再分化，愈伤组织细胞分化(有丝分裂)时可能会发生基因突变，但基因重组发生在减数分裂过程中，B错误；3号培养基用于诱导生根，其细胞分裂素浓度与生长素浓度的比值应该小于1，C错误。]
2．B　[酶解是为了去除植物细胞的细胞壁，过程①中酶处理的时间不同，说明两种亲本的细胞壁结构有差异，A正确；过程②为原生质体的融合，常用化学试剂如PEG诱导原生质体融合，灭活的仙台病毒可诱导动物细胞融合，不能用于植物原生质体融合，B错误；过程④脱分化和⑤再分化的培养基中均需要添加生长素和细胞分裂素，但二者在两个过程中的比例不同，C正确；植物丙是植物甲和植物乙体细胞杂交形成的个体，应具备两者的遗传物质，因此可通过分析植物丙的染色体，来鉴定其是否为杂种植株，D正确。]
3．D　[传代培养时需要营造无菌、无毒以及95%空气＋5%CO2的气体环境，而非密封，A错误；①的细胞还未快速增长，此时进行传代培养没有意义，应选②的细胞进行传代培养，B错误；对于贴壁生长的细胞进行传代培养时，需要先用胰蛋白酶等处理，使之分散为单个细胞，然后再用离心法收集，之后，将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养，C错误。]
4．B　[后代丁的细胞核的遗传物质来自甲，细胞质的遗传物质来自乙，则丁的遗传性状由甲和乙的遗传物质共同决定，A错误；动物细胞培养时需要提供95%空气(保证细胞的有氧呼吸)和5%CO2(维持培养液的pH)的混合气体，B正确；过程②常使用显微操作去核法对卵母细胞进行处理，C错误；过程③将激活后的重组细胞培养至桑葚胚或囊胚后移植，D错误。]
5．B　[胶原蛋白酶可以催化分解细胞外的胶原蛋白，因此利用胶原蛋白酶处理，可分散贴壁生长的骨髓瘤细胞，A正确；由题干可知，该实验制备的是抗－S单克隆抗体，因此抗原为S蛋白，S蛋白含有多个不同的抗原决定基，每一个抗原决定基能够刺激机体产生一种抗体，则按照图示过程可产生多种类型的不同杂交瘤细胞，单克隆抗体A和单克隆抗体B来自不同的杂交瘤细胞，故二者不是相同的单克隆抗体，B错误；用于生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可传代培养，也可冷冻保存，C正确；单克隆抗体A和单克隆抗体B都来自筛选出的杂交瘤细胞，因此都能够特异性识别S蛋白上的抗原决定基，D正确。]
6．D　[选择遗传性状优良、生产能力强的健康波尔母山羊作为供体，进行超数排卵处理，A正确；滋养层细胞将来发育成胎膜和胎盘，胚胎移植前，可采集部分滋养层细胞进行遗传学检测，B正确；胚胎移植的受体需要满足的条件是与供体同种且生理状态相同，而山羊和绵羊是不同的物种，因此普通品质的健康杜泊母绵羊不适合作为受体，C正确；生产中需选择品质良好的波尔公山羊提供精子，D错误。]
模拟预测
1．C　[可用次氯酸钠和酒精对种子进行消毒，A错误；图示过程中添加果胶酶的主要目的是瓦解植物的胞间层，更快获得细胞悬液，B错误；愈伤组织细胞分裂旺盛，更易发生突变，C正确；题图所示过程并未从已分化的植物细胞获得完整植株或其他各种细胞，不能体现植物细胞的全能性，D错误。]
2．D　[酶具有专一性，纤维素酶和果胶酶可去除植物细胞的细胞壁，但透明颤菌属于细菌，细胞壁的成分主要是肽聚糖，青霉菌是真菌，细胞壁的成分主要是几丁质，A错误；过程③在低渗溶液中会发生渗透吸水，导致原生质体涨破，B错误；杂交育种在自然状态下适用于进行有性生殖的真核生物，上述杂种菌株不适于杂交育种，C错误；融合细胞兼有两个细胞的特点，可利用缺乏甲硫氨酸和精氨酸的基本培养基筛选出融合细胞，D正确。]
3．D　[根据抗原和抗体发生特异性结合的原理推测，双抗可同时与2种抗原结合，A正确；根据抗原与抗体能够发生特异性结合的特性，利用双抗可以将蛋白类药物运送至靶细胞，从而使药物发挥相应的作用，B正确；由于双抗是在两种不同的抗原刺激下，B细胞增殖、分化产生不同的浆细胞分泌形成的，因此，筛选双抗时需使用制备单克隆抗体时所使用的2种抗原来进行抗原－抗体检测，从而实现对双抗的筛选，C正确；同时注射2种抗原可刺激B细胞分化形成不同的浆细胞，而不是分化成产双抗的浆细胞，D错误。]
4．D　[子代动物的遗传性状与供体基本一致，A错误；核移植过程中需要处于M Ⅱ中期的去核卵母细胞，而过程①是培育试管动物，需要培育到适宜时期(桑葚胚或囊胚等时期)进行胚胎移植，B错误；过程②得到的是克隆动物，是无性生殖的一种，不能大幅改良动物性状，C错误；过程②克隆技术可得到大量同种个体，为过程③提供了量产方式，而过程③是转基因技术，转基因可导入外源优良基因，为过程①②提供了改良性状的方式，D正确。]
5．D　[为防止细菌污染，培养4CL干细胞时，需要对培养液和所有培养用具进行灭菌处理以及在无菌环境下进行操作，A错误；4CL干细胞不会与其他胚胎细胞发生细胞融合，B错误；对嵌合囊胚或原肠胚不能进行胚胎分割，以免不能均等分割各种细胞，C错误；嵌合体猴中，由4CL干细胞增殖分化形成的组织可发出绿色荧光，由于这些细胞不一定发育成原始生殖细胞，因此其遗传信息不一定能遗传给后代，D正确。]
6．B　[在核移植过程中，可通过显微操作去除卵母细胞中的细胞核，获得去核卵母细胞，A错误；去核的卵母细胞与供体细胞可以通过电融合法融合，供体核进入受体卵母细胞，形成重构胚，B正确；克隆的动物，性别不需要做鉴定，是已知的性别，与供体性别一致，C错误；通过核移植方法培育的克隆动物，其细胞核的遗传物质全部来自供体细胞核，但细胞质中的遗传物质来自提供去核卵母细胞的雌性，D错误。](共89张PPT)
细胞工程
保分点专攻 2　
建网络 抓主干
细胞
工程
延
伸
应用
植物
细胞
工程
原理
①_________________
植物细胞培养
生产次生代谢物，如紫草宁、紫杉醇等
常用
技术
植物组织培养
植物体细胞杂交
应
用
快速繁殖作物
培育脱毒苗
培育作物新品种
常用
方法
应用
化学法、物理法
培育杂种植株
植物细胞的全能性
建网络 抓主干
细胞
工程
动物
细胞
工程
动物细
胞培养
条件
过程
干细胞培养及其应用
种类
应用
②__________
成体干细胞
诱导多能干
细胞
动物细胞
融合技术
常用方法
原理
应用
③________________
动物体细胞
核移植技术
原理
常用于
动物细胞核的全能性
培育克隆动物
步骤
胚胎干细胞
单克隆抗体的制备
建网络 抓主干
终端
环节
细胞
工程
胚胎工程
理论基础
常用技术
受
精
胚胎
早期
发育
体外
受精
胚胎
移植
胚胎
分割
终端
环节
一 核心提炼
1.植物组织培养技术——原理：植物细胞的全能性
(1)植物组织培养中添加蔗糖的目
的是提供营养和调节渗透压。
(2)脱分化阶段不需要光，再分化
阶段需要光。
(3)生长素与细胞分裂素的比值高
时，促进根的分化、抑制芽的形成；比值低时，促进芽的分化、抑制根的形成；比值适中时，促进愈伤组织的形成。
(4)体内细胞未表现全能性的原因：在特定的时间和空间条件下，细胞中的基因会选择性地表达。
2.植物体细胞杂交技术——原理：植物细胞的全能性、细胞膜的流动性
(1)原生质体融合成功的标志是再生出细胞壁。植物体细胞杂交完成的标志是培育出杂种植株。
(2)植物体细胞杂交的培养基中要添加蔗糖溶液且浓度略大于原生质体内的浓度，这样不仅能为原生质体提供营养，还能维持一定的渗透压，使原生质体保持正常的形态。
3.针对两类目标(试管苗、细胞产物)的培养流程
(1)植物细胞培养技术是工厂化生产相关代谢产物的一条有效途径，在生产中通常要培养到愈伤组织阶段。因为此时细胞分裂能力旺盛，代谢快，有利于产物生成。
(2)植物组织培养的原理是植物细胞的全能性，植物细胞培养的原理是细胞增殖。
4.动物细胞培养(以贴壁细胞为例)——原理：细胞增殖
(1)动物细胞培养过程
①保障无菌、无毒的措施：对培养液和所有培养用具进行灭菌处理以及在无菌条件下进行操作，定期更换培养液。
②动物细胞培养所需气体主要有O2和CO2。O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH。在进行细胞培养时，通常采用培养皿或松盖培养瓶，并将它们置于含有95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中进行培养。
③动物细胞培养过程中两次使用胰蛋白酶的作用不同。第一次：处理剪碎的组织，使其分散成单个细胞；第二次：使贴壁生长的细胞从瓶壁上脱落下来分散成单个细胞。
④区分原代培养和传代培养的关键：是否分瓶培养。
(2)干细胞
5.单克隆抗体的制备
——原理：细胞膜的
流动性、细胞增殖
(1)体细胞核移植获得的克隆动物与提供细胞核的亲本性状可能不同的三个原因：①克隆动物遗传物质来自两个亲本；②发育过程中可能发生基因突变或染色体变异；③外界环境可能引起不可遗传的变异。
(2)克隆动物的产生属于无性繁殖过程，而试管动物则是在体外受精形成受精卵，由受精卵发育成的个体，因此属于有性繁殖。
6.动物体细胞核移植技术——原理：动物细胞核的全能性
7.哺乳动物的早期胚胎发育过程
(1)受精过程中的两个标志：受精的标志是观察到两个极体或雌、雄原核；受精完成的标志是雌、雄原核融合完成。
(2)桑葚胚是由受精卵分裂形成的，没有分化；而囊胚虽然已进行细胞分化，但囊胚的内细胞团仍具有全能性。
8.胚胎移植的操作流程
(1)胚胎移植过程中的两次检查：第一次对收集的胚胎进行检查；第二次对受体母畜是否妊娠进行检查。
(2)胚胎移植产生的后代是有性生殖还是无性生殖，取决于胚胎发育的起点。若后代是由受精卵形成的，则为有性生殖；若后代是由核移植技术形成的重组细胞或胚胎分割形成的胚胎发育而成，则为无性生殖。
(3)用于移植的胚胎来源：体内正常受精的胚胎、核移植的胚胎和体外受精获得的胚胎、转基因获得的胚胎、胚胎分割获得的胚胎等。
9.胚胎移植的生理学基础
10.胚胎分割
1.判断下列有关细胞工程的叙述
(1)在蓝莓组织培养过程中，宜选用蓝莓成熟叶片为材料制备外植体
(　　)
提示：一般选用代谢旺盛、再生能力强的器官或组织为材料制备外植体。
×
(2)次生代谢物是植物所必需的，但含量少，应选择产量高的细胞进行培养(　　)
提示：次生代谢物不是植物基本的生命活动所必需的。
×
(3)营养供应充足时，传代培养的胚胎干细胞不会发生接触抑制(　　)
提示：营养供应充足时，传代培养的胚胎干细胞分裂生长到表面相互接触时会发生接触抑制。
×
(4)在制备单克隆抗体过程中可利用抗原—抗体结合的原理筛选出能分泌多种抗体的单个杂交瘤细胞(　　)
提示：由于一种B淋巴细胞经分化形成浆细胞后通常只能产生一种抗体，故筛选出的单个杂交瘤细胞无法分泌多种抗体。
×
(5)将骨髓瘤细胞和B淋巴细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞(　　)
提示：将骨髓瘤细胞和B淋巴细胞混合，经诱导后融合的细胞不都是杂交瘤细胞，还有B淋巴细胞自身融合的细胞、骨髓瘤细胞自身融合的细胞，需要进行筛选。
×
2.判断下列有关胚胎工程的叙述
(1)通常采用培养法或化学诱导法使精子获得能量后进行体外受精
(　　)
提示：精子获能是使精子获得受精的能力，不是获得能量。
×
(2)为获得更多的囊胚，采用激素注射促进雄鼠产生更多的精子(　　)
提示：为获得更多的囊胚，应采用激素注射促进雌鼠产生更多的卵子。
×
(3)将黑色小鼠囊胚的内细胞团部分细胞注射到白色小鼠囊胚腔中，接受注射的囊胚发育为黑白相间的小鼠(Mc)，获得Mc的生物技术属于核移植(　　)
×
二 真题演练
1.(2024·甘肃，15)兰州百合栽培过程中易受病毒侵染，造成品质退化。某研究小组尝试通过组织培养技术获得脱毒苗，操作流程如图。下列叙述正确的是
A.①为脱分化过程，1号培养基中的愈伤组织是排列规则的薄壁组织团块
B.②为再分化过程，愈伤组织细胞分化时可能会发生基因突变或基因重组
C.3号培养基用于诱导生根，其细胞分裂素浓度与生长素浓度的比值大于1
D.百合分生区附近的病毒极少，甚至无病毒，可以作为该研究中的外
植体
√
观察题图可知，分生组织经过程①获得愈伤组织，因此①为脱分化，1号培养基中的愈伤组织是不定形(排列不规则)的薄壁组织团块，A错误；
愈伤组织经过程②长出芽，因此②为再分化，愈伤组织细胞分化(有丝分裂)时可能会发生基因突变，但基因重组发生在减数分裂过程中，B错误；
3号培养基用于诱导生根，其细胞分裂素浓度与生长素浓度的比值应该小于1，C错误。
2.(2024·湖北，11)植物甲抗旱、抗病性强，植物乙分蘖能力强、结实性好。科研人员通过植物体细胞杂交技术培育出兼有甲、乙优良性状的植物丙，过程如图所示。下列叙述错误的是
A.过程①中酶处理的时间差异，原
因可能是两种亲本的细胞壁结构
有差异
B.过程②中常采用灭活的仙台病毒
或PEG诱导原生质体融合
C.过程④和⑤的培养基中均需要添加生长素和细胞分裂素
D.可通过分析植物丙的染色体，来鉴定其是否为杂种植株
√
酶解是为了去除植物细胞的细胞壁，过程①中酶处理的时间不同，说明两种亲本的细胞壁结构有差异，A正确；
过程②为原生质体的融合，常用
化学试剂如PEG诱导原生质体融合，灭活的仙台病毒可诱导动物细胞融合，不能用于植物原生质体融合，B错误；
过程④脱分化和⑤再分化的培养基中均需要添加生长素和细胞分裂素，但二者在两个过程中的比例不同，C正确；
植物丙是植物甲和植物乙体细胞杂交形成的个体，应具备两者的
遗传物质，因此可通过分析植物丙的染色体，来鉴定其是否为杂种植株，D正确。
3.(2024·黑吉辽，14)从小鼠胚胎中分离获取胚胎成纤维细胞进行贴壁培养，在传代后的不同时间点检测细胞数目，结果
如图。下列叙述正确的是
A.传代培养时，培养皿需密封防止污染
B.选取①的细胞进行传代培养比②更合理
C.直接用离心法收集细胞进行传代培养
D.细胞增长进入平台期可能与细胞密度过大有关
√
传代培养时需要营造无菌、无毒以及95%空气＋5%CO2的气体环境，而非密封，A错误；
①的细胞还未快速增长，此时进行传代培养没有意义，应选②的细胞进行传代培养，B错误；
对于贴壁生长的细胞进行传代培养时，需要先用胰蛋白酶等处理，使之分散为单个细胞，然后再用离心法收集，之后，将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养，C错误。
4.(2021·辽宁，13)如图是利用体细胞核移植技术克隆优质奶牛的简易流程图，下列有关叙述正确的是
A.后代丁的遗传性状由甲和丙的遗传物质共同决定
B.过程①需要提供95%空气和5%CO2的混合气体
C.过程②常使用显微操作去核法对受精卵进行处理
D.过程③将激活后的重组细胞培养至原肠胚后移植
√
后代丁的细胞核的遗传
物质来自甲，细胞质的
遗传物质来自乙，则丁
的遗传性状由甲和乙的
遗传物质共同决定，A错误；
动物细胞培养时需要提供95%空气(保证细胞的有氧呼吸)和5%CO2(维持培养液的pH)的混合气体，B正确；
过程②常使用显微操作去核法对卵母细胞进行处理，C错误；
过程③将激活后的重组细胞培养至桑葚胚或囊胚后移植，D错误。
5.(2024·江西，16改编)某病毒颗粒表面有一特征性的大分子结构蛋白S(含有多个不同的抗原决定基，每一个抗原决定基能够刺激机体产生一种抗体)。为了建立一种灵敏、高效检测S蛋白的方法，研究人员采用杂交瘤技术制备了抗－S单克隆抗体(如图)。下列说法错误的是
A.利用胶原蛋白酶处理，可分散
贴壁生长的骨髓瘤细胞
B.制备的单克隆抗体A和单克隆
抗体B是相同的单克隆抗体
C.用于生产单克隆抗体的杂交瘤
细胞可传代培养，也可冻存
D.单克隆抗体A和单克隆抗体B都能够特异性识别S蛋白
√
胶原蛋白酶可以催化分解细胞外的胶原蛋白，因此利用胶原蛋白酶处理，可分散贴壁生长的骨髓瘤细胞，A正确；
由题干可知，该实验制备的是抗－S单克隆抗体，因此抗原为S蛋白，S蛋白含有多个不同的抗原决定基，每一个抗原决定基能够刺激机体产生一种抗体，则按照图示过程可产生多种类型的不同杂交瘤细胞，单克隆抗体A和单克隆抗体B来自不同的杂交瘤细胞，故二者不是相同的单克隆抗体，B错误；
用于生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可传代培养，也可冷冻保存，C正确；
单克隆抗体A和单克隆抗体B都来自筛选出的杂交瘤细胞，因此都能够特异性识别S蛋白上的抗原决定基，D正确。
6.(2024·湖北，5)波尔山羊享有“世界山羊之王”的美誉，具有生长速度快、肉质细嫩等优点。生产中常采用胚胎工程技术快速繁殖波尔山羊。下列叙述错误的是
A.选择遗传性状优良的健康波尔母山羊进行超数排卵处理
B.胚胎移植前可采集滋养层细胞进行遗传学检测
C.普通品质的健康杜泊母绵羊不适合作为受体
D.生产中对提供精子的波尔公山羊无需筛选
√
选择遗传性状优良、生产能力强的健康波尔母山羊作为供体，进行超数排卵处理，A正确；
滋养层细胞将来发育成胎膜和胎盘，胚胎移植前，可采集部分滋养层细胞进行遗传学检测，B正确；
胚胎移植的受体需要满足的条件是与供体同种且生理状态相同，而山羊和绵羊是不同的物种，因此普通品质的健康杜泊母绵羊不适合作为受体，C正确；
生产中需选择品质良好的波尔公山羊提供精子，D错误。
三 模拟预测
1.(2024·济南高三模拟)甘草是中医使用最多的药材之一，其提取物中的黄酮具有抗衰老、抗炎等作用。如图表示利用悬浮培养生产甘草黄酮的过程。下列叙述正确的是
A.可用次氯酸钠和酒精对种子进行灭菌
B.图中添加果胶酶的主要目的是获得原生质体
C.对细胞悬液进行人工诱变，其变异率常高于对器官或个体进行诱变
D.图示过程能体现植物细胞的全能性
√
可用次氯酸钠和酒精对种子进行消毒，A错误；
图示过程中添加果胶酶的主要目的是瓦解植物的胞间层，更快获得细胞悬液，B错误；
愈伤组织细胞分裂旺盛，更易发生突变，C正确；
题图所示过程并未从已分化的植物细胞获得完整植株或其他各种细胞，不能体现植物细胞的全能性，D错误。
2.(2024·淮南高三三模)青霉素发酵是高耗氧过程，为保证发酵过程中青霉素的持续高产，研究人员将透明颤菌的血红蛋白引入青霉菌，设计方案如图所示。下列叙述正确
的是
A.过程①②需要用纤维素酶
和果胶酶去除细胞壁获得
原生质体
B.过程③通常在低渗溶液中采用PEG融合法诱导原生质体融合
C.除上述方案，通过杂交育种的方式也可以培养出该杂种菌株
D.可利用缺乏甲硫氨酸和精氨酸的基本培养基筛选出融合细胞
√
酶具有专一性，纤维素酶和果
胶酶可去除植物细胞的细胞壁，
但透明颤菌属于细菌，细胞壁
的成分主要是肽聚糖，青霉菌
是真菌，细胞壁的成分主要是几丁质，A错误；
过程③在低渗溶液中会发生渗透吸水，导致原生质体涨破，B错误；
杂交育种在自然状态下适用于
进行有性生殖的真核生物，上
述杂种菌株不适于杂交育种，
C错误；
融合细胞兼有两个细胞的特点，可利用缺乏甲硫氨酸和精氨酸的基本培养基筛选出融合细胞，D正确。
3.(2022·山东，15)如图所示，将由2种不同的抗原分别制备的单克隆抗体分子，在体外解偶联后重新偶联可制备双特异性抗体，简称双抗。下列说法错误的是
A.双抗可同时与2种抗原结合
B.利用双抗可以将蛋白类药物运送至靶细胞
C.筛选双抗时需使用制备单克隆抗体时所使用的2种抗原
D.同时注射2种抗原可刺激B细胞分化为产双抗的浆细胞
√
根据抗原和抗体发生特异性结合的原理推测，
双抗可同时与2种抗原结合，A正确；
根据抗原与抗体能够发生特异性结合的特性，
利用双抗可以将蛋白类药物运送至靶细胞，从而使药物发挥相应的作用，B正确；
由于双抗是在两种不同的抗原刺激下，B细胞增殖、分化产生不同的浆细胞分泌形成的，因此，筛选双抗时需使用制备单克隆抗体时所使用的2种抗原来进行抗原－抗体检测，从而实现对双抗的筛选，C正确；
同时注射2种抗原可刺激B细胞分化形成不同的浆细胞，而不是分化成产双抗的浆细胞，D错误。
4.多种方法获得的早期胚胎，均需移植给受体才能获得后代。如图列举了几项技术成果。下列叙述正确的是



A.经胚胎移植产生的后代与受体均保持一致
B.①需获得M Ⅱ期的去核卵母细胞
C.②能大幅改良动物性状
D.③可通过②技术实现扩大化生产，①②可通过③技术实现性状改良
√
子代动物的遗传性状与供体基本一致，A错误；
核移植过程中需要处于M Ⅱ中期的去核卵母细胞，而过程①是培育试管动物，需要培育到适宜时期(桑葚胚或囊胚等时期)进行胚胎移植，B错误；
过程②得到的是克隆动物，是无性生殖的一种，不能大幅改良动物性状，C错误；
过程②克隆技术可得到大量同种个体，为过程③提供了量产方式，而过程③是转基因技术，转基因可导入外源优良基因，为过程①②提供了改良性状的方式，D正确。
5.(2024·南京高三二模)我国科学家成功构建了具有高比例胚胎干细胞的活产嵌合体猴。如图所示，研究人员将4CL体系下培育的、可表达绿色荧光蛋白的供体猕猴的胚胎干细胞(简称4CL干细胞)注射至与其遗传信息不同的猕猴胚胎中，最终得到嵌合体猴。下列叙述正确的是
A.为防止细菌污染，培养4CL干细胞时
可向培养液中加入适量的干扰素
B.4CL干细胞注入桑葚胚后会与其他胚
胎细胞发生融合进而形成嵌合体
C.对嵌合囊胚或原肠胚进行胚胎分割后
移植，可以产生更多的嵌合体猴
D.嵌合体猴部分细胞可发出绿色荧光，其遗传信息不一定能遗传给后代
√
为防止细菌污染，培养4CL干细胞时，需要对培养液和所有培养用具进行灭菌处理以及在无菌环境下进行操作，A错误；
4CL干细胞不会与其他胚胎细胞发生细胞融合，B错误；
对嵌合囊胚或原肠胚不能进行胚胎分割，
以免不能均等分割各种细胞，C错误；
嵌合体猴中，由4CL干细胞增殖分化形成的组织可发出绿色荧光，由于这些细胞不一定发育成原始生殖细胞，因此其遗传信息不一定能遗传给后代，D正确。
6.(2024·青岛高三二模)2023年11月，青岛农业大学成功完成了我国优良地方猪种里岔黑猪的克隆工作，获得20头雄性里岔黑猪。下列说法正确的是
A.可以使用差速离心的方法去除由核膜包被的卵母细胞的细胞核
B.利用电融合法使供受体细胞融合，供体核进入卵母细胞，形成重构胚
C.在胚胎移植之前，需要切取滋养层细胞做DNA分析，鉴定性别
D.克隆出的20头雄性里岔黑猪的遗传物质均只与供体细胞有关
√
在核移植过程中，可通过显微操作去除卵母细胞中的细胞核，获得去核卵母细胞，A错误；
去核的卵母细胞与供体细胞可以通过电融合法融合，供体核进入受体卵母细胞，形成重构胚，B正确；
克隆的动物，性别不需要做鉴定，是已知的性别，与供体性别一致，C错误；
通过核移植方法培育的克隆动物，其细胞核的遗传物质全部来自供体细胞核，但细胞质中的遗传物质来自提供去核卵母细胞的雌性，D错误。
四 专题强化练
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答案
对一对
题号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
答案 B A B D B A B B B A
题号 11
答案 (1)动物细胞培养和动物细胞融合　(2)聚乙二醇(PEG)　3　(3)既能大量增殖，又能产生抗紫杉醇抗体　维持培养液的pH　(4)愈伤组织的细胞分裂快，代谢旺盛　细胞容易从液体培养基中获取营养，排出代谢产物　1.0
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对一对
答案
题号 12
答案 (1)纤维素酶和果胶酶　(2)融合的杂种　融合的杂种细胞生理互补，细胞代谢正常，能正常分裂　(3)PEG(或聚乙二醇)　细胞分裂素与生长素的比例　(4)植物细胞的全能性　能克服远缘杂交不亲和的障碍
题号 13
答案 (1)Ca2＋载体(或乙醇、蛋白酶合成抑制剂)　(2)纺锤体—染色体复合物　(3)使人源干细胞分化产生人的组织、器官　(4)不会　会　(5)选取囊胚的滋养层细胞，检测是否含有人特有的DNA序列
1.(2024·安徽，15)植物细胞悬浮培养技术在生产中已得到应用。某兴趣小组尝试利用该技术培养胡萝卜细胞并获取番茄红素，设计了如图实验流程和培养装置，请同学们进行评议。下列评议不合理的是
A.实验流程中应该用果胶酶等处理愈伤组织，制备
悬浮细胞
B.装置中的充气管应置于液面上方，该管可同时作
为排气管
C.装置充气口需要增设无菌滤器，用于防止杂菌污
染培养液
D.细胞培养需要适宜的温度，装置需增设温度监测
和控制设备
√
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答案
植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，欲利用愈伤组织制备悬浮细胞，可用纤维素酶和果胶酶处理愈伤组织，A合理；
装置中的充气管应置于液面下方，以利于增加培养液中的溶氧量，为及时排出多余气体，排气管应置于液面上方，因此充气管不能同时作为排气管，B不合理。
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答案
2.(2024·海南华侨中学高三二模)甲品种青花菜具有由核基因控制的多种优良性状，另一远缘植物乙的细胞质中存在抗除草剂基因，欲将乙细胞质中的抗性基因引入甲中。下列相
关叙述错误的是
A.操作过程中生物材料、培养基、
培养环境都要严格灭菌
B.过程a中取顶芽细胞进行体细胞
杂交有利于获得脱毒苗
C.过程b中可以用物理法或化学法诱导原生质体融合
D.过程c中只有活性部位互补的融合细胞才可以正常生长
√
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答案
操作过程中生物材料需要进行消毒，培养基、培养环境需要灭菌，A错误；
若想获得脱毒苗，应选用茎尖或芽尖(分生组织)进行培养，
因此利用顶芽细胞进行体细胞杂交有利于获得脱毒苗，B正确；
过程b为诱导原生质体融合，诱导方法有物理法和化学法，如聚乙二醇融合法、离心法等，C正确；
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答案
过程c中只有活性部位互补的融合细胞具有完整的细胞结构，才可以正常生长，D正确。
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答案
3.与常规栽培技术相比，利用植物细胞培养进行药用次生代谢产物的生产具有显著的优越性，根据不同的需求可以采用不同的技术流程(如图)。下列相关叙述错误的是
A.同一植物的外植体通过
不同的培养体系可得到
不同的产物
B.外植体形成愈伤组织的过程中，经历了脱分化和再分化两个阶段
C.将目标产物合成途径中的关键酶基因导入悬浮细胞，有望提高产量
D.由于不受土壤、气候条件限制，利用该技术有利于缓解资源短缺问题
√
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答案
据图可知，同一植物的外植体通过不同的培养体系可得到不同的产物，如经悬浮细胞培养可得到转基因细胞系，经外植体诱导能够获得完整植株等，A正确；
外植体形成愈伤组织的过程中，只经历了脱分化过程，B错误。
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答案
4.(2024·潍坊高三三模)细胞划痕实验是一种研究细胞迁移的体外实验方法。当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合，以此来观察测量细胞的迁移侵袭能力。下列说法错误的是
A.经划痕处理后的细胞需放在CO2培养箱中进行培养
B.为更好地达到实验目的可适当降低培养基中血清的浓度
C.并非所有的动物细胞都适合做划痕实验
D.划痕缩小直至愈合，完全由细胞迁移所导致
√
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答案
经划痕处理后的细胞需放在CO2培养箱中进行培养，以维持培养液的pH，A正确；
为更好地达到实验目的，可适当降低培养基中血清的浓度，以减少细胞增殖，B正确；
并非所有的动物细胞都适合做划痕实验，有些细胞不迁移，C正确；
划痕缩小直至愈合，不完全由细胞迁移所导致，也有细胞增殖的原因，D错误。
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答案
5.(2024·哈尔滨高三二模)小鼠胚胎干细胞经定向诱导可获得多种功能细胞，制备流程如图所示。下列有关
叙述正确的是
A.胚胎干细胞只能从囊胚的内细胞
团中分离获得
B.分离出的细胞a、b要在CO2培养箱中进行培养
C.定向诱导胚胎干细胞形成多种功能细胞时表达的基因都不同
D.向培养液中加入动物血清会刺激胚胎干细胞表现出全能性
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答案
胚胎干细胞可从早期胚胎中分离获得，早期胚胎不仅仅包括囊胚，A错误；
分离出的胚胎干细胞要在CO2培
养箱中进行培养，以维持培养液的pH，B正确；
定向诱导胚胎干细胞形成多种功能细胞时表达的基因部分相同，如与呼吸作用有关的酶合成的基因，部分不同，如赋予细胞特定功能的有关基因，C错误；
动物血清能弥补人工合成的培养基中所欠缺的未知营养成分，并不具备刺激胚胎干细胞表现出全能性的功能，D错误。
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答案
6.(2024·青岛高三三模)线粒体置换技术是一种预防人类线粒体遗传病的技术手段。极体中主要内容物为排出的
核基因组，所含线粒体数量较少，
因此可以将其作为良好的核供体
用于线粒体置换，其过程如图所
示。下列说法正确的是
A.图中获取的极体1为第一极体，
极体2为第二极体
B.图中“？”处指受精作用，精子需进行获能处理，为受精提供能量
C.该过程也可直接用患者的体细胞作为核供体
D.图中极体2的遗传物质来自供卵卵母细胞
√
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答案
依据图示，极体1是由卵原细胞经过减数分裂Ⅰ产生的，因此是第一极体，由于供卵卵母细胞不具备纺锤体，不能进行分裂，故极体2是第一极体经
过减数分裂Ⅱ产生，因此是第二极体，A正确；
图中“？”处指受精作用，精子需进行获能处理，这里的“获能”是指具备受精的能力，而不是直接为受精作用提供能量，B错误；
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据图可知，该过程中利用极体作为核供体，因为极体中的线粒体数量少，适合进行线粒体置换，若直接使用患者的体细胞作为核供体可能会引入有问
题的线粒体，C错误；
极体是由卵原细胞经过减数分裂产生的，其遗传物质主要来自卵原细胞，由于供卵卵母细胞不具备纺锤体，不能进行分裂，故图中极体2的遗传物质来自患者卵母细胞，D错误。
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答案
7.(2024·甘肃，16)甘加藏羊是甘肃高寒牧区的优良品种，是季节性发情动物，每年产羔一次，每胎一羔，繁殖率较低。为促进畜牧业发展，研究人员通过体外受精、胚胎移植等胚胎工程技术提高藏羊的繁殖率，流程如图。下列叙述错误的是
A.藏羊甲需用促性腺激素处理使其
卵巢卵泡发育和超数排卵
B.藏羊乙的获能精子能与刚采集到
的藏羊甲的卵母细胞受精
C.受体藏羊丙需和藏羊甲进行同期发情处理
D.后代丁的遗传物质来源于藏羊甲和藏羊乙
√
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答案
胚胎移植过程中，需用外源促性腺激素处理供体(母藏羊甲)，促使其卵巢卵泡发育和超数排卵，A正确；
刚采集的卵母细胞需培养成熟(减数分裂Ⅱ期)后才可与获能的精子进行
体外受精，B错误；
在胚胎移植前要对供体和接受胚胎的受体进行同期发情处理，使受体的生理状况与供体相同，C正确；
后代丁是由藏羊甲的卵细胞和藏羊乙的精子结合形成的受精卵发育而来的，因此后代丁的遗传物质来源于藏羊甲和藏羊乙，D正确。
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答案
8.第三代试管婴儿技术(PGD/PGS)是对早期胚胎细胞进行基因诊断和染色体检测后再进行胚胎移植，流程如图所示。图中检
测包括PGD、PGS(PGD是指胚胎植入前的基因
诊断，PGS是指胚胎植入前的染色体数目和结
构检测)。下列叙述错误的是
A.采集的卵子需培养至M Ⅱ期才能与获能的精
子进行受精
B.PGD和PGS技术可分别用于筛选唐氏综合征和红绿色盲
C.进行胚胎移植前不需要对夫妻双方进行免疫检查
D.“理想胚胎”需培养至桑葚胚或囊胚时期才能植入子宫
√
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答案
体外受精时，需要将采集到的卵母细胞在体外培养至M Ⅱ期，才可以与获能的精子完成受精作用，A正确；
PGD是指胚胎植入前的基因诊断，可用于筛选红绿色盲，PGS是指胚胎植入前的染色体数目和结构检测，可用于筛选唐氏综
合征，B错误；
受体子宫对外来胚胎几乎不发生免疫反应，因此进行胚胎移植前不需要对夫妻双方进行免疫检查，C正确；
“理想胚胎”需培养至桑葚胚或囊胚才能植入子宫，D正确。
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9.我国科学家成功地用iPS细胞克隆出了活体小鼠，部分流程如图所示，其中Kdm4d为组蛋白去甲基化酶，TSA为组蛋白去乙酰化酶抑制剂。下列说法正确的是
A.组蛋白去乙酰化和去甲基化有利于重构胚后续的胚胎发育过程
B.用电刺激、Ca2＋载体等方法激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育进程
C.过程③中诱导细胞融合体现了细胞膜的选择透过性
D.图示流程运用了重组DNA、体细胞核移植、胚胎移植等技术
√
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结合题图可知，重构胚在加入含Kdm4d的mRNA和TSA后，发育成克隆鼠，而Kdm4d的mRNA表达产物为组蛋白去甲基化酶，可以使组蛋白去甲基化，TSA为组蛋白去乙酰化酶抑制剂，抑制组蛋白去乙酰化酶的作用，保持组蛋白乙酰化，即组蛋白乙酰化和去甲基化有利于重构胚后续的胚胎发育过程，A错误；
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答案
在体细胞核移植过程中，用物理方法或化学方法(如电刺激、Ca2＋载体、乙醇、蛋白酶合成抑制剂等)激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育进程，B正确；
过程③中诱导细胞融合体现了细胞膜的流动性，C错误；
图示流程运用了体细胞核移植、胚胎移植等技术，并未运用重组DNA技术，D错误。
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答案
10.(2024·湖北，10)研究者探究不同浓度的雌激素甲对牛的卵母细胞和受精卵在体外发育的影响，实验结果如表所示。根据实验数据，下列叙述错误的是
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答案
甲的浓度/(μg·mL－1) 卵母细胞/个 第一极体排出/个 成熟率/% 卵裂数/个 卵裂率/%
0 106 70 66.0 28 40.0
1 120 79 65.8 46 58.2
10 113 53 46.9 15 28.3
100 112 48 42.8 5 10.4
A.实验结果说明甲抑制卵裂过程
B.甲浓度过高抑制第一极体的排出
C.添加1 μg·mL－1的甲可提高受精后胚胎发育能力
D.本实验中，以第一极体的排出作为卵母细胞成熟的判断标准
√
由表可知，甲低浓度时促进卵裂，高浓度时抑制卵裂，A错误；
添加1 μg·mL－1的甲，卵裂数增多，卵裂率增大，即该条件可提高受精后胚胎发育能力，C正确。
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答案
11.紫杉醇是一种从红豆杉树皮中分离提纯的天然抗癌药物。为快速检测紫杉醇，研究人员利用细胞工程技术制备了抗紫杉醇单克隆抗体，制备过程如图1所示。回答下列问题：
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答案
(1)抗紫杉醇单克隆抗体的获得所涉及的生物技术有__________________
_________。
动物细胞培养和动物
细胞融合
(2)图1过程①用化学方法诱导融合时可选用_________________，能得到
______类两两融合的细胞。
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答案
聚乙二醇(PEG)
3
(3)为获得杂交瘤细胞，应用特定的选择培养基对细胞甲进行筛选，然后通过专一抗体检测和克隆化培养获得_______________________________
_____的杂交瘤细胞。若要在体外培养液中培养筛选的杂交瘤细胞，需要将培养液放置在含95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中培养，CO2的作用是________________。
既能大量增殖，又能产生抗紫杉醇
抗体
维持培养液的pH
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答案
(4)紫杉醇是红豆杉产生的一种代谢产物，欲利用植物细胞培养获得大量的紫杉醇，应将红豆杉的外植体培育到愈伤组织阶段，原因是_____
___________________________。研究人员用少量果胶酶处理红豆杉愈
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答案
伤组织获取单细胞，由愈伤组织培养阶段转入细胞悬浮培养阶段。悬浮培养基为液体培养基，更有利于细胞的生长，原因是_________________
_____________________________。据图2分析，为使紫杉醇总产量最高，图中最适合的2,4-D浓度应为______mg·L－1。
愈伤
组织的细胞分裂快，代谢旺盛
细胞容易从液体培
养基中获取营养，排出代谢产物
1.0
12.(2024·西安高三模拟)苜蓿是广泛应用的豆科牧草，其叶片中的水溶性蛋白质会导致反刍动物患鼓胀病。百脉根的叶片富含单宁，能防止反刍动物鼓胀病的发生。科研人员用紫花苜蓿和百脉根培育抗鼓胀病的新型牧草，育种流程如图所示。已知R-6G可阻止线粒体的功能，IOA能抑制细胞分裂。回答下列问题：
(1)为获得原生质体，常用
_________________处理植
物细胞以去除细胞壁。
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答案
纤维素酶和果胶酶
(2)获得的原生质体分别用IOA和R-6G处理后进行融合，培养后，只有___________细胞才能生长出愈伤组织，原因是______________________
_____________________________。
(3)过程①可利用________________试剂促融，过程②③使用的培养基的主要区别是__________________________不同。
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答案
融合的杂种
融合的杂种细胞生理互
补，细胞代谢正常，能正常分裂
PEG(或聚乙二醇)
细胞分裂素与生长素的比例
(4)由杂种细胞团经过程②③的培育得到幼苗，依据的生物学原理是_________________。图示培育新型牧草所运用的生物技术的主要优点是____________________________。
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答案
植物细胞的全能性
能克服远缘杂交不亲和的障碍
13.(2024·昆明高三三模)我国科学家利用动物培育可用于移植的人源器官，图示为相关过程，SIX1和SALL1基因是猪肾脏发育和肾脏细胞自我更新的必需基因。请分析回答下列问题：
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答案
(1)可用________________________
____________(写出1种即可)化学方法激活重构胚。
(2)取猪的去核卵母细胞步骤中的“核”指的是__________________
______。
Ca2＋载体(或乙醇、蛋白酶
合成抑制剂)
纺锤体—染色体复
合物
(3)从干细胞的特点角度分析注入人源干细胞的作用：______________
_____________________。
(4)代孕母猪对外来的早期胚胎______(填“会”或“不会”)产生免疫排斥，人源肾脏用于器官移植_____(填“会”或“不会”)产生免疫排斥。
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答案
使人源干细胞分
化产生人的组织、器官
不会
会
代孕母猪对植入的胚胎几乎不发生免疫排斥反应，因而可以保证移植的成功率，这是胚胎移植的基础，人源肾脏用于器官移植，人源肾脏属于外来器官，用于器官移植会引起免疫排斥。
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答案
(5)用基因工程等技术，选取囊胚中的某些细胞，可以确定得到的嵌合胚胎是否为人源胚胎，请简要写出实验思路：_________________________
____________________________。
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答案
选取囊胚的滋养层细胞，检测是否含有人特有的DNA序列　PCR技术与应用
一、PCR技术“引物”归类分析
1．引物的设计
(1)(2020·山东，25节选)通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出Wx基因的cDNA，原因是________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________。
(2)(经典高考题节选)设计引物时需要避免引物之间发生__________，而造成引物自连。同理也要避免引物之间的互补。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同且____________的引物需要设定更高的复性温度。
(3)科学设计引物是PCR能否成功的关键，若引物的碱基过多或引物的G、C含量过高，会造成PCR的效率偏低，收获的目的基因较少，原因是______________________________
________________________________________________________________________。
若对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果发现有两个或多个条带，从引物角度分析，原因可能是________________________________________________________________。
拓展　引物与复性温度
(1)复性温度：复性温度高，扩增特异性强；复性温度低，扩增效率高。
(2)引物：①引物长度越长，越容易形成氢键，为避免出现错配，需要适当提高复性温度；
②引物GC含量越高，容易出现非特异性结合，需要适当提高复性温度。
2．引物的修饰
(1)(2022·山东，25节选)某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG－P和FLAG－PΔ。PΔ是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或PΔ的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或PΔ的功能。
①为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是__________________________________________________________
________________________________________________________________________，
为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的______(填“3′端”或“5′端”)。
②PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图分析，出现该问题的原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
修改扩增P基因时使用的带有EcoR Ⅰ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)引物用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，设计了引物Ⅰ、Ⅱ，其连接部位如图所示，X为某限制酶识别序列。扩增后得到的绝大部分DNA片段是图中的(　　)
3．引物的结合方向
如图为X蛋白的部分基因序列，所示序列为引物结合的部分，据图分析：
扩增X蛋白基因所需的引物序列是________________；________________。
4．引物的数量计算
(1)如图：一个DNA分子n次扩增，则：
①子代DNA分子中等长链的DNA分子数为________个；
②子代DNA分子中不等长链的DNA分子数为________个；
③子代DNA分子中含模板链DNA分子数为________个；
④子代DNA分子中含引物A(或B)的DNA分子数为________个；
⑤复制过程中共需引物________个；
⑥第n次复制需要引物________个。
(2)已知引物1及引物2之间的序列为目的序列，若引物与DNA的结合位点如图所示，在第________轮循环产物中开始出现两条单链等长的目的片段。
二、PCR产物鉴定——琼脂糖凝胶电泳
(2024·黑吉辽，7)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是(　　)
A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快
D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
三、常用PCR技术及原理
1．利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式
为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图中A所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________。
2．利用重叠延伸PCR技术引导基因定点突变
如图为利用重叠延伸PCR的方法在蛋白a基因中部引入定点突变(A/T碱基对变为G/C)的过程。该过程需设计四种引物，其中引物A、D与蛋白a基因的两端完全配对，引物B、C虽与蛋白a基因中部配对，但在欲引入突变的位置替换为突变后的碱基。通过多次独立的PCR达到目的。
下列说法不正确的是(　　)
A．PCR1所用引物应为引物A和B
B．PCR2至PCR4依次以PCR1至PCR3的产物为模板
C．PCR3无需额外加入引物
D．PCR4的作用是大量扩增突变基因
3．利用重叠延伸PCR技术构造融合基因
融合PCR技术是采用具有互补末端的引物，将不同来源的扩增片段连接起来的方法，其过程如图1所示。图2是中间载体1和中间载体2(利用融合PCR技术构建成)构建成叶绿体定点整合表达载体示意图(限制酶酶切位点标注于载体外侧)，叶绿体定点整合表达载体通过与叶绿体基因的同源重组，将目的基因整合于叶绿体DNA上的特定位点上。请据图回答下列问题：
(1)图1第一阶段中PCR至少进行______次循环，才能获得双链等长的DNA，第二阶段中引物2与引物3部分碱基的____________关系使得两DNA能成功“搭桥”连接起来。
(2)若通过融合PCR技术将启动子、标记基因、目的基因、终止子拼接起来，需要设计______种引物，其中能够起着“搭桥”作用的引物有______种。
(3)图2中需使用________________(填限制酶)和DNA连接酶将两中间载体构建成定点整合表达载体，途中定点整合表达载体上未标出的结构是__________。
4．利用反向PCR技术扩增未知基因序列
如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcoR Ⅰ酶切为例)。
请据图回答问题：
(1)如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的引物必须是________(从表格引物①②③④中选择，填编号)。
名称 DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知序列 5′-AACTATGCGCTCATGA－－－－－－GCAATGCGTAGCCTCT-3′ 3′-TTGATACGCGAGTACT－－－－－－CGTTACGCATCGGAGA-5′
引物 ①5′-AACTATGCGCTCATGA-3′ ②5′-GCAATGCGTAGCCTCT-3′ ③5′-AGAGGCTACGCATTGC-3′ ④5′-TCATGAGCGCATAGTT-3′
(2)对产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是________。
A．5′-AACTATGCG－－－－－－AGCCCTT-3′
B．5′-AATTCCATG－－－－－－CTGAATT-3′
C．5′-GCAATGCGT－－－－－－TCGGGAA-3′
D．5′-TTGATACGC－－－－－－CGAGTAC-3′
5．实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR简称qPCR，灵敏度高特异性好，是目前检测微小残留病变的常用方法。将标有荧光素的Taqman探针与待测样本DNA混合后，在变性、复性、延伸的热循环中，与待测样本DNA配对结合的Taqman探针被Taq酶切断，在特定光激发下发出荧光(如图所示)，随着循环次数的增加，荧光信号强度增加，通过实时检测荧光信号强度，可得Ct值(该值与待测样本中目的基因的个数呈负相关)。下列有关叙述正确的是(　　)
A．每个模板DNA分子含有2个游离的磷酸基团
B．做qPCR之前，需要先根据目的基因的核苷酸序列合成1种引物和1种Taqman探针
C．在反应过程中，需要细胞中的ATP为新链的合成提供能量
D．荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数越少，说明含有的病变的概率越小
6．“双脱氧法”基因测序
(2024·湖南，15改编)最早的双脱氧测序法是在PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP)，子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸(dATP)，继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述不正确的是(　　)
A．上述PCR反应体系中只加入一种引物
B．电泳时产物的片段越大，迁移速率越慢
C．5′-CTACCCGTGAT-3′为对照个体的一段序列
D．患者该段序列中某位点的碱基C突变为G
原理解读　(1)双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)缺乏PCR延伸所需的3′-OH，因此每当DNA链加入分子ddNTP时，延伸便终止。(2)每一次DNA测序是由4个独立的PCR反应组成的，4个PCR反应体系均加入模板、引物、dNTP、DNA聚合酶，唯一不同的是4个反应体系分别加入不同的含有标记的ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP。(3)PCR反应后，在反应体系中就形成了大量起始点相同、终止点不同的DNA片段，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出来，得到放射性同位素自显影条带，依据电泳条带读取DNA双链的碱基序列。(4)双脱氧法原理示意图：
答案精析
典例突破
一、
1．(1)引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)　(2)碱基互补配对
G、C含量高　(3)引物与模板链结合过于紧密，变性时引物不易与模板链脱离(影响变性)　引物过短导致引物的特异性下降
2．(1)①能与P基因模板链3′端的一段碱基序列互补配对的短单链核酸　5′端　②P基因编码链的第一个碱基与EcoR Ⅰ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取　在引物中的EcoR Ⅰ识别序列3′端添加1个碱基
解析　①引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，因此设计扩增P基因的引物，需要两种引物分别与两条模板链3′端的碱基序列互补。DNA聚合酶延伸时，是将脱氧核苷酸加到引物的3′端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5′端。②融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同，说明P基因翻译时出错。由图可看出，在转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变，可通过在EcoR Ⅰ识别序列3′端添加1个碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数，这样能保证P基因转录出的mRNA上的读码框不改变，能够正常翻译。
(2)D　[在第一次PCR循环结束后，得到以引物Ⅱ延长得到的单链。在以后的PCR循环中，以引物Ⅱ所形成的单链为模板在引物Ⅰ的作用下合成DNA时，引物Ⅱ上的X片段也被作为模板合成子链。因为两条引物间的片段以指数倍数扩增，实验结束得到的绝大部分DNA片段是选项中的D。]
3．5′ ATGCCGTAAGTCCTAC 3′
5′ TGATCTACGGCTTACA 3′
解析　书写引物序列，一般从引物的5′端向3′端书写，避免误判。图中位于上方的模板链5′端磷酸基团在左侧，3′端羟基在右侧，可知与上方模板链配对的引物5′端在右侧，3′端在左侧，引物序列为5′ TGATCTACGGCTTACA 3′。同理推测另外一条引物的序列。
4．(1)①2n－2n　②2n　③2　④2n－1　⑤2n＋1－2　⑥2n　(2)2
二、
A　[琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段，比如基因组DNA或质粒DNA，通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移；而对于较小的DNA片段，比如PCR产物或酶切片段，则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分辨率和分离效果，A正确；凝胶载样缓冲液中指示剂只是指示电泳进度，当指示剂前沿接近凝胶边缘时，则停止电泳，它不能指示DNA分子的具体位置，B错误；DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢，DNA迁移方向为从负极向正极，C错误；琼脂糖凝胶中的DNA分子与其中的核酸染料结合后，可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，D错误。]
三、
1．乙和丙　目的基因反向连接
解析　如图A所示，如果用引物乙和丙，若正确连接则会产生350 bp片段，反向连接则不会出现；同理，若用引物甲和丙，无论正向连接还是反向连接均会产生450 bp片段。根据图B进行分析，若采用引物甲和乙，目的基因反向连接会扩增出400 bp片段。
2．B　[引物与模板的3′端结合，由图PCR1的产物可知，PCR1所用引物应为引物A和B，A正确；由图可知，PCR1和PCR2均以原始DNA为模板，PCR3以PCR1和PCR2的产物为模板，PCR4以PCR3的产物为模板，B错误；由图可知，两条链互为模板和引物，故PCR3无需额外加入引物，C正确；PCR4的作用是大量扩增突变基因，得到大量的新的蛋白a基因，D正确。]
3．(1)2　互补配对　(2)8　6　(3)Spe Ⅰ、Sal Ⅰ　复制原点
解析　(1)分析图1可知，在第一阶段中，利用PCR技术进行第一次扩增(循环)，得到的含有引物2、引物3的产物，其DNA双链不等长，该产物继续进行第二次扩增(循环)，才能获得双链等长的DNA。第二阶段中引物2与引物3部分碱基的互补配对关系使得两DNA能成功“搭桥”连接起来。(2)图1显示：通过融合PCR技术，每一次将两个DNA片段拼接起来，需要4个引物，其中有2个起着“搭桥”作用。依此类推，若通过融合PCR技术将启动子、标记基因、目的基因、终止子拼接起来，需要设计8种引物，其中能够起着“搭桥”作用的引物有6种。(3)图2显示：启动子和终止子的两端分别有Spe Ⅰ和Sal Ⅰ的识别位点，叶绿体同源重组基因1与2之间也存在Spe Ⅰ和Sal Ⅰ的识别位点，因此图2中需使用Spe Ⅰ、Sal Ⅰ和DNA连接酶将两中间载体构建成定点整合表达载体，图中定点整合表达载体上未标出的结构是复制原点。
4．(1)②④　(2)B
解析　由于已知序列的外侧是未知序列(如图中待扩增的未知序列)，因此无法设计引物。若要分析出已知序列两侧的未知序列，设计引物是关键，可以采用反向PCR技术。反向PCR的操作步骤可以分为两步。第一步是连接成环，即用限制酶切割DNA，用DNA连接酶将其连接成环，即图中Ⅰ酶切和Ⅱ连接过程。第二步是反向扩增，即根据已知序列设计一对引物，以环状DNA两条链为模板，从已知序列向未知序列方向进行反向扩增，利用Taq DNA聚合酶无法将DNA连接成环的特点，得到链状DNA，即图中Ⅲ扩增过程。本题(1)采用反向PCR扩增未知序列，又因子链的延伸方向从5′→3′，可根据已知序列3′ AGTACTCGCGTATCAA 5′和3′ CGTTACGCATCGGAGA ′5，设计对应PCR引物是5′ TCATGAGCGCATAGTT 3′和5′ GCAATGCGTAGCCTCT 3′，本题(2)对产物测序，得到片段F的完整序列，因为片段F是被限制酶EcoR Ⅰ剪切的两端，所以5′端应该是AATTC，对应F片段的开头，故选B。
5．A　[DNA分子为反向平行的两条链，每条链都含有1个游离的磷酸基团，则一个DNA分子含有2个游离的磷酸基团，A正确；做qPCR之前，需要先根据目的基因的核苷酸序列合成1对引物和1种Taqman探针，B错误；在反应过程中，dNTP为新链的合成提供能量，C错误；若荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数越少，说明扩增次数越少，说明更多的荧光探针与目的基因进行了碱基互补配对，可推测获得的核酸产物中含有病变的概率越大，D错误。]
6．D　[利用双脱氧测序法时，PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA，故只需加入一种引物，A正确；电泳时，产物的DNA片段越大，形成的阻力越大，迁移速率越慢，B正确；根据题图可知，对照个体PCR子链的测序结果为5′ CTACCCGTGAT 3′，该序列与对照个体双链DNA分子中模板链的互补链的序列相同，患者为5′ CTACCTGTGAT 3′，对比可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T，C正确，D错误。](共80张PPT)
pcr技术与应用
争分点突破 1　
一 核心提炼
二 典例突破
一、PCR技术“引物”归类分析
1.引物的设计
(1)(2020·山东，25节选)通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出Wx基因的cDNA，原因是___________________________________________
____________________________________。
引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的
(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)
(2)(经典高考题节选)设计引物时需要避免引物之间发生_____________，而造成引物自连。同理也要避免引物之间的互补。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同且____________的引物需要设定更高的复性温度。
碱基互补配对
G、C含量高
(3)科学设计引物是PCR能否成功的关键，若引物的碱基过多或引物的G、C含量过高，会造成PCR的效率偏低，收获的目的基因较少，原因是_______________________________________________________________。
若对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果发现有两个或多个条带，从引物角度分析，原因可能是_____________________________。
引物与模板链结合过于紧密，变性时引物不易与模板链脱离(影响变性)
引物过短导致引物的特异性下降
拓展　引物与复性温度
(1)复性温度：复性温度高，扩增特异性强；复性温度低，扩增效率高。
(2)引物：①引物长度越长，越容易形成氢键，为避免出现错配，需要适当提高复性温度；
②引物GC含量越高，容易出现非特异性结合，需要适当提高复性温度。
2.引物的修饰
(1)(2022·山东，25节选)某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG－P和FLAG－PΔ。PΔ是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或PΔ的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或PΔ的功能。
①为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是____________________________________________
_____________，为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的______(填“3′端”或“5′端”)。
能与P基因模板链3′端的一段碱基序列互补配对
的短单链核酸
5′端
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，因此设计扩增P基因的引物，需要两种引物分别与两条模板链3′端的碱基序列互补。DNA聚合酶延伸时，是将脱氧核苷酸加到引物的3′端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5′端。
②PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。
据图分析，出现该问题的原因是___________________________________
_______________________________________________________________。修改扩增P基因时使用的带有EcoR Ⅰ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是__________________________________________。
P基因编码链的第一个碱基与EcoR Ⅰ识
别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取
在引物中的EcoR Ⅰ识别序列3′端添加1个碱基
融合基因转录出的mRNA
序列正确，翻译出的融合
蛋白中FLAG的氨基酸序
列正确，但P基因对应的
氨基酸序列与P不同，说
明P基因翻译时出错。由图可看出，在转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变，可通过在EcoR Ⅰ识别序列3′端添加1个碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数，这样能保证P基因转录出的mRNA上的读码框不改变，能够正常翻译。
(2)引物用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，设计了引物Ⅰ、Ⅱ，其连接部位如图所示，X为某限制酶识别序列。扩增后得到的绝大部分DNA片段是图中的
在第一次PCR循环结束后，得到以引物Ⅱ延长得到的单链。在以后的PCR循环中，以引物Ⅱ所形成的单链为模板在引物Ⅰ的作用下合成DNA时，引物Ⅱ上的X片段也被作为模板合成子链。因为两条引物间的片段以指数倍数扩增，实验结束得到的绝大部分DNA片段是选项中的D。
√
3.引物的结合方向
如图为X蛋白的部分基因序列，所示序列为引物结合的部分，据图分析：
扩增X蛋白基因所需的引物序列是_________________________________；
______________________________。
5′-ATGCCGTAAGTCCTAC-3′
5′-TGATCTACGGCTTACA-3′
书写引物序列，一般从引物的5′端向3′端书写，避免误判。图中位于上方的模板链5′端磷酸基团在左侧，3′端羟基在右侧，可知与上方模板链配对的引物5′端在右侧，3′端在左侧，引物序列为
5′-TGATCTACGGCTTACA-3′。同理推测另外一条引物的序列。
4.引物的数量计算
(1)如图：一个DNA分子n次扩增，则：
①子代DNA分子中等长链的
DNA分子数为________个；
②子代DNA分子中不等长链
的DNA分子数为_____个；
③子代DNA分子中含模板链
DNA分子数为_____个；
④子代DNA分子中含引物A(或B)的DNA分子数为________个；
⑤复制过程中共需引物________个；
⑥第n次复制需要引物______个。
2n－2n
2n
2
2n－1
2n＋1－2
2n
(2)已知引物1及引物2之间的序列为目的序列，若引物与DNA的结合位点如图所示，在第_____轮循环产物中开始出现两条单链等长的目的片段。
2
二、PCR产物鉴定——琼脂糖凝胶电泳
(2024·黑吉辽，7)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是
A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C.在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快
D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
√
琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段，比如基因组DNA或质粒DNA，通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移；而对于较小的DNA片段，比如PCR产物或酶切片段，则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分辨率和分离效果，A正确；
凝胶载样缓冲液中指示剂只是指示电泳进度，当指示剂前沿接近凝胶边缘时，则停止电泳，它不能指示DNA分子的具体位置，B错误；
DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢，DNA迁移方向为从负极向正极，C错误；
琼脂糖凝胶中的DNA分子与其中的核酸染料结合后，可在波长为
300 nm的紫外灯下被检测出来，D错误。
应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是_______
___________。
为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图中A所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相
三、常用PCR技术及原理
1.利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式
目的基
乙和丙
因反向连接
如图A所示，如果用引物乙和丙，若正确连接则会产生350 bp片段，反向连接则不会出现；同理，若用引物甲和丙，无论正向连接还
是反向连接均会产生450 bp片段。根据图B进行分析，若采用引物甲和乙，目的基因反向连接会扩增出400 bp片段。
2.利用重叠延伸PCR技术引导基因定点突变
如图为利用重叠延伸PCR的方法在蛋白a基因中部引入定点突变(A/T碱基对变为G/C)的过程。该过程需设计四种引物，其中引物A、D与蛋白a基因的两端完全配对，引物B、C虽与蛋白a基因中部配对，但在欲引入突变的位置替换为突变后的碱基。通过多次独立的PCR达到目的。
下列说法不正确的是
A.PCR1所用引物应为引物A和B
B.PCR2至PCR4依次以PCR1至PCR3的产物为模板
C.PCR3无需额外加入引物
D.PCR4的作用是大量扩增突变基因
√
引物与模板的3′端结合，由图PCR1的产物可知，PCR1所用引物应为引物A和B，A正确；
由图可知，PCR1和PCR2均以原始DNA为模板，PCR3以PCR1和PCR2的产物为模板，PCR4以PCR3的产物为模板，B错误；
由图可知，两条链互为模板和引物，故PCR3无需额外加入引物，C正确；
PCR4的作用是大量扩增突变基因，得到大量的新的蛋白a基因，D正确。
3.利用重叠延伸PCR技术构造融合基因
融合PCR技术是采用具有互补末端的引物，将不同来源的扩增片段连接起来的方法，其过程如图1所示。图2是中间载体1和中间载体2(利用融合PCR技术构建成)构建成叶绿体定点整
合表达载体示意图(限制酶酶切位点标注于载体外侧)，叶绿体定点整合表达载体通过与叶绿体基因的同源重组，将目的基因整合于叶绿体DNA上的特定位点上。请据图回答下列问题：
(1)图1第一阶段中PCR至少进行______次循环，才能获得双链等长的DNA，第二阶段中引物2与引物3部分碱基的____________关系使得两DNA能成功“搭桥”连接起来。
2
互补配对
分析图1可知，在第一阶段中，利用PCR技术进行第一次扩增(循环)，得到的含有引物2、引物3的产物，其DNA双链不等长，该产物继续进行第二次扩增(循环)，才能获得双链等长的DNA。第二阶段中引物2与引物3部分碱基的互补配对关系使得两DNA能成功“搭桥”连接起来。
(2)若通过融合PCR技术将启动子、标记基因、目的基因、终止子拼接起来，需要设计_____种引物，其中能够起着“搭桥”作用的引物有____种。
8
6
图1显示：通过融合PCR技术，每一次将两个DNA片段拼接起来，需要4个引物，其中有2个起着“搭桥”作用。依此类推，若通过融合PCR技术将启动子、标记基因、目的基因、终止子拼接起来，需要设计8种引物，其中能够起着“搭桥”作用的引物有6种。
(3)图2中需使用______________(填限制酶)和DNA连接酶将两中间载体构建成定点整合表达载体，途中定点整合表达载体上未标出的结构是__________。
Spe Ⅰ、Sal Ⅰ
复制原点
图2显示：启动子和终止子的两端分别有Spe Ⅰ和Sal Ⅰ的识别位点，叶绿体同源重组基因1与2之间也存在Spe Ⅰ和Sal Ⅰ的识别位点，因此图2中需使用Spe Ⅰ、Sal Ⅰ和DNA连接酶将两中间载体构建成定点整合表达载体，图中定点整合表达载体上未标出的结构是复制原点。
4.利用反向PCR技术扩增未知基因序列
如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcoR Ⅰ酶切为例)。
请据图回答问题：
(1)如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的引物必须是________(从表格引物①②③④中选择，填编号)。
名称 DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知序列 5′-AACTATGCGCTCATGA－－－－－－GCAATGCGTAGCCTCT-3′
3′-TTGATACGCGAGTACT－－－－－－CGTTACGCATCGGAGA-5′
引物 ①5′-AACTATGCGCTCATGA-3′
②5′-GCAATGCGTAGCCTCT-3′
③5′-AGAGGCTACGCATTGC-3′
④5′-TCATGAGCGCATAGTT-3′
②④
由于已知序列的外侧是未知序列(如图中待扩增的未知序列)，因此无法设计引物。若要分析出已知序列两侧的未知序列，设计引物是关键，可以采用反向PCR技术。反向PCR的操作步骤可以分为两步。第一步是连接成环，即用限制酶切割DNA，用DNA连接酶将其连接成环，即图中Ⅰ酶切和Ⅱ连接过程。
第二步是反向扩增，即根据已知序列设计一对引物，以环状DNA两条链为模板，从已知序列向未知序列方向进行反向扩增，利用Taq DNA聚合酶无法将DNA连接成环的特点，得到链状DNA，即图中Ⅲ扩增过程。采用反向PCR扩增未知序列，又因子链的延伸方向从5′→3′，可根据已知序列3′-AGTACTCGCGTATCAA-5′和
3′-CGTTACGCATCGGAGA-′5，设计
对应PCR引物是5′-TCATGAGCGCATAGTT-3′和5′-GCAATGCGTAGCCTCT-3′，
(2)对产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是______。
A.5′-AACTATGCG－－－－－－AGCCCTT-3′
B.5′-AATTCCATG－－－－－－CTGAATT-3′
C.5′-GCAATGCGT－－－－－－TCGGGAA-3′
D.5′-TTGATACGC－－－－－－CGAGTAC-3′
B
对产物测序，得到片段F的完整序列，因为片段F是被限制酶EcoR Ⅰ剪切的两端，所以5′端应该是AATTC，对应F片段的开头，故选B。
5.实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR简称qPCR，灵敏度高特异性好，是目前检测微小残留病变的常用方法。将标有荧光素的Taqman探针与待测样本DNA混合后，在变性、复性、延伸的热循环中，与待测样本DNA配对结合的Taqman探针被Taq酶切断，在特定光激发下发出荧光(如图所示)，随着循环次数的增加，荧光信号强度增加，通过实时检测荧光信号强度，可得Ct值(该值与待测样本中目的基因的个数呈负相关)。
下列有关叙述正确的是
A.每个模板DNA分子含有2个游离的磷酸
基团
B.做qPCR之前，需要先根据目的基因的
核苷酸序列合成1种引物和1种Taqman
探针
C.在反应过程中，需要细胞中的ATP为新
链的合成提供能量
D.荧光信号达到设定的阈值时，经历的循
环数越少，说明含有的病变的概率越小
√
DNA分子为反向平行的两条链，每条链都含有1个游离的磷酸基团，则一个DNA分子含有2个游离的磷酸基团，A正确；
做qPCR之前，需要先根据目的基因的核苷酸序列合成1对引物和1种Taqman探针，B错误；
在反应过程中，dNTP为新链的合成提供能量，C错误；
若荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数越少，说明扩增次数越少，说明更多的荧光探针与目的基因进行了碱基互补配对，可推测获得的核酸产物中含有病变的概率越大，D错误。
6.“双脱氧法”基因测序
(2024·湖南，15改编)最早的双脱氧测序法是在PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP)，子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸(dATP)，继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述不正确的是
A.上述PCR反应体系中只加入一种引物
B.电泳时产物的片段越大，迁移速率越慢
C.5′-CTACCCGTGAT-3′为对照个体的
一段序列
D.患者该段序列中某位点的碱基C突变为G
√
利用双脱氧测序法时，PCR反
应体系中加入的模板是待测的
单链DNA，故只需加入一种引
物，A正确；
电泳时，产物的DNA片段越大，形成的阻力越大，迁移速率越慢，B正确；
根据题图可知，对照个体PCR子链的测序结果为5′-CTACCCGTGAT-3′，该序列与对照个体双链DNA分子中模板链的互补链的序列相同，患者为5′-CTACCTGTGAT-3′，对比可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T，C正确，D错误。
(1)双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)缺乏PCR延伸所需的3′-OH，因此每当DNA链加入分子ddNTP时，延伸便终止。(2)每一次DNA测序是由4个独立的PCR反应组成的，4个PCR反应体系均加入模板、引物、dNTP、DNA聚合酶，唯一不同的是4个反应体系分别加入不同的含有标记的ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP。(3)PCR反应后，在反应体系中就形成了大量起始点相同、终止点不同的DNA片段，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出来，得到放射性同位素自显影条带，依据电泳条带读取DNA双链的碱基序列。
(4)双脱氧法原理示意图：
三 专题强化练
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答案
对一对
题号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
答案 D B A D C D D D D C
题号 11
答案 (1)PCR扩增时未在引物上将S基因编码终止密码子的TGA删除，导致融合基因翻译提前终止，未表达出HA的氨基酸序列　HA编码序列的第一个碱基与HA编码序列前的载体的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致HA的mRNA的密码子被错误读取　(2)R蛋白对S蛋白和N蛋白去磷酸化　SPD可促进R蛋白的表达　(3)一方面，SPD通过促进R蛋白表达，对N蛋白去磷酸化后间接降低S蛋白的磷酸化水平，从而抑制癌细胞增殖；另一方面，SPD通过促进R蛋白表达对S蛋白去磷酸化，直接降低S蛋白的磷酸化水平，从而抑制癌细胞增殖
1.(2024·盐城高三模拟)PCR引物的3′端有结合模板DNA的关键碱基，5′端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列。下列相关叙述错误的是

A.图中两条子链合成一定都是从5′端向3′端延伸
B.图示表示复性阶段，该过程的温度与引物的长短有关
C.用图示引物扩增5次后，可以产生22个目标产物
D.PCR每次循环都消耗引物和原料，在实验过程中需要及时补充
√
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答案
Taq DNA聚合酶只能从引物的3′端
开始延伸DNA子链，所以两条子链
合成一定都是从5′端向3′端延伸，A正确；
图示表示复性阶段，该过程的温度与引物的长短、碱基组成等有关，引物长度越长或者GC碱基含量越高，则复性的温度设置越高，B正确；
经过5次循环后会产生25＝32(个)DNA，其中双链不等长的DNA有2×5＝10(个)，因此扩增5次后可以产生32－10＝22(个)目标产物，C正确；
PCR所需要的引物和原料是一次性添加的，在实验过程中不需要补充，D错误。
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答案
2.(2020·北京，12)为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中(如图)。
为检测获得的转基因杨树苗
中是否含有导入的HMA3基
因，同时避免内源HMA3基
因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是
A.①＋③ B.①＋②
C.③＋② D.③＋④
√
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答案
若要检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，需要检测是否含有高效启动子序列和HMA3基因序列，应选择的引物组合是①＋②，B符合题意。
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答案
3.(2024·盐城高三模拟)关于DNA片段的扩增及电泳鉴定的实验，下列相关叙述错误的是
A.PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水和移液器等在使用前都
必须进行高压灭菌处理
B.根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，加热到
熔化，稍冷却后加入核酸染料混匀
C.电泳鉴定PCR产物时加样缓冲液中的指示剂可提示终止时刻
D.－20 ℃储存的小份缓冲液和酶，使用前从冰箱拿出，需要缓慢融化
√
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答案
PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前都必须进行高压灭菌处理，移液器不需要进行高压灭菌处理，A错误；
电泳鉴定PCR产物时加样缓冲液中的指示剂溴酚蓝迁移速度较快，可提示电泳的终止时刻，C正确；
PCR所用缓冲液和酶从冰箱拿出之后，应放在冰块上缓慢融化，这样才能不破坏缓冲液中稳定性较差的成分，同样保护酶的活性不被破坏，D正确。
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答案
4.(2024·太原高三模拟)为检测乳糖酶基因是否导入大肠杆菌，研究人员从受体细胞提取质粒进行PCR扩增，并进行电泳鉴定，结果观察到的DNA条带不止一条。下列有关叙述错误的是
A.DNA分子带正电还是负电与电泳缓冲液的pH有关
B.出现多条DNA条带可能是扩增时设计的引物过短
C.出现多条DNA条带可能是扩增时模板DNA被污染
D.DNA分子的电泳迁移速率与其大小成正比
√
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答案
DNA分子带正电还是负电与电泳缓冲液的pH有关，电泳缓冲液的pH大于DNA的等电点时，DNA带负电；电泳缓冲液的pH小于DNA的等电点时，DNA带正电，A正确；
扩增时设计的引物过短会导致引物的特异性下降，致使反应结果中出现大量非特异性结合条带，电泳出现多条DNA条带，B正确；
双链DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移速率与其大小成反比，较大的分子通过凝胶孔的效率低于较小的分子，因此分子越大，迁移速率越慢，D错误。
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答案
5.以DNA复制为基础的双脱氧链终止法是最早的基因测序方法，在反应体系中需加入ddNTP(有ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP 4种，图1)和dNTP(有dATP、dGTP、dCTP、dTTP 4种，图2)。当以3′－CCATGCAC－5′为模板测定链中碱基A的位置时，子链复制延伸到第三位碱基A时，若与其配对的原料是ddTTP，则子链延伸终止；若与其配对的原料是dTTP，则子链继续延伸；直到第七位的碱基A时，又会出现以上两种配对的可能，这样就能在一个体系中得出多种长度的子链，再依此类推，可以知道模板链上的其他碱基的位置。图3是以该技术的测序原理得到某DNA的电泳图谱。
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答案
下列说法不正确的是
A.每个反应体系中应加入相同的模板链、一种
ddNTP和四种dNTP
B.ddNTP和dNTP都可脱去两分子磷酸为反应体
系提供能量和原料
C.由图3可知复制出的DNA子链的碱基序列是
5′—ATCGCATCAT－3′
D.ddNTP的脱氧核糖3′上脱氧导致其无法连接
下一个核苷酸5′上的磷酸基团
√
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答案
双脱氧链终止法是在相同的模板DNA链中分别加入一种ddNTP和四种dNTP的反应体系中进行，由于模板链相同，复制时DNA子链在进行碱基互补配对到T时，用到了对应的ddATP、dATP，若随机配对上的是ddATP，则该链复制停止，若随机配对上的是dATP，则复制继续进行，直到下一个对应的碱基T又会重新出现上述配对的可能，这样在一个体系中就会因碱基T的配对而出现多条长短不同的DNA链；
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答案
依此类推，分别可以测出模板链碱基是A、C、G每个体系下的短链，再进行凝胶电泳分离，最短的链跑得最快，最早合成，而子链的复制是从5′→3′的方向，所以由图3可以读出子链碱基序列从上到下为
3′－ATCGCATCAT－5′，总共需要四个体系，分别测出四个碱基的顺序，A正确，C错误；
ddNTP和dNTP同时带有特殊的化学键，且脱去两分子磷酸后可以为DNA复制提供原料，B正确；
由图1和图2可知，ddNTP和dNTP的区别在于五碳糖的3号位是否脱氧，ddNTP 3号位为－H，无法与下一个脱氧核苷酸的磷酸基团连接，D正确。
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答案
6.常见PCR只能扩增两引物之间的DNA序列，要扩增已知DNA序列两侧的未知DNA序列，可用反向PCR技术。反向PCR技术扩增的原理如图所示。下列叙述错误的是
A.酶切阶段，L中不能含有酶切
时所选限制酶的识别序列
B.环化阶段，可选用E.coli DNA
连接酶或T4 DNA连接酶
C.图中引物，应选择引物1和引物4，且二者间不能互补配对
D.PCR扩增，将温度调至72 ℃的目的是使引物与模板链结合
√
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答案
在酶切阶段，已知序列L中不能含
有酶切时所选限制酶的识别序列，
不然会将已知序列L切断，造成序
列识别混乱，A正确；
T4 DNA连接酶或E.coli DNA连接酶都可以用来连接黏性末端，因此环化阶段，可选用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶，B正确；
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答案
PCR过程需要两种引物，能分别
与目的基因两条链的3′端通过
碱基互补配对结合，为保证延伸
的是已知序列两侧的未知序列，
应选择引物1和引物4，且二者间不能互补配对，C正确；
PCR扩增中，将温度调至72 ℃的目的是耐高温的DNA聚合酶将4种脱氧核苷酸根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，D错误。
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答案
7.巢式PCR是指先后用外引物和内引物扩增目的基因的方法。其原理为先以比目的基因大的DNA片段为模板，用外引物(F1、R1)进行扩增，获得大量含目的基因的中间产物，再以扩增后的中间产物为
模板，用内引物(F2、R2)扩增目的基因，如图
所示。下列说法错误的是
A.两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链
DNA片段
B.第二轮PCR反应能否进行，是对第一轮PCR反应正确性的鉴定
C.由于和两套引物都互补的靶序列较少，该技术可大大提高扩增的特异性
D.如果两套引物一起加入反应体系中，外引物的复性温度应显著低于内引物
√
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答案
两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链DNA片段，以便与模板链互补配对，A正确；
第二轮PCR使内引物以第一轮PCR产物为模板进行再次扩增，第二轮PCR反应
能否进行，是对第一轮PCR反应正确性的鉴定，B正确；
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答案
由于和两套引物互补的靶序列较少，该技术可大大提高扩增的特异性，将需要的目的基因扩增出来，C正确；
如果两套引物一起加入反应体系中，外引物复性温度要明显高于内引物，使外引物先进行反应，D错误。
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答案
8.乳酸菌是乳酸的传统生产菌，但耐酸能力较差，影响产量；酿酒酵母耐酸能力较强，但不产乳酸。研究者将乳酸菌内催化乳酸生成的乳酸脱氢酶基因(LDH)导入酿酒酵母，获得能产生乳酸的酵母工程菌株。图示为通过双酶切构建重组质粒的过程。GTG为原核生物偏好的起始密码子编码序列，ATG
为真核生物偏好的起始密码子编码序列。下
列说法正确的是
A.引物2的3′端序列应包含Xba Ⅰ的识别序列
B.重组质粒以能合成尿嘧啶的酵母菌株为受体
C.PCR反应时，缓冲液中一般要添加Ca2＋来激
活相关酶
D.引物1的5′端序列应考虑将GTG改为ATG
√
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答案
根据题意可知，含GTG的一端为LDH基因的起始端，为保证通过双酶切以正确方向插入质粒，设计引物1的5′端序列需要包含BamH Ⅰ的识别序列，引物2的5′端序列应包含Xba Ⅰ的识别序列，A错误；
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答案
结合题意可知，质粒上有作为标记基因的尿嘧啶合成酶基因，所以本过程中重组质粒以不能合成尿嘧啶的酵母菌株为受体，然后在缺乏尿嘧啶的选择培养基上培养，不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株不能生存，导入重组质
粒的酿酒酵母菌株因为获得了尿嘧啶合成酶基因可以正常生存，从而起到筛选作用，B错误；
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答案
真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活，因此，PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2＋，C错误；
设计引物1的5′端序列，应考虑将编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，以便目的基因在酵母细胞中更好地表达，D正确。
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答案
9.(2024·唐山高三模拟)荧光定量PCR是一种定量计算待测样品的初始模板量的方法。在PCR反应体系中加入特异性的荧光探针，荧光探针可以掺入新合成的DNA链中，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，通过对扩增反应中的荧光强度进行实时检测，最后通过标准曲线定量计算初始模板量。如图为某荧光定量PCR的标准曲线。下列说法错误的是
A.一定范围内，荧光强度与扩增出的DNA量呈
正相关
B.每个反应管内荧光探针的量相同
C.样品甲的初始模板量大于样品乙
D.荧光强度不再变化时PCR反应停止
√
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答案
在PCR反应体系中加入特异性的荧光探针，荧光探针可以掺入新合成的DNA链中，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，因此一定范围内，荧光强度与扩增出的DNA量呈正相关，A正确；
最终各反应管的荧光强度一样，说明每
个反应管内添加的荧光探针的量相同，B正确；
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答案
PCR扩增时，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，因此DNA数量越多，荧光强度越大，样品甲达到最大荧光强度所用的时间短于乙，因此样品甲的初始模板量大于样品乙，C正确；
荧光强度不再变化可能是因为荧光探针
或原料等消耗尽，若为前者，此后PCR反应仍在进行，D错误。
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答案
10.(2024·漳州高三一模)基因定点突变的目的是通过定向改变基因内一个或少数几个碱基来改变多肽链上一个或几个氨基酸。大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR反应即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作为第二轮PCR
扩增的大引物，过程如图所示。下列叙述错误的是
A.第一轮PCR过程中复性所用的温度应低于第二轮PCR复
性的温度
B.PCR扩增的定点诱变产物需具备启动子、终止子等结构
才能进行转录和翻译
C.第一轮PCR的产物的两条DNA链作为第二轮PCR所用的
引物
D.将某蛋白质的第21位组氨酸(CAC)改造成酪氨酸(UAC)，属于蛋白质工程
√
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答案
为了使两轮PCR反应在同一支试管中进行，引物设计时应考虑不同的复性温度，第一轮PCR过程中复性所用的温度应低于第二轮PCR复性的温度，A正确；
若要使目的基因可以表达出蛋白质，则产物需具备启动子和终止子，诱导基因转录和翻译，B正确；
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答案
除了第一轮产物作为第二轮PCR扩增的大引物外，第二轮PCR仍需加入另一种侧翼引物，以便进行另一条链的延伸，C错误；
将某蛋白质的第21位组氨酸(CAC)改造成酪氨酸(UAC)，应使诱变引物中包含ATG或TAC序列，该过程属于蛋白质工程技术范畴，D正确。
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答案
11.TGF－β信号通路可通过S蛋白去磷酸化抑制癌细胞增殖，该过程中N蛋白磷酸化后被激活，可使S蛋白发生磷酸化。药物SPD可通过影响R蛋白来增强细胞对TGF－β信号通路的响应。为探索药物SPD治疗癌症的机理，需构建基因表达载体以获得融合蛋白S－HA、N－HA和R－HA。HA是一种短肽，连接在S、N或R蛋白的羧基端(不影响S、N或R的功能)，细胞中只有带HA标签的融合蛋白能与介质上的HA抗体结合，从而分离得到HA标签融合蛋白。
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答案
(1)用于PCR扩增S基因的引物5′端分别加入了限制酶Nhe Ⅰ和Hind Ⅲ的识别序列，将扩增后的S基因插入载体上，构建含S－HA融合基因的表达载体，如图1所示，其中“TACCCAT”是HA编码链的起始序列。将重组载体导入细胞后，表达的蛋白有S蛋白的氨基酸序列但没有HA的氨基酸序列，据图1分析，出现该问题的原因是____________________________
___________________________
___________________________
_________________________。
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答案
PCR扩增时未在引物上将S基因
编码终止密码子的TGA删除，导致融合基因翻译提前终止，未表达出HA的氨基酸序列
该问题解决后将重组载体再次导入细胞，表达出了融合蛋白，但却不是所需的融合蛋白，据图1分析，可能的原因是________________________
________________________________________________________________________________________。
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答案
与HA编码序列前的载体的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致HA的mRNA的密码子被错误读取
HA编码序列的第一个碱基
由图1可知，S基因的TGA没有对应
的氨基酸，说明其编码的是终止密
码子，将重组载体导入细胞后，表
达的蛋白有S蛋白的氨基酸序列但
没有HA的氨基酸序列，原因是PCR
扩增时未在引物上将S基因编码终止密码子的TGA删除，导致融合基因翻译提前终止，未表达出HA的氨基酸序列。由于HA编码链的起始序列是“TACCCAT”，由图可知，HA编码序列的第一个碱基与HA编码序列前的载体的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致HA的mRNA的密码子被错误读取，所以会出现表达出了融合蛋白，却不是所需的融合蛋白的现象。
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答案
(2)融合蛋白表达成功并分离得到R－HA和磷酸化的S－HA、N－HA。将三种融合蛋白按照图2所示的组合方式分别在缓冲液中进行反应，检测S－HA和N－HA的磷酸化水平，结果如图2所示，推测R蛋白的作用是________________
_______________。向细胞培养液中加入不同浓度SPD处理相同时间，通过电泳检测细胞中R蛋白水平，结果如图3所示，推测SPD对R蛋白的影响是_______________________。
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答案
R蛋白对S蛋白和
N蛋白去磷酸化
SPD可促进R蛋白的表达
由①与②、③与④的检测结果对比可知，②组加入R－HA后p－S－HA的含量比①少，④组加入R－HA后p－N－HA的含量比③少，由此推测R蛋白对S蛋白和N蛋白有去磷酸化的作用。由图2可知，随着SPD浓度的增加，R蛋白的条带越宽，说明SPD可促进R蛋白的表达。
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答案
(3)据以上结果推测，药物SPD治疗癌症的机理是_____________________
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答案
R蛋白表达，对N蛋白去磷酸化后间接降低S蛋白的磷酸化水平，从而抑制癌细胞增殖；另一方面，SPD通过促进R蛋白表达对S蛋白去磷酸化，直接降低S蛋白的磷酸化水平，从而抑制癌细胞增殖
一方面，SPD通过促进　基因工程
1．限制酶的选择技巧
(1)根据目的基因两端的限制酶切点选择限制酶
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择限制酶SmaⅠ。
②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也能被切出相同的黏性末端，如图乙)。
(2)根据质粒的特点选择限制酶(如图)
(3)根据Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶。图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(假设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)。
2．基因表达载体的构建过程(如图)
3．Cre/LoxP重组酶系统
(1)Cre重组酶：由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码，具有限制酶特性，能够特异性识别LoxP位点。能介导两个LoxP位点之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。
(2)LoxP序列：来源于P1噬菌体，包括两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的间隔区域，反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了LoxP位点的方向。
(3)①同向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列，仅保留一个LoxP。
②反向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位。
4．CRISPR/Cas9基因编辑
CRISPR/Cas9系统是细菌体内的用来对抗侵略细菌的外源DNA或噬菌体的基因编辑系统。CRISPR是成簇的、规律间隔的、短回文重复DNA序列。Cas9蛋白是一种RNA引导的DNA内切核酸酶，当细菌受到噬菌体的侵染时，噬菌体的某段DNA序列被Cas9内切酶剪切后整合到CRISPR的间隔序列区域，当相同种类的噬菌体再次侵染细菌时，转录的crRNA可以引导Cas9蛋白找到并切断噬菌体(形成平末端)释放到细菌体内的DNA，从而阻止噬菌体在细菌体内繁殖。其作用机制大体可以分为三个步骤：(1)内切酶(Cas9酶)切割噬菌体获取新的间隔序列；(2)将其引入原间隔序列并转录出crRNA；(3)crRNA和Cas9蛋白形成复合物精准切割与新间隔序列相同的基因。具体过程如图所示。
5．In－Fusion技术
In－Fusion技术即无缝克隆和组装技术，是一种新型的、快速、简洁的克隆方法，可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA片段的插入。具体原理：在载体末端和目的基因两端应具有15～25个同源碱基，而目的基因两端的同源序列往往是通过引物设计实现的，In－Fusion酶能够识别具有相同末端序列的线性DNA分子并使其形成黏性末端，DNA连接酶再将两条DNA单链黏合起来。
(1)质粒构建过程：①采用酶切或者PCR扩增方法将载体线性化；②使用设计好的引物进行目的DNA片段的PCR扩增；③反应体系内形成重组质粒。
(2)与传统酶切、酶连相比的优势：①位点选择灵活，在载体任意位置进行基因克隆；②快速简便；③克隆效率高，阳性克隆高达90%以上；④可同时克隆两个或多个DNA片段。
易错辨析
判断下列关于基因表达载体构建的叙述
(1)基因表达载体上的启动子是DNA聚合酶识别和结合的部位，而终止子是使翻译过程在需要的地方停下来(　　)
(2)基因表达载体具有多个限制酶切点，有助于目的基因的表达，而复制原点的作用是保证标记基因在宿主细胞中复制并稳定保存(　　)
(3)在果实中表达acs(乙烯合成关键酶基因)的反义基因可延迟果实成熟(　　)
(4)利用蛋白质工程技术在腈水合酶(N0)的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)，加入连接肽需要通过改造基因实现(　　)
(5)“DNA粗提取与鉴定”实验中，在DNA溶液中加入二苯胺试剂后即呈现蓝色(　　)
(6)“DNA的粗提取与鉴定”实验中，离心研磨液是为了加速DNA的沉淀(　　)
(7)粗提取DNA时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，向过滤后所得滤液中加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物(　　)
1．(2024·全国甲，38节选)质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，与用酶a单酶切相比，用酶a和酶b双酶切的优点体现在________________________________________________________________________
____________________________________________________________(答出两点即可)；
使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是________。
2．(2023·全国乙，38节选)GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因(均为突变基因)构建表达载体，其模式图如图所示(箭头为GFP突变基因的转录方向)。图中①为________；②为________，其作用是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________；
图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
3．(2022·福建，13节选)载体和CD14片段的酶切位点及相应的酶切抗性基因序列如图所示。用XhoⅠ和SalⅠ分别酶切CD14和图中载体连接，CD14接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA。可进一步用这两种限制酶对CD14的连接方向进行鉴定，理由是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
4．(2024·新课标，35节选)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5′→3′方向。回答下列问题：
(1)限制酶切割的化学键是__________。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G－C和________________________________________________________________________。
5．(2024·湖南，21节选)百合具有观赏、食用和药用等多种价值，科研人员对其进行了多种育种技术研究。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L，该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图，其中基因gus编码GUS酶，GUS酶活性可反映启动子活性。
(1)研究病原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取pL，首先选用________酶切，将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接，再导入烟草。随机选取3组转基因成功的烟草(P1、P2和P3)进行病原微生物胁迫，结果如图c。由此可知：三种病原微生物都能诱导pL的活性增强，其中______________的诱导作用最强。
(2)现发现栽培种百合B中也有L，但其上游的启动子与野生百合不同，且抗病性弱。若要提高该百合中L的表达量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，简要写出实验思路：________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
6．(2023·海南，20节选)我国开发了一种新型基因递送系统(切—浸—生芽，简称CDB法)。图1与图2分别是利用常规转化法和CDB法在某植物中递送基因的示意图。则：
(1)图1与图2中，农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)已知某酶(PDS)缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体(含有绿色荧光蛋白标记基因)，利用图2中的CDB法将该重组载体导入植株B，长出毛状根，成功获得转化植株B。据此分析，从毛状根中获得阳性毛状根段的方法是________________________，图2中，鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是________________________________________________________________________，依据是________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________。
1．研究人员将靛蓝色素酶基因(IDG)与启动子PTL12(棉纤维细胞特异启动子)相连以构建基因表达载体(如图，KpnⅠ、HindⅢ、BamH Ⅰ、PstⅠ代表不同限制酶，图中质粒上酶的位置为其对应的酶切位点)，并最终培育出能在棉纤维细胞中表达靛蓝色素酶的彩色棉新品种。本研究中将IDG与启动子PTL12结合的主要目的是
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
过程①②都使用KpnⅠ切割质粒，目的是____________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
2．(2024·天津宁河区高三一模)蓝细菌中的ictB蛋白能高效转运和浓缩CO2，从而提高细胞光合速率。我国科学家构建了叶片特异性启动子Cab(叶绿体捕光色素蛋白Cab基因启动子)驱动的蓝细菌ictB基因表达载体，并通过农杆菌转化法获得了转ictB基因水稻，大大提高了水稻的产量。在ictB基因表达载体的构建中，含Cab启动子和ictB基因的重组DNA分子和Ti质粒的酶切位点如图1所示。请回答下列问题：
(1)为使重组DNA分子能定向插入T－DNA中，可用PCR的方法在重组DNA分子两端添加限制酶识别序列，据图可知，M端添加的序列所对应的限制酶是________，N端添加的序列所对应的限制酶是________。添加了限制酶识别序列的重组DNA分子与Ti质粒的重组过程共需要______种酶。
(2)将农杆菌液浸泡过的水稻愈伤组织进行植物组织培养，培养基中需加入____________进行筛选，最终获得多个水稻株系a1、a2、a3、a4。对a1～a4四个水稻株系的ictB蛋白表达量进行测定，结果如图2，其中a4株系ictB蛋白表达量较低的原因可能是_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________。
检测应选用的植物器官是______，原因是_____________________________________________
_______________________________________________________________________________。
3．随着土壤盐渍化(主要是Na＋引起)不断加剧，提高耐盐性已成为研究和改良作物的重要方向。从高盐环境中吸收K＋可维持细胞内K＋/Na＋稳态，从而提高植物的耐盐性。H是细胞膜上的一种K＋转运蛋白，B蛋白可以增强H的功能。为探究作用机理，研究人员构建了两个分别含有CFP－B和YFP－H融合基因的表达载体。CFP和YFP分别是青色荧光蛋白基因和黄色荧光蛋白基因。为了获得含CFP－B的表达载体，选择了已经包含CFP的载体p1300－CFP。相关信息如图所示。请回答下列问题：
(1)为将B基因连入CFP基因，需使用两端带有酶切位点序列的引物扩增B基因，优先选择的酶切位点是________________，理由是_________________________________________
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________。
(2)据此，研究人员使用的两条引物序列分别为5′－XXXXXXNNATGGCCGGC－3′和5′－YYYYYYCTACTCAGA－3′。X和Y分别代表(1)选择的酶切位点，N代表任意碱基的核苷酸。第一条引物中NN的作用是______________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________。
第二条引物与图中B基因末端序列不相同的原因是____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________。
用同样的方法获得了含YFP－H融合基因的表达载体。
4．通过体内同源重组可以进行靶向基因敲除，原理如图1所示。同源重组技术结合tetr－sacB双重选择系统可对基因进行敲除与回补，研究基因的功能。图2是科研人员利用该方法对大肠杆菌LacZ基因进行敲除与回补的相关过程，其中tetr是四环素抗性基因，sacB基因是蔗糖致死基因，LacZ基因表达产物能将无色化合物X－gal水解成蓝色化合物。回答下列问题：
限制酶 EcoR Ⅰ BamH Ⅰ Hind Ⅲ Xma Ⅰ
识别序列和切割位点 ↓ 5′—GA ATTC—3′ ↓ 5′—GG ATCC—3′ ↓ 5′—AA GCTT—3′ ↓ 5′—CC CGGG—3′
(1)据图1分析，与传统转基因技术相比，体内同源重组具有的特点是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)图2过程①中，设计两种引物时需在引物5′端分别添加________、________限制酶的识别序列；过程⑤中，设计两种引物时需在引物5′端分别添加________基因两端的同源序列。
(3)图2过程⑦中，在含有____________的培养基中出现了白色菌落，即为筛选出的敲除LacZ基因菌株。过程⑧通过同源重组技术结合tetr－sacB双重选择系统可对LacZ基因进行回补，筛选LacZ基因回补菌株时应在培养基中添加____________。
5．PMP22基因在人基因组中有多个拷贝，表达产生的PMP22蛋白在人髓鞘细胞中不可或缺，但PMP22蛋白过量可引发腓骨肌萎缩症(CMT1A)，科研人员希望利用CRISPR/Cas9基因编辑系统治疗CMT1A。回答下列问题：
(1)CRISPR/Cas9基因编辑系统原理如图1所示，Cas9蛋白可切割特定部位的DNA双链，造成DNA损伤，一次切割过程中会产生______个游离的磷酸基团。机体修复DNA损伤时，可能会改变碱基序列。图中gRNA的作用是___________________________________。
(2)科研人员本来的基因编辑方案是将gRNA结合位点设计在PMP22基因内部，后改为如图2所示的方案，该方案比起原方案的优点是___________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)科研人员希望在人髓鞘细胞中表达CRISPR/Cas9基因编辑系统，构建的基因表达载体如图3所示。
①在对gRNA对应的DNA片段进行PCR扩增时，需要在上游和下游引物的5′端分别添加碱基序列________________和________________，保证DNA片段定向插入。
②基因表达载体上，除了图示序列和标记基因外，还需要的序列是________。
6．(2024·青岛高三二模)某种雄性不育水稻是由野生型水稻的核基因M突变为m所致，科研团队构建转基因智能不育系的思路是将育性恢复基因OsNP1(在原始生殖细胞中表达)、花粉失活基因ZM－AA(在花粉中表达)两个基因一起构建重组Ti质粒。然后通过农杆菌转化法将目的基因导入愈伤组织细胞，从转基因后代中筛选m位点是纯合但两个转基因位点是杂合的可育植株。
(1)图1为已导入ZM－AA基因的重组Ti质粒，图2为OsNP1基因和相应的酶切位点，其中A链为转录模板链。为使OsNP1基因与图1中Ti质粒正确连接来构建基因表达载体，应选择的酶有______________________________；采用PCR技术扩增图2中的OsNP1基因时，会出现长、中、短三种长度的单链，一个OsNP1基因在第n次循环中新合成的短链数为________。
(2)重组Ti质粒中的新霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因的具体作用分别是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________、
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)若使两个基因分别在不同的细胞中表达，需将两个基因分别与____________________________________________________________________________
__________________________________________________________________重组在一起。
答案精析
核心提炼
易错辨析
(1)×　基因表达载体上的启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，用于驱动基因的转录；终止子使转录过程在所需要的地方停下来。
(2)×　载体具有多个限制酶切点，以便构建基因表达载体；复制原点可以保证重组DNA分子在受体细胞中能自我复制。
(3)√　(4)√
(5)×　将DNA溶于NaCl溶液中，加入二苯胺试剂，沸水浴加热五分钟，待冷却后，溶液呈现蓝色。
(6)×　“DNA的粗提取与鉴定”实验中，离心研磨液是为了加速细胞碎片的沉淀。
(7)×　向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，向过滤后所得滤液中加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精，此时DNA析出，不会进入滤液中。
真题演练
1．避免目的基因和质粒的反向连接、防止目的基因和质粒的自身环化　T4 DNA连接酶
2．终止子　启动子　RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA　鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来
3．正向连接的重组DNA有这两种酶切位点(限制酶的识别序列)；而反向连接的重组DNA会形成新的序列，没有这两种酶的酶切位点(没有限制酶的识别序列)
4．(1)磷酸二酯键　不破坏N基因，使M1与M2之间有启动子、N基因、终止子，能保证N基因正常表达　(2)C－G、A－T、U－A
5．(1)Hind Ⅲ、BamH Ⅰ　交链格孢　(2)利用转基因技术将百合B中基因L的启动子替换为野生百合中基因L的启动子pL
解析　(1)根据目的片段以及质粒上限制酶的识别位点，若要获得启动子pL并连接到质粒上，可选用限制酶Hind Ⅲ、BamH Ⅰ进行酶切，以替换Ti质粒中的启动子，从而达到根据GUS酶活性反映启动子活性的目的。根据图c的结果可知，交链格孢处理的每一组转基因烟草中的GUS酶活性都最高，可确定其诱导作用最强。(2)欲培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，可利用转基因技术将百合B中基因L的启动子替换为野生百合中基因L的启动子pL。
6．(1)农杆菌细胞内含有Ti质粒，Ti质粒中的T－DNA能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA整合到一起　(2)荧光检测选择带有绿色荧光标记的毛状根　观察幼苗是否表现出白化特征　PDS缺失会导致植株白化，白化苗的出现意味着通过基因编辑技术成功实现PDS基因的敲除
模拟预测
1．PTL12是棉纤维细胞特异启动子，将IDG与特异启动子PTL12结合可以使IDG基因在棉纤维细胞中特异表达　形成相同的黏性末端，使PTL12片段能与IDG按设计方向正确连接，保证IDG的正确表达
2．(1)Bgl Ⅰ　EcoR Ⅴ　4　(2)潮霉素　a4水稻株系中没有导入目的基因或目的基因未表达　叶片　Cab启动子是叶片特异性启动子，它使ictB基因只能选择性地在叶片中表达
解析　(1)据图1可知，重组DNA分子中有BamH Ⅰ的酶切位点，故不能选择BamH Ⅰ，又因为Sau3A Ⅰ也可识别BamH Ⅰ的酶切位点，故也不能选择Sau3A Ⅰ，又由于Spe Ⅰ能切割Cab启动子，也不能选择，故只能选择Bgl Ⅰ和EcoR Ⅴ，再根据启动子的方向可知，M端添加的序列所对应的限制酶是Bgl Ⅰ，N端添加的序列所对应的限制酶是EcoR Ⅴ；添加了限制酶识别序列的重组DNA分子与Ti质粒的重组过程共需要4种酶，分别是Bgl Ⅰ、EcoR Ⅴ、DNA连接酶和Sau3A Ⅰ(切割Ti质粒)。(2)由图1可知潮霉素抗性基因位于Ti质粒的T－DNA上，随T－DNA整合到水稻细胞的染色体上，所以将农杆菌液浸泡过的水稻愈伤组织进行植物组织培养，培养基中需加入潮霉素进行筛选，筛选出的愈伤组织可再分化形成丛芽，最终获得多个转基因水稻株系；蛋白质的表达量与基因的表达有关，故a4株系ictB蛋白表达量较低的原因可能是其没有导入目的基因或目的基因没有表达。由于Cab启动子是叶片特异性启动子，它使ictB基因只能选择性地在叶片中表达，故检测应选用的植物器官是叶片。
3．(1)BamH Ⅰ和Pst Ⅰ　BsrG Ⅰ在CFP基因中存在，不能使用；双酶切可避免目的基因和载体自身环化和反向连接　(2)使得CFP与B基因之间的碱基个数为3的倍数，翻译时B基因不发生移码　第一条引物与模板链配对，序列与图示B基因序列相同，第二条引物与非模板链配对，序列应与图示B基因序列互补
4．(1)无需使用限制酶和DNA连接酶　(2)EcoR Ⅰ　BamH Ⅰ　LacZ　(3)四环素和X－gal　蔗糖和X－gal
5．(1)2　定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合　(2)既能专一性切除多余的PMP22基因，又能确保必要的PMP22基因不被破坏，比破坏PMP22基因结构更可靠
(3)①5′－GTCGAC－3′　5′－GGATCC－3′　②Cas9基因
解析　(3)为保证不破坏复制原点，DNA上游需添加Sal Ⅰ的识别序列；由于Xho Ⅰ与Sal Ⅰ为同尾酶，为避免目的基因与载体任意连接，DNA下游需添加BamH Ⅰ的识别序列。
6．(1)BamH Ⅰ、Hind Ⅲ和DNA连接酶　2n－2　(2)筛选出导入目的基因的愈伤组织细胞　筛选出导入重组Ti质粒的农杆菌　(3)在特定细胞中特异性表达的基因启动子等调控元件
解析　(1)图1重组Ti质粒的启动子和终止子之间含有三种酶的酶切位点，即EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ、Hind Ⅲ，而图2 OsNP1基因两端的酶切位点为EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ、Hind Ⅲ，EcoR Ⅰ酶切会导致目的基因和Ti质粒自身环化和反向连接，为使OsNP1基因与图1中Ti质粒正确连接来构建基因表达载体，应选择的酶是BamH Ⅰ、Hind Ⅲ和DNA连接酶。PCR技术扩增会出现长、中、短三种长度的单链，分别代表模板链、引物链(第一次扩增形成的)、新合成的短链；一个OsNP1基因在n－1次循环中共形成2n－1个DNA分子、形成2n个DNA单链，而这些单链中只有模板链不会新合成短链，则第n次循环中新合成短链的数目＝2n－2。(2)新霉素抗性基因作为标记基因，用于筛选含有目的基因的受体细胞(愈伤组织细胞)；卡那霉素抗性基因作为选择标记基因，用于筛选含有重组Ti质粒的农杆菌。(共111张PPT)
基因工程
争分点突破 2　
一 核心提炼
1.限制酶的选择技巧
(1)根据目的基因两端的限制酶切点选择限制酶
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择限制酶SmaⅠ。
②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也能被切出相同的黏性末端，如图乙)。
(2)根据质粒的特点选择限制酶(如图)
(3)根据Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶。图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(假设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)。
2.基因表达载体的构建过程(如图)
3.Cre/LoxP重组酶系统
(1)Cre重组酶：由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码，具有限制酶特性，能够特异性识别LoxP位点。能介导两个LoxP位点之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。
(2)LoxP序列：来源于P1噬菌体，包括两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的间隔区域，反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了LoxP位点的方向。
(3)①同向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列，仅保留一个LoxP。
②反向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位。
4.CRISPR/Cas9基因编辑
CRISPR/Cas9系统是细菌体内的用来对抗侵略细菌的外源DNA或噬菌体的基因编辑系统。CRISPR是成簇的、规律间隔的、短回文重复DNA序列。Cas9蛋白是一种RNA引导的DNA内切核酸酶，当细菌受到噬菌体的侵染时，噬菌体的某段DNA序列被Cas9内切酶剪切后整合到CRISPR的间隔序列区域，当相同种类的噬菌体再次侵染细菌时，转录的crRNA可以引导Cas9蛋白找到并切断噬菌体(形成平末端)释放到细菌体内的DNA，从而阻止噬菌体在细菌体内繁殖。
其作用机制大体可以分为三个步骤：(1)内切酶(Cas9酶)切割噬菌体获取新的间隔序列；(2)将其引入原间隔序列并转录出crRNA；(3)crRNA和Cas9蛋白形成复合物精准切割与新间隔序列相同的基因。具体过程如图所示。
5.In－Fusion技术
In－Fusion技术即无缝克隆和组装技术，是一种新型的、快速、简洁的克隆方法，可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA片段的插入。具体原理：
在载体末端和目的基因两端应具有15～25个同源碱基，而目的基因两端的同源序列往往是通过引物设计实现的，In－Fusion酶能够识别具有相同末端序列的线性DNA分子并使其形成黏性末端，DNA连接酶再将两条DNA单链黏合起来。
(1)质粒构建过程：①采用酶切或者PCR扩增方法将载体线性化；②使用设计好的引物进行目的DNA片段的PCR扩增；③反应体系内形成重组质粒。
(2)与传统酶切、酶连相比的优势：①位点选择灵活，在载体任意位置
进行基因克隆；②快速简便；③克隆效率高，阳性克隆高达90%以上；④可同时克隆两个或多个DNA片段。
判断下列关于基因表达载体构建的叙述
(1)基因表达载体上的启动子是DNA聚合酶识别和结合的部位，而终止子是使翻译过程在需要的地方停下来(　　)
提示：基因表达载体上的启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，用于驱动基因的转录；终止子使转录过程在所需要的地方停下来。
×
(2)基因表达载体具有多个限制酶切点，有助于目的基因的表达，而复制原点的作用是保证标记基因在宿主细胞中复制并稳定保存(　　)
提示：载体具有多个限制酶切点，以便构建基因表达载体；复制原点可以保证重组DNA分子在受体细胞中能自我复制。
×
(3)在果实中表达acs(乙烯合成关键酶基因)的反义基因可延迟果实成熟(　　)
(4)利用蛋白质工程技术在腈水合酶(N0)的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)，加入连接肽需要通过改造基因实现(　　)
√
√
(5)“DNA粗提取与鉴定”实验中，在DNA溶液中加入二苯胺试剂后即呈现蓝色(　　)
提示：将DNA溶于NaCl溶液中，加入二苯胺试剂，沸水浴加热五分钟，待冷却后，溶液呈现蓝色。
×
(6)“DNA的粗提取与鉴定”实验中，离心研磨液是为了加速DNA的沉淀(　　)
提示：“DNA的粗提取与鉴定”实验中，离心研磨液是为了加速细胞碎片的沉淀。
×
(7)粗提取DNA时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，向过滤后所得滤液中加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物(　　)
×
提示：向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，向过滤后所得滤液中加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精，此时DNA析出，不会进入滤液中。
二 真题演练
1.(2024·全国甲，38节选)质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，与用酶a单酶切相比，用酶a和酶b双酶切的优点体现在________________________________________
_____________________(答出两点即可)；使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是_______________。
避免目的基因和质粒的反向连接、防止目的
基因和质粒的自身环化
T4 DNA连接酶
2.(2023·全国乙，38节选)GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因(均为突变基因)构建表达载体，其模式图如图所示(箭头为GFP突变基因的转录方向)。图中①为________；②为________，其作用是____________
_________________________________
_______；图中氨苄青霉素抗性基因是
一种标记基因，其作用是___________
_________________________________
_______________________。
终止子
启动子
RNA聚合酶
识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来
3.(2022·福建，13节选)载体和CD14片段的酶切位点及相应的酶切抗性基因序列如图所示。用XhoⅠ和SalⅠ分别酶切CD14和图中载体连接，CD14接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA。可进一步用这两种限制酶对CD14的连接方向进行鉴定，理由是________________
__________________________________________________________________________________________________________________________。
正向连接的重组
DNA有这两种酶切位点(限制酶的识别序列)；而反向连接的重组DNA会形成新的序列，没有这两种酶的酶切位点(没有限制酶的识别序列)
4.(2024·新课标，35节选)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到
菌株B2。酶切位点(Ⅰ～Ⅳ)、
引物(P1～P4)的结合位置、片
段甲替换区如图所示，→表
示引物5′→3′方向。回答
下列问题：
(1)限制酶切割的化学键是____________。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是_________________________________________
_________________________________。
磷酸二酯键
不破坏N基因，使M1与M2之间有启动子、N基因、终止子，能保证N基因正常表达
(2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G－C和____________________。
C－G、A－T、U－A
5.(2024·湖南，21节选)百合具有观赏、食用和药用等多种价值，科研人员对其进行了多种育种技术研究。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L，该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图，其中基因gus编码GUS酶，GUS酶活性可反映启动子活性。
(1)研究病原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取pL，首先选用_________________酶切，将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接，再导入烟草。随机选取3组转基因成功的烟草(P1、P2和P3)进行病原微生物胁迫，结果如图c。由此可知：三种病原微生物都能诱导pL的活性增强，其中_________的诱导作用最强。
Hind Ⅲ、BamH Ⅰ
交链格孢
根据目的片段以及质粒上限制酶的识别位点，若要获得启动子pL并连接到质粒上，可选用限制酶Hind Ⅲ、BamH Ⅰ进行酶切，以替换Ti质粒中的启动子，从而达到根据GUS酶活性反映启动子活性的目的。根据图c的结果可知，交链格孢处理的每一组转基因烟草中的GUS酶活性都最高，可确定其诱导作用最强。
(2)现发现栽培种百合B中也有L，但其上游的启动子与野生百合不同，且抗病性弱。若要提高该百合中L的表达量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，简要写出实验思路：_____________________________
________________________________________。
利用转基因技术将百合B中基因L
的启动子替换为野生百合中基因L的启动子pL
欲培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，可利用转基因技术将百合B中基因L的启动子替换为野生百合中基因L的启动子pL。
6.(2023·海南，20节选)我国开发了一种新型基因递送系统(切—浸—生芽，简称CDB法)。图1与图2分别是利用常规转化法和CDB法在某植物中递送基因的示意图。则：
(1)图1与图2中，农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是________________________
________________________________
农杆菌细胞内含有Ti质粒，
Ti质粒中的T－DNA能将外源基因递
送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA整合到一起
___________________________________________________。
(2)已知某酶(PDS)缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体(含有绿色荧光蛋白标记基因)，利用图2中的CDB法将该重组载体导入植株B，长出毛状根，成功获得转化植株B。据此分析，从毛状根中获得阳性毛状根段的方法是______
________________________________，图2中，鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是___________________________，依据是_____________
_______________________________________________________________________。
荧光
检测选择带有绿色荧光标记的毛状根
观察幼苗是否表现出白化特征
致植株白化，白化苗的出现意味着通过基因编辑技术成功实现PDS基因的敲除
PDS缺失会导
三 模拟预测
1.研究人员将靛蓝色素酶基因(IDG)与启动子PTL12(棉纤维细胞特异启动子)相连以构建基因表达载体(如图，KpnⅠ、HindⅢ、BamH Ⅰ、PstⅠ代表不同限制酶，图中质粒上酶的位置为其对应的酶切位点)，并最终培育出能在棉纤维细胞中表达靛蓝色素酶的彩色棉新品种。本研究中将IDG与启动子PTL12结合的主要目的是_________________________________
_____________________________________________________________。
PTL12是棉纤维细胞特异启动子，将
IDG与特异启动子PTL12结合可以使IDG基因在棉纤维细胞中特异表达
过程①②都使用KpnⅠ切割质粒，目的是_________________
_________________________________________________________________。
形成相同的黏性末
端，使PTL12片段能与IDG按设计方向正确连接，保证IDG的正确表达
2.(2024·天津宁河区高三一模)蓝细菌中的ictB蛋白能高效转运和浓缩CO2，从而提高细胞光合速率。我国科学家构建了叶片特异性启动子Cab(叶绿
体捕光色素蛋白Cab基因启动子)驱动的蓝细菌ictB基因表达载体，并通过农杆菌转化法获得了转ictB基因水稻，大大提高了水稻的产量。在ictB基因表达载体的构建中，含Cab启动子和ictB基因的重组DNA分子和Ti质粒的酶切位点如图1所示。请回答下列问题：
(1)为使重组DNA分子能定向插入T－DNA中，可用PCR的方法在重组DNA分子两端添加限制酶识别序列，据图可知，M端添加的序列所对应的限制酶是________，N端添加的序列所对应的限制酶是________。添加了限制酶识别序列的重组DNA分子与Ti质粒的重组过程共需要______种酶。
Bgl Ⅰ
EcoR Ⅴ
4
据图1可知，重组DNA分子中有BamH Ⅰ的酶切位点，故不能选择BamH Ⅰ，又因为Sau3A Ⅰ也可识别BamH Ⅰ的酶切位点，故也不能选择Sau3A Ⅰ，又由于Spe Ⅰ能切割Cab启动子，也不能选择，故只能选择Bgl Ⅰ和EcoR Ⅴ，再根据启动子的方向可知，M端添加的序列所对应的
限制酶是Bgl Ⅰ，N端添加的序列所对应的限制酶是EcoR Ⅴ；添加了限制酶识别序列的重组DNA分子与Ti质粒的重组过程共需要4种酶，分别是Bgl Ⅰ、
EcoR Ⅴ、DNA连接酶和Sau3A Ⅰ(切割Ti质粒)。
_____________________________________。检测应选用的植物器官是______，原因是________________________________________________
_________________。
(2)将农杆菌液浸泡过的水稻愈伤组织进行植物组织培养，培养基中需加入________进行筛选，最终获得多个水稻株系a1、a2、a3、a4。对a1～a4四个水稻株系的ictB蛋白表达量进行测定，结果如图2，其中a4株系ictB蛋白表达量较低的原因可能是_________
潮霉素
a4水稻株
叶片
系中没有导入目的基因或目的基因未表达
Cab启动子是叶片特异性启动子，它使ictB基因只能选择
性地在叶片中表达
由图1可知潮霉素抗性基因位于Ti质粒的T－DNA上，随T－DNA整合到水稻细胞的染色体上，所以将农杆菌液浸泡过的水稻愈伤组织进行植物组织培养，培养基中需加入潮霉素进行筛选，筛选出的愈伤组织可再分化形成丛芽，
最终获得多个转基因水稻株系；蛋白质的表达量与基因的表达有关，故a4株系ictB蛋白表达量较低的原因可能是其没有导入目的基因或目的基因没有表达。由于Cab启动子是叶片特异性启动子，它使ictB基因只能选择性地在叶片中表达，故检测应选用的植物器官是叶片。
3.随着土壤盐渍化(主要是Na＋引起)不断加剧，提高耐盐性已成为研究和改良作物的重要方向。从高盐环境中吸收K＋可维持细胞内K＋/Na＋稳态，从而提高植物的耐盐性。H是细胞膜上的一种K＋转运蛋白，B蛋白可以增强H的功能。为探究作用机理，研究人员构建了两个分别含有CFP－B和YFP－H融合基因的表达载体。CFP和YFP分别是青色荧光蛋白基因和黄色荧光蛋白基因。为了获得含CFP－B的表达载体，选择了已经包含CFP的载体p1300－CFP。相关信息如图所示。
请回答下列问题：
(1)为将B基因连入CFP基因，需使用两端带有酶切位点序列的引物扩增B基因，优先选择的酶切位点是________________，理由是_____________________________
______________________________________________________。
BamH Ⅰ和Pst Ⅰ
BsrG Ⅰ在CFP基因中存在，不能使用；双酶切可避免目的基因和载体自身环化和反向连接
(2)据此，研究人员使用的两条引物序列分别为5′－XXXXXXNNATGGCCGGC－3′和5′－YYYYYYCTACTCAGA－3′。X和Y分别代表(1)选择的酶切位点，N代表任意碱基的核苷酸。第一条引物中NN的作用是_________________________
__________________________________________。
使得CFP与B基因之间的碱基个数为3的倍数，翻译时B基因不发生移码
第二条引物与图中B基因末端序列不相同的原因是___________________________
_________________________________________________________________________________。用同样的方法获得了含YFP－H融合基因的表达载体。
第一条引物与模板链配对，序列与图示B基因序列相同，第二条引物与非模板链配对，序列应与图示B基因序列互补
4.通过体内同源重组可以进行靶向基因敲除，原理如图1所示。同源重组技术结合tetr－sacB双重选择系统可对基因进行敲除与回补，研究基因的功能。图2是科研人员利用该方法对大肠杆菌LacZ基因进行敲除与回补
的相关过程，其中tetr是四环素抗性基因，
sacB基因是蔗糖致死基因，LacZ基因表达
产物能将无色化合物X－gal水解成蓝色化
合物。
限制酶 EcoR Ⅰ BamH Ⅰ Hind Ⅲ Xma Ⅰ
识别序列和切割位点 ↓ 5′—GA ATTC—3′ ↓ 5′—GG ATCC—3′ ↓ 5′—AA GCTT—3′ ↓
5′—CC
CGGG—3′
回答下列问题：
(1)据图1分析，与传统转基因技术相比，体内同源重组具有的特点是________________
_____________。
无需使用限制酶
和DNA连接酶
(2)图2过程①中，设计两种引物时需在引物5′端分别添加________、________限制酶的识别序列；过程⑤中，设计两种引物时需在引物5′端分别添加________基因两端的同源序列。
(3)图2过程⑦中，在含有_______________的培养基中出现了白色菌落，即为筛选出的敲除LacZ基因菌株。过程⑧通过同源重组技术结合tetr－sacB双重选择系统可对LacZ基因进行回补，筛选LacZ基因回补菌株时应在培养基中添加______________。
EcoR Ⅰ
BamH Ⅰ
LacZ
四环素和X－gal
蔗糖和X－gal
5.PMP22基因在人基因组中有多个拷贝，表达产生的PMP22蛋白在人髓鞘细胞中不可或缺，但PMP22蛋白过量可引发腓骨肌萎缩症(CMT1A)，科研人员希望利用CRISPR/Cas9基因编辑系统治疗CMT1A。回答下列问题：
(1)CRISPR/Cas9基因编辑系统原理如图1所示，Cas9蛋白可切割特定部位的DNA双链，造成DNA损伤，一次切割过程中会产生____个游离的磷酸基团。机体修复DNA损伤时，可能会改变碱基序列。图中gRNA的作用是___________
________________________。
2
定向引导
Cas9蛋白与靶向基因结合
(2)科研人员本来的基因编辑方案是将gRNA结合位点设计在PMP22基因内部，后改为如图2所示的方案，该方案比起原方案的优点是____________________
__________________________________
___________________________________________。
既能专一性切除多余的
PMP22基因，又能确保必要的PMP22基因不被破坏，比破坏PMP22基因结构更可靠
(3)科研人员希望在人髓鞘细胞中表达CRISPR/Cas9基因编辑系统，构建的基因表达载体如图3所示。
①在对gRNA对应的DNA片段进行PCR扩增时，需要在上游和下游引物的5′端分别添加碱基序列__________________和__________________，保证DNA片段定向插入。
②基因表达载体上，除了图示序列和标记基因外，还需要的序列是_________。
5′－GTCGAC－3′
5′－GGATCC－3′
Cas9基因
为保证不破坏复制原点，DNA上游需添加Sal Ⅰ的识别序列；由于Xho Ⅰ与Sal Ⅰ为同尾酶，为避免目的基因与载体任意连接，DNA下游需添加BamH Ⅰ的识别序列。
6.(2024·青岛高三二模)某种雄性不育水稻是由野生型水稻的核基因M突变为m所致，科研团队构建转基因智能不育系的思路是将育性恢复基因OsNP1(在原始生殖细胞中表达)、花粉失活基因ZM－AA(在花粉中表达)两个基因一起构建重组Ti质粒。然后通过农杆菌转化法将目的基因导入愈伤组织细胞，从转基因后代中筛选m位点是纯合但两个转基因位点是杂合的可育植株。
(1)图1为已导入ZM－AA基因的重组Ti质粒，图2为OsNP1基因和相应的酶切位点，其中A链为转录模板链。为使OsNP1基因与图1中Ti质粒正确连接来构建基因表达载体，应选择的酶有_____________________________；采用PCR技术扩增图2中的OsNP1基因时，会出现长、中、短三种长度的单链，一个OsNP1基因在第n次循环中新合成的短链数为_______。
BamH Ⅰ、Hind Ⅲ和DNA连接酶
2n－2
图1重组Ti质粒的启动子和终止子之间含有三种酶的酶切位点，即EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ、Hind Ⅲ，而图2 OsNP1基因两端的酶切位点为EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ、Hind Ⅲ，EcoR Ⅰ酶切会导致目的基因和Ti质粒自身环化和反向连接，为使OsNP1基因与图1中Ti质粒正确连接来构建基因表达载体，应选择的酶是BamH Ⅰ、Hind Ⅲ和DNA连接酶。
PCR技术扩增会出现长、中、短三种长度的单链，分别代表模板链、引物链(第一次扩增形成的)、新合成的短链；一个OsNP1基因在n－1次循环中共形成2n－1个DNA分子、形成2n个DNA单链，而这些单链中只有模板链不会新合成短链，则第n次循环中新合成短链的数目＝2n－2。
(2)重组Ti质粒中的新霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因的具体作用分别是_________________________________、__________________________
_____。
筛选出导入目的基因的愈伤组织细胞
筛选出导入重组Ti质粒的农
杆菌
新霉素抗性基因作为标记基因，用于筛选含有目的基因的受体细胞(愈伤组织细胞)；卡那霉素抗性基因作为选择标记基因，用于筛选含有重组Ti质粒的农杆菌。
(3)若使两个基因分别在不同的细胞中表达，需将两个基因分别与_____________________________________________重组在一起。
在特定细胞中特异性表达的基因启动子等调控元件
四 专题强化练
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答案
对一对
题号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
答案 A D A C C B C C D B
题号 11
答案 (1)低　256(或44)　GTTT　CAAT(或CAAT　GTTT)　(2)卡那霉素　SacⅠ　④
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对一对
题号 12
答案 (1)Cla Ⅰ　Mun Ⅰ　(2)4　P4与A扩增产物不含完整的WAP基因的启动子，EPO基因不表达　(3)能使EPO基因在大鼠的乳腺细胞中特异性表达　(4)EPO基因是真核生物的基因，该基因转录出的mRNA无法在大肠杆菌细胞内加工成熟，表达出来的产物不是EPO
题号 13
答案 (1)DNA聚合酶和DNA连接酶　引物F1 3′端序列　(2)Bcl Ⅰ和Sma Ⅰ　①④　(3)先筛选出能在含四环素培养基上生长而不能在含氨苄青霉素培养基上生长的农杆菌，再用含草甘膦的培养基筛选出导入融合基因的拟南芥细胞　(4)根　促进植物对磷元素的吸收
答案
1.(2024·江西，12)γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E.coli A，构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E.coli B。下列叙述正确的是
A.图示表明，可以从酿酒酵母S中
分离得到目的基因gadB
B.E.coli B发酵生产γ-氨基丁酸时，
L-谷氨酸钠的作用是供能
C.E.coli A和E.coli B都能高效降解γ-氨基丁酸
D.可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒
√
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答案
由图示可知，可以从酿酒酵母S中分
离得到目的基因gadB，A正确；
由题干可知，E.coli B以L-谷氨酸钠
为底物高效生产γ-氨基丁酸，因此
L-谷氨酸钠为反应底物，而不是起
供能作用，B错误；
E.coli A和E.coli B均为生产γ-氨基丁酸的菌种，故二者均不能高效降解γ-氨基丁酸，C错误；
根据题干及题图给出的信息，无法推断出是否有其他酶能够替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒，D错误。
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2.(2024·郑州高三模拟)自然界中很少出现蓝色的花，天然蓝色花出现的主要原因是花瓣细胞液泡中的花青素在碱性条件下显蓝色。我国科学家利用链霉菌的靛蓝合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)构建了基因表达载体(如图)，通过农杆菌转化法将上述基因导入白玫瑰，在细
胞质基质中形成稳定显色的靛蓝。下列
相关叙述正确的是
A.不同限制酶的识别序列都是由6个脱
氧核苷酸组成的
B.将idgS基因插入Ti质粒时使用的限制酶是SpeⅠ和BamH Ⅰ
C.将sfp基因插入Ti质粒时使用的限制酶是PmeⅠ和SacⅠ
D.启动子和终止子不表达出蛋白质，都属于基因的调控序列
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大多数限制酶的识别序列由6个脱氧核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的脱氧核苷酸组成，A错误；
由图可以看出，idgS基因插入Ti质粒的
SpeⅠ和SacⅠ两个限制酶识别位点之间，sfp基因插入Ti质粒的启动子1和终止子1之间；将sfp基因插入Ti质粒时，可使用限制酶BamHⅠ，将idgS基因插入Ti质粒时，可用SpeⅠ和SacⅠ进行双酶切割，B、C错误；
启动子和终止子不表达出蛋白质，都属于基因的调控序列，D正确。
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3.由于PCR扩增出的目的基因末端为平末端，且无合适的限制酶识别序列，需借助中间载体P将目的基因接入载体E。图示为两种载体的结构和相关限制酶的识别序列，下列叙述正确的是
A.构建重组载体P时，应选择EcoRⅤ进
行酶切，再用T4 DNA连接酶连接
B.为了便于该目的基因接入载体E，可
用限制酶EcoRⅤ或SmaⅠ切割载体P
C.载体P不能作为基因表达载体，是因
为它不含起始密码子和终止密码子
D.若受体细胞表现出抗性基因的相应
性状，表明重组载体成功导入受体细胞
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由于载体E只有产生黏性末端的酶切位点，要使中间载体P接入载体E，同时防止载体E自身环化，需要用两种限制酶分别切割载体E和中间载体P，据图可知，中间载体P和载体E均含有XhoⅠ和PstⅠ酶识别序列，故可选用XhoⅠ和PstⅠ酶进行酶切，载体P的这两种酶识别序列中含有EcoRⅤ识别位点，并且其切割产生平末端，可以用于
连接目的基因，SmaⅠ酶虽然也能切割得到平末端，但是其识别位点没有位于XhoⅠ和PstⅠ酶识别位点之间，故不能选择其对中间载体P进行切割，连接平末端用T4 DNA连接酶，A正确，B错误；
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由图可知，不直接选择P构建表达载体是因为它不含启动子与终止子，C错误；
受体细胞表现出抗性基因的相应性状，可能是导入了重组质粒，也可能只导入了空质粒(不含目的基因的质粒)，D错误。
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4.目的基因和载体如果用同一种限制酶处理，连接时会出现正反接的情况，为鉴定筛选出的表达载体中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR后，结合电泳技术鉴定，图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，其中目的基因为长度300 bp的片段。
下列有关说法错误的是
A.PCR复性温度不宜太低，避免引物错配和模板链
形成双链
B.电泳条带迁移的位置和速度与DNA分子的大小和
构象有关
C.选取引物甲、丙，扩增出450 bp长度片段时，可以说明目的基因正接
D.选取引物甲、乙，扩增出400 bp长度片段时，可以说明目的基因反接
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复性是在高温解旋后降低温度让引物与模板链结合，复性温度不宜太低，避免引物错配和模板链形成双链，A正确；
电泳条带迁移的位置和速度与DNA分子的大小和构象有关，电泳一段时间后，较大的DNA
分子迁移距离小，离加样孔近，而较小的DNA分子迁移距离大，离加样孔远，B正确；
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由于使用的引物是甲和丙，没有与基因相应位置配对，因此不管目的基因正接还是反接，扩增出的片段均为450 bp，C错误；
选取引物甲和乙，扩增出400 bp长度片段时，可以说明目的基因反接，若正接，不能扩增出100 bp的片段，D正确。
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5.普通棉花中β-甘露糖苷酶基因表达出的GhMnaA2能催化半纤维素降解，使棉纤维长度变短。为了培育长绒棉，科研人员构建了反义GhMnaA2基因表达载体(将正义GhMnaA2基因与载体反向连接)，获得了转基因长绒棉新品种，具体过程如图所示，图中Sma Ⅰ、Not Ⅰ、Hind Ⅲ和BamH Ⅰ代表相应的酶切位点。用Sma Ⅰ和Not Ⅰ切割某正义表达载体可获得3 kb、18 kb、28 kb、59 kb 4种长度的DNA片段。下列叙述正确的是
A.正义GhMnaA2基因的转录方向是B→A
B.过程①得到的表达载体均为反义表达载体
C.反义GhMnaA2基因可能通过抑制GhMnaA2
基因的翻译来保证棉纤维长度
D.用Not Ⅰ切割反义表达载体获得的DNA片
段的长度为21 kb和87 kb
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由图可知，反义表达载体中，反义GhMnaA2基因转录方向是B→A，则正义GhMnaA2基因的转录方向是A→B，A错误；
由于只能由Sma Ⅰ来构建反义表达载体，因此过程①得到的表达
载体可能为反义表达载体，也可能为正义表达载体，B错误；
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反义GhMnaA2基因转录出来的RNA与正常转录的mRNA互补，从而阻止其与核糖体结合，即反义GhMnaA2基因可能通过抑制GhMnaA2基因的翻译来保证棉纤维长度，C正确；
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用Sma Ⅰ和Not Ⅰ切割正义表达载体可获得3 kb、18 kb、28 kb、59 kb 4种长度的DNA片段，据此判断左侧Sma Ⅰ和Not Ⅰ之间的长度是59 kb，A位置处Sma Ⅰ
和Not Ⅰ之间的长度是3 kb，B位置处Sma Ⅰ和Not Ⅰ之间的长度是
18 kb，右上角E6位置处Sma Ⅰ和Not Ⅰ之间的长度是28 kb，故用Not Ⅰ切割反义表达载体获得的DNA片段的长度应分别为18＋28＝46(kb)和3＋59＝62(kb)，D错误。
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6.双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了图示表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析不正确的是
A.可用农杆菌转化法将构建好的
表达载体导入植物细胞
B.为连入GUS基因，需用SalⅠ和
SphⅠ酶切已整合了双向启动子
及LUC基因的质粒
C.在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入该表达载体的微生物受体细胞
D.可通过观察是否出现荧光和蓝色物质确认双向启动子的作用
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将基因表达载体导入植物细胞常用
的方法是农杆菌转化法，A正确；
如果用SphⅠ酶切已整合了双向启
动子及LUC基因的质粒时就会破坏
LUC基因，B错误；
如果成功导入含有壮观霉素抗性基因的基因表达载体，受体细胞就具有抗壮观霉素的能力，在含有壮观霉素的培养基上能生存，因此可以筛选出成功导入表达载体的微生物受体细胞，C正确；
双向启动子如果正常表达，就会合成荧光素酶和β-葡萄糖苷酶，二者催化底物分别产生荧光或生成蓝色物质，从而确定双向启动子的作用，D正确。
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7.(2024·信阳高三期末)在构建基因表达载体时，传统方法常受限于限制酶识别序列。科研人员研发了新的DNA重组方法：In－Fusion技术。该技术关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列(即同源序列)，然后用In－Fusion酶
处理，使同源序列形成黏性末端，
最终形成的重组质粒会在受体细
胞内形成完整的重组序列，主要
操作过程如图所示。
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答案
下列叙述错误的是
A.推测In－Fusion酶的作用是识别
同源序列、形成黏性末端、连接
磷酸二酯键
B.质粒A端和B端的序列不同，可防止目的基因与质粒反向连接及自身环化
C.形成重组质粒时，如果温度远高于50 ℃，黏性末端的碱基更容易互补
配对
D.该技术对目的基因进行PCR，需要经历3次循环才能得到两端含引物1和
引物2的目的基因
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分析题意可知，本技术的过程是在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列(即同源序列)，然后用In－Fusion酶处理，使同源序列形成黏性末端，最终
形成的重组质粒会在受体细胞内
形成完整的重组序列，推测In－Fusion酶的作用是识别同源序列、形成黏性末端，并且使目的基因与线性化质粒通过磷酸二酯键连接形成重组质粒，A正确；
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若用限制酶切割后黏性末端相同，会导致自身环化和反向连接等，质粒A端和B端的序列不同，可防止目的基因与质粒反向连接及自身环化，B正确；
重组质粒形成时如果温度远高于
50 ℃，氢键不容易形成，黏性末端的碱基不容易互补配对，C错误；
根据DNA半保留复制的特点，可知PCR第3轮循环产生的DNA分子存在等长的两条核苷酸链，即仅含引物之间的序列，因此，需要经过3轮循环才能得到两端含引物1和引物2的目的基因，D正确。
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8.(2024·河池高三三模)研究人员将目的基因插入质粒，构建重组质粒的过程如图所示，再将该重组质粒导入大肠杆菌中。由β-半乳糖苷酶基因编码产生的β-半乳糖苷酶可分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈蓝色，否则菌落为白色。下列叙述错误的是
A.将目的基因插入质粒中时，需要用到的酶
有Xho Ⅰ、Nhe Ⅰ和DNA连接酶
B.需要用Ca2＋处理大肠杆菌，使其处于一种
能吸收周围环境中DNA分子的状态
C.将按图示构建的重组质粒导入大肠杆菌后，
大肠杆菌可正常表达该目的基因
D.在含X-gal的培养基上培养导入了重组质粒
的大肠杆菌，可出现蓝色菌落
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目的基因两侧含有限制酶Xho Ⅰ、Nhe Ⅰ的识别序列，将目的基因插入质粒中时，需要用到限制酶Xho Ⅰ、Nhe Ⅰ切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接在一起，A正确；
将目的基因导入受体细胞时，需要用Ca2＋处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态，B正确；
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将按图示构建的重组质粒导入大肠杆菌后，由于目的基因的转录方向和启动子的方向相反，大肠杆菌不能正常表达该目的基因，C错误；
在含X-gal的培养基上培养导入了
重组质粒的大肠杆菌，β-半乳糖苷酶基因编码产生的β-半乳糖苷酶可分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈蓝色，D正确。
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答案
9.CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理如图1所示。科研人员根据猪的细胞表面抗原基因RAG1的启动子设计了sgRNA1和sgRNA2，并利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了两种基因敲除猪，检测基因敲除猪体内的RAG1基因表达情况如图2所示。下列说法错误的是
A.CRISPR/Cas9识别目标DNA序列主要与sgRNA序
列的特异性相关
B.基因敲除猪的细胞表面抗原减少，器官移植过程
中免疫排斥作用减弱
C.两种sgRNA都可引导Cas9在转录水平上减弱RAG1
基因的表达
D.据图2可知，用sgRNA2制备的基因敲除猪用于器
官移植效果更好
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CRISPR/Cas9识别目标DNA序列主要与sgRNA编码序列有关，即主要与sgRNA序列的特异性相关，A正确；
猪的细胞表面抗原会导致器官移植时发生免疫排斥，基因敲除猪的细胞表面抗原减少，器官移植过程中免疫排斥作用减弱，提高了器官移植的成功率，B正确；
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转录是以DNA的一条链为模板合成RNA的过程，启动子是RNA聚合酶识别与结合的位点，用于驱动基因的转录，科研人员根据猪的细胞表面抗原基因RAG1的启动子设计了sgRNA1和sgRNA2，故两种sgRNA都可引导Cas9在转录水平上减弱RAG1基因的表达，C正确；
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据图2可知，与对照组相比，用sgRNA1制备的基因敲除猪RAG1基因表达量更低，说明用sgRNA1制备的基因敲除猪用于器官移植效果更好，D错误。
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10.(2024·泰安高三一模)Cre/LoxP系统能实现特定基因的敲除(如图1)。把几种荧光蛋白基因和Cre酶能识别并切割的序列(LoxP1和LoxP2)串在一起，构建表达载体T(如图2)。部分荧光蛋白基因会被Cre酶随机“剪掉”，且两个LoxP1之间或两个LoxP2之间的基因，最多会被Cre酶敲除一次，剩下的部分得以表达，随机呈现不同的颜色。
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答案
下列说法错误的是
A.Cre酶切下一个待敲除基因的
过程，需要破坏四个磷酸二
酯键
B.若小鼠细胞含一个表达载体
T(不含Cre酶)，其肌肉组织细胞呈红色
C.若小鼠细胞含一个表达载体T(含Cre酶)，其脑组织细胞呈红色或黄色
或蓝色
D.若小鼠细胞含两个表达载体T(含Cre酶)，其一个脑组织细胞内可能随
机出现两种颜色
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答案
DNA单链上相邻的两个脱氧核苷酸之间通过磷酸二酯键相连，DNA由两条单链螺旋缠绕形成，Cre酶切下一个待
敲除基因的过程中，需要切断基因前后两端，因此需要破坏四个磷酸二酯键，A正确；
据图可知，小鼠有编码红、黄、蓝荧光蛋白的基因，前端有脑组织特异性表达的启动子，肌肉细胞不会表达颜色基因，故若小鼠细胞含一个表达载体T(不含Cre酶)，其肌肉组织细胞呈无色，B错误；
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答案
小鼠脑组织细胞内有2个相同表达载体T(含Cre酶)，Cre酶对每个DNA片段随机剪切，因而细胞的颜色由细胞内两
种荧光蛋白的颜色叠加而成，故其脑组织细胞可能随机出现两种颜色，D正确。
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答案
11.(2024·山东，25节选)研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。
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答案
LB/RB：T－DNA的边界序列；Kanr：卡那霉素抗性基因；AmpR氨苄青霉素抗性基因。
甲　载体信息
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答案
乙　目标基因L部分序列
丙　限制酶识别序列、切割位点及电泳结果
(1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越_____(填“高”或“低”)。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有__________种。载体信息如图甲所示，经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5′－___________________－3′和5′－_______________－3′。
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答案
低
256(或44)
GTTT(或CAAT)
CAAT(或GTTT)
单链突出序列NNNN为黏性末端，N代表任意碱基，所以，用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上能得到256种黏性末端。载体上有2个BsaⅠ酶切位点，最后两个空序列为GTTT和CAAT，方向均从5′端到3′端。
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(2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素________筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因
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编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是________，其中纯合的突变植株是_____(填序号)。
卡那霉素
SacⅠ
④
导入大豆细胞中的T－DNA片段中含有卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。根据图甲可知，
目标基因L的目标序列跟突变序列之间只在SacⅠ酶切位点上存在差异，BamHⅠ和EcoRⅠ这两个酶切位点完全相同，根据图丙及题意可知，要以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，并对PCR产物完全酶切后进行电泳从而判断植株含有的是目标序列还是突变序列，
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因此只能选用限制酶SacⅠ，突变序列存在限制酶SacⅠ酶切位点，但是目标序列没有，因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带
会出现两条，目标序列是一条，根据图丙结果可知，只有④为纯合的突变植株。
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12.(2024·揭阳高三期末)人促红细胞生成素(EPO)是一种可用于治疗肾性贫血的糖蛋白类激素，可用乳腺生物反应器生产EPO。科研人员利用大鼠乳清
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酸蛋白(WAP)基因上游的调控序列及启动子和3′UTR序列构建了基因表达载体。构建前，科研人员扩增了WAP基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入EPO基因中，以确定WAP基因启动子的具体位置。相关信息如图所示，回答下列问题：
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答案
(1)为将扩增后的产物定向插入基因表达载体中，以指导EPO基因的表达，需要在引物末端添加特定的限制酶识别序列。由图中信息可知，在P1～P4末端添加的序列所对应的限制酶是_______，在A末端添加的序列所对应的限制酶是_______。
Cla Ⅰ
Mun Ⅰ
需要将WAP基因上游的调控序列及启动子和3′UTR序列与EPO基因相连，则扩增的WAP基因上游的调控序列及启动子和3′UTR序列的5′端不能含有目的基因上的酶切位点，则P1～P4末端添加的序列所对应的限制酶是Cla Ⅰ，WAP基因上游的调控序列及
启动子和3′UTR序列的3′端需要与EPO基因相连，但是不能破坏EPO基因序列，也不能破坏WAP基因上游的调控序列及启动子和3′UTR序列，则A末端添加的序列所对应的限制酶是Mun Ⅰ。
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生成。含P4与A扩增产物的个体没有EPO生成的原因是____________________
_______________________________________。
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(2)将通过PCR处理后的含不同长度的WAP基因上游序列与EPO基因连接，构建成表达载体的过程中，需要____种限制酶切割上述DNA片段。检测转基因雌性大鼠时发现，导入含P1～P3与A扩增产物的个体乳汁中有EPO，而含P4与A扩增产物的个体没有EPO
4
P4与A扩增产物不含
完整的WAP基因的启动子，EPO基因不表达
需要用两种限制酶切割WAP基因上游的调控序列及启动子和3′UTR序列，用两种限制酶切割EPO基因，所以共需要4种限制酶切割上述DNA片段。P4与A扩增产物不含完整的WAP基因的启动子，EPO基因不表达，则含P4与A扩增产物的个体没有EPO生成。
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(3)该实验中，在EPO基因上游插入大鼠WAP基因启动子的理由是___________________________________________。
能使EPO基因在大鼠的乳腺细胞中特异性表达
启动子具有组织特异性，大鼠WAP基因启动子能使EPO基因在大鼠的乳腺细胞中特异性表达，所以在EPO基因上游插入大鼠WAP基因启动子。
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(4)科研人员不选用大肠杆菌作为该实验的受体细胞，从基因表达的角度分析，其原因是____________
_______________________________________________________________________________________________。
EPO基因是
真核生物的基因，该基因转录出的mRNA无法在大肠杆菌细胞内加工成熟，表达出来的产物不是EPO
EPO基因是真核生物的基因，该基因转录出的mRNA无法在大肠杆菌细胞内被加工成熟，表达出来的产物不是EPO，所以不选用大肠杆菌作为该实验的受体细胞。
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13.(2024·潍坊高三二模)A蛋白是某种激素合成的关键酶。为鉴定该激素合成的部位及生理作用，某科研团队利用无缝克隆技术将A蛋白结合蛋白基因(P基因)与β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS基因)融合，构建
A蛋白检测探针，通过农杆菌转化法导
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入拟南芥进行实验。相关原理、过程及质粒的结构如图所示，回答下列问题：
注：①bar为抗草甘膦(一种除草剂)基因；TetR为四环素抗性基因；AmpR为氨苄青霉素抗性基因；②F1、F2、R1、R2为引物；③BamH Ⅰ、Sma Ⅰ、Bcl Ⅰ为限制酶。
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(1)无缝克隆时所需的酶除T5核酸外切酶外还有______________________
____。用无缝克隆技术构建GUS－P
融合基因的关键是引物R2 5′端序列与________________互补。
DNA聚合酶和DNA连
引物F1 3′端序列
接酶
在复性过程中，两个片段的黏性末端可根据互补序列进行配对结合，但由于T5核酸外切酶作用后形成的黏性末端大于互补配对的区段(同源序列)，因此存在缺口，需用DNA聚合酶将缺口补齐，再用DNA连接酶将两个DNA片段连接起来。DNA的两条链是反向平行的，用无缝克隆技术构建
GUS－P融合基因的关键是引物R2 5′端序列与引物F1 3′端序列互补。
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(2)利用双酶切法将融合基因插入Ti质粒，选用的限制酶为______________。扩增融合基因所需的引物R1和F2应选用下列引物组合为________。
①5′-…CTTGGATGAT-3′　
②5′-…TAAGTTGTCT-3′　
③5′-…ATTCAACAGA-3′　
④5′-…TCTGTTGAAT-3′
Bcl Ⅰ和Sma Ⅰ
①④
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利用双酶切法将融合基因插入Ti质粒的T－DNA区，如果使用BamH Ⅰ，会破坏Ti质粒上的TetR和AmpR，故选择Bcl Ⅰ和Sma Ⅰ。根据融合基因的放大图可知，扩增时以DNA的两条链分别作模板，融合基因的3′端序列可以与④5′-…TCTGTTGAAT-3′配对，5′端序列的互补链可以与
①5′-…CTTGGATGAT-3′配对，因此扩增融合基因所需的引物R1和F2应选用的组合为①④。
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(3)利用农杆菌转化法将融合基因导入农杆菌、拟南芥细胞的过程中，需要筛选两次，这两次筛选分别是_____________________________________________________________________________________________________________________________。
先筛选出能在含四环素培养基上生长而不能在含氨苄青霉素培养基上生长的农杆菌，再用含草甘膦的培养基筛选出导入融合基因的拟南芥细胞
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利用农杆菌转化法将融合基因导入农杆菌、拟南芥细胞的过程中，需要筛选两次，这两次筛选分别是先筛选出能在含四环素培养基上生长而不能在含氨苄青霉素培养基上生长的农杆菌，再用含草甘膦的培养基筛选出导入融合基因的拟南芥细胞。
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(4)β-葡萄糖苷酸酶可以水解X－Gluc呈蓝色，将转基因拟南芥置于不同培养液中培养一段时间，然后分离不同部位的组织分别加入X－Gluc进行鉴定，结果如表所示：
根
部位 根 茎 叶
完全培养液 蓝色 浅蓝 浅蓝
缺磷培养液 深蓝 蓝色 浅蓝
分析表明，该激素最主要的合成部位是_____，通过实验结果分析该激素的生理作用是_______________________。
促进植物对磷元素的吸收
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β-葡萄糖苷酸酶可以水解X－Gluc呈蓝色，根据表格信息可知，在完全培养液中，只有根呈现蓝色，说明该激素最主要的合成部位是根，与完全培养液相比，在缺磷培养液中，根的颜色变为深蓝，说明该激素的生理作用是促进植物对磷元素的吸收。专题九　生物技术与工程
1.发酵工程
1～2题每题5分，3～10题每题6分，共58分
1．(2024·烟台高三一模)用“麦汁酸化”法酿造的酸啤酒既有麦芽清香，又酸甜适口。它是通过微生物发酵将麦汁中的麦芽糖和其他糖类转化为醋酸和乳酸，再结合酒精发酵制作而成。下列说法错误的是(　　)
A．前期利用醋酸菌和乳酸菌在同一容器中同时进行醋酸和乳酸发酵
B．达到一定酸度的麦汁需经熬煮、冷却后才可接种抗酸性高的酵母菌
C．后期发酵产生酒精时，应将发酵温度控制在18～30 ℃范围内
D．酒精发酵时发酵罐内液面不再有气泡产生，说明发酵基本完毕
2．(2024·锦州高三模拟)明代冯时化《酒史》记载：“每至桑落时，取其寒暄所得，以井水酿酒甚佳。”意思是每到桑叶飘落的季节，井水的温度最适宜酿酒，所酿造的酒品质最好。有关桑叶酒的酿制，下列说法错误的是(　　)
A．用密闭容器进行桑叶酒发酵时，需定期放气
B．采用井水酿制，主要是因为井水温度有利于微生物发酵
C．酿制中期起泡现象是微生物有氧呼吸产生的CO2释放形成的
D．桑叶酒发酵时，可用酸性重铬酸钾测定酒精含量的变化
3．(2024·贵阳六校高三联考)研究人员将结核杆菌分别接种在含有不同浓度抗生素A与B的培养基中(“＋”代表含抗生素，“＋”的多少代表抗生素浓度，“－”代表不含抗生素)，对两种抗生素的药性进行分析。在37 ℃环境下培养24小时后，细菌生长情况如图。下列叙述正确的是(　　)
A．科学家利用厌氧发酵技术使抗生素中青霉素的生产实现了产业化
B．与单独使用抗生素A相比，联合使用抗生素B的抑菌作用更强
C．为排除杂菌的影响，倒平板前可对培养基采用煮沸灭菌或者高压蒸汽灭菌
D．该实验使用稀释涂布平板法接种结核杆菌，待菌液被吸收后方可倒置培养
4．(2024·张掖高三模拟)某些酵母菌可以利用工业废甲醇作为碳源进行培养，这样既可减少污染又可降低生产成本。研究人员拟从土壤样品中分离该类酵母，并进行大量培养，如图为操作流程。下列说法正确的是(　　)
A．步骤②所用的培养基应以甲醇为碳源
B．步骤③中应将温度约50 ℃的培养基倒入培养皿混匀
C．进行步骤④前需从分离平板中挑取多个菌落，分别测定酵母细胞中甲醇的含量
D．步骤⑤可用真空发酵的方法来提取发酵产物
5．(2024·衡水高三模拟)聚苯乙烯是制造碗装泡面盒、发泡快餐盒的材料。某兴趣小组试图从土壤中分离能分解聚苯乙烯的细菌，相关流程如图所示。下列叙述正确的是(　　)
A．若稀释倍数都为10，则x应为8
B．接种时应在酒精灯火焰旁进行，可将培养皿皿盖完全打开
C．将涂布器放在火焰上燃烧后立即进行涂布
D．应至少涂布三个平板，求菌落数的平均值
6．(2024·山东，15)酵母菌在合成色氨酸时需要3种酶X、Y和Z，trpX、trpY和trpZ分别为相应酶的编码基因突变的色氨酸依赖型突变体。已知3种酶均不能进出细胞，而色氨酸合成途径的中间产物积累到一定程度时可分泌到胞外。将这3种突变体均匀划线接种到含有少量色氨酸的培养基上，生长情况如图。据图分析，3种酶在该合成途径中的作用顺序为(　　)
A．X→Y→Z B．Z→Y→X
C．Y→X→Z D．Z→X→Y
7．我国科技工作者发明“二步发酵法”生产维生素C的工艺是世界首创。第一步发酵用醋酸杆菌合成分泌维生素C前体，第二步发酵用氧化葡萄糖酸杆菌(“小菌”)和假单胞杆菌(“大菌”)混合菌种作为伴生菌，能促进产酸菌生长和产酸。如图为二步发酵法的生产流程。下列说法正确的是(　　)
A．可以利用平板划线法纯化混菌发酵法所需的目的菌
B．单独筛选高效的产酸菌和伴生菌即可用于混菌发酵
C．伴生菌与产酸菌二者互利共生，不存在种间竞争
D．生产过程采用混菌发酵法不需要严格的无菌操作
8．(2024·福州高三三模)青霉菌是一种好氧微生物，在青霉菌发酵时，在合成的开始阶段青霉素和头孢霉素有共同的前体，不久出现分支。生产抗生素的发酵罐如图所示，以下叙述正确的是(　　)
A．由于青霉素的抗菌作用，通入发酵罐的空气无需灭菌
B．搅拌能够使氧气与培养液快速混合，但不利于散热
C．将外源扩环酶基因导入青霉菌，可增加头孢霉素产量
D．青霉菌的发酵最终获得的青霉素是一种单细胞蛋白
9．(2024·济宁高三二模)大肠杆菌、沙门氏菌能引起家禽和家畜的肠道疾病。暹罗芽孢杆菌代谢物具有广谱抗菌性，为检测其对沙门氏菌和大肠杆菌的抑菌能力进行图示实验。下列说法正确的是(　　)
A．制备图示培养基需要在灭菌前调节pH
B．该抑菌实验还需要设计等量生理盐水作为对照
C．图示X为离心后得到的下层沉淀，含有暹罗芽孢杆菌代谢物
D．从抑菌圈边缘挑取菌落涂布平板重复实验，抑菌圈直径变大
10．(2024·南通高三三模)生产啤酒的主要工艺流程如图所示，下列叙述错误的是(　　)
A．过程①中大麦种子发芽释放淀粉酶参与过程②中的糖化过程
B．过程②中焙烤杀死大麦种子胚，碾磨缩短糖化的时间
C．过程②蒸煮时加入啤酒花可增加啤酒的苦度等风味
D．过程③主发酵阶段进行酵母菌繁殖，后发酵阶段产生代谢产物
11．(14分)莠去津，又名阿特拉津，是一种含氮的有机化合物，它是世界上使用最广泛的除草剂之一，由于其在环境中残留期长(4～57周)，是近年备受关注的疑似持久性有机污染物(POPs)，为修复被其污染的土壤，按下面程序选育能降解莠去津的细菌(目的菌)。已知莠去津在水中溶解度低，含过量莠去津的固体培养基不透明。据图回答下列问题：
(1)由图推断，从A瓶到C瓶液体培养的目的是_________________________________
________________________________________________________________________。
(2)从图中看将C瓶菌种接种到固体培养基的过程使用的接种工具是___________，该方法计算得到的菌数往往比实际值___________(填“偏低”或“偏高”)，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)一段时间后，培养基出现无透明带菌落和有透明带菌落两种菌落，我们筛选的目的菌是___________菌落中的细菌，另外一种菌落利用的氮源很可能是___________。
(4)为弄清固体培养基中的非目的菌落来自C瓶菌种还是培养基，要如何设置对照组？________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
12．(14分)研究发现，从活性污泥中能筛选出对蓝色的2BLN染料废水具有高效脱色能力的菌株，它们通过降解具有生物毒性的分散蓝2BLN而降低废水危害。图1表示目标菌株GN－1的筛选流程，图2表示GN－1菌株接种量对脱色效果影响的实验结果。回答下列问题：
(1)图中将菌液接种到含分散蓝2BLN的LB固体培养基上所用的接种方法是__________________，该接种方法要求对菌液做充分的稀释，目的是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)图1中菌种①和③的周围出现透明圈，透明圈形成的原理是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
菌种①～④中，最符合要求的是__________。
(3)据图2可知，GN－1菌株接种量对脱色效果的影响是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________，
其中20%__________(填“是”“不是”或“不确定是”)最佳接种量，主要原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
13．(14分)(2024·全国甲，37)合理使用消毒液有助于减少传染病的传播。某同学比较了3款消毒液A、B、C杀灭细菌的效果，结果如图所示。回答下列问题：
(1)该同学采用显微镜直接计数法和活菌计数法分别测定同一样品的细菌数量，发现测得的细菌数量前者大于后者，其原因是______________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)该同学从100 mL细菌原液中取1 mL加入无菌水中得到10 mL稀释菌液，再从稀释菌液中取200 μL涂布平板，菌落计数的结果为100，据此推算细菌原液中细菌浓度为______个/mL。
(3)菌落计数过程中，涂布器应先在酒精灯上灼烧，冷却后再涂布。灼烧的目的是______________________________________，冷却的目的是__________________________。
(4)据图可知杀菌效果最好的消毒液是______，判断依据是__________________________________________________(答出两点即可)。
(5)鉴别培养基可用于反映消毒液杀灭大肠杆菌的效果。大肠杆菌在伊红－亚甲蓝培养基上生长的菌落呈________色。
答案精析
1．A　[醋酸菌是好氧细菌，在无氧条件下不能存活，而乳酸菌是厌氧细菌，在有氧条件下不能存活，所以醋酸菌与乳酸菌在同一容器中发酵时，不能同时产生醋酸和乳酸，A错误。]
2．C　[酿酒时酵母菌无氧呼吸产生CO2，需定期放气，A正确；酿制中期起泡现象是微生物无氧呼吸产生的CO2释放形成的，C错误；桑叶酒发酵时产生酒精，橙色的重铬酸钾溶液在酸性条件下与酒精发生化学反应变成灰绿色，可根据颜色深浅测定酒精含量的变化，D正确。 ]
3．D　[青霉菌(产生青霉素)是异养需氧型真菌，因此青霉素的发酵过程需要氧气参与，以便微生物能够进行正常的代谢活动，A错误；根据图中平板上菌落的分布可知，与单独使用抗生素A相比，联合使用抗生素B不能增强对结核杆菌的抑制作用，B错误；为排除杂菌的影响，应该用高压蒸汽灭菌法对培养基进行灭菌，然后冷却到50 ℃左右倒平板，C错误；由图可看出培养基表面菌落分布均匀，是利用了稀释涂布平板法接种结核杆菌，待菌液被培养基吸收后方可倒置培养，D正确。]
4．B　[步骤②是对土样中的菌种进行稀释，使用的是无菌水，不是培养基，A错误；步骤③中应将温度约50 ℃的培养基倒入培养皿，这是为了保证培养基在倒入培养皿并与稀释液混合时能够迅速且均匀地凝固，从而形成适合微生物生长的环境，温度过高或过低都可能影响微生物的生长和菌落的均匀分布，从而影响到分离和纯化的效果，B正确；步骤④为利用平板划线法分离纯化的过程，需从分离平板中挑取一个菌落进行划线，且不需要测定酵母细胞中甲醇的含量，C错误；酵母菌是兼性厌氧型微生物，扩大培养过程中需要酵母菌进行有氧呼吸大量繁殖，不能用真空发酵的方法，D错误。]
5．D　[若稀释倍数都为10，则x应为18，A错误；接种时应在酒精灯火焰旁进行，但不能将培养皿皿盖完全打开，B错误；将涂布器放在火焰上燃烧，等冷却后再进行涂布，C错误。]
6．A　[trpZ两端均不能繁殖，就说明Z是最终作用物质；而trpX两端均能繁殖，它旁边的trpY和trpZ却不能繁殖，就说明X先作用。综上，顺序为X→Y→Z。]
7．A　[产酸菌和伴生菌应共同进行筛选，才能获得最佳的生产维生素C的菌种，单独筛选出的高效的产酸菌和伴生菌不一定适配，B错误；伴生菌与产酸菌会共同竞争空间等资源，二者存在种间竞争，C错误；采用混菌发酵法时，需要进行严格的无菌操作，D错误。]
8．C　[青霉素本身具有杀菌作用，但不能杀灭所有的微生物，因此，发酵罐需要严格灭菌，通入发酵罐的空气需要灭菌，A错误；搅拌能够使氧气与培养液快速混合，同时有利于散热，B错误；青霉菌发酵时，在合成的开始阶段青霉素和头孢霉素有共同的前体，将外源扩环酶基因导入青霉菌，可增加头孢霉素产量，C正确；微生物菌体本身属于单细胞蛋白，青霉素属于代谢产物不是单细胞蛋白，D错误。]
9．A　[该抑菌实验为检测暹罗芽孢杆菌代谢物对沙门氏菌和大肠杆菌的抑菌能力，互为对照，因此进行图示实验不需设计等量生理盐水作为对照，B错误；图示X为离心后得到的上清液，含有代谢物，C错误；在抑菌圈边缘生长的细菌可能是耐药菌，从抑菌圈边缘挑取菌落涂布平板重复实验，抑菌圈平均直径变小，D错误。]
10．D　[过程①为发芽过程，该过程中大麦会产生淀粉酶，便于大麦中淀粉分解成葡萄糖，为主发酵过程做准备，该酶在糖化阶段起作用，A正确；啤酒发酵过程包括两个阶段：主发酵和后发酵，其中啤酒的发酵过程中酵母菌的繁殖、大部分糖的分解和代谢产物的生成都在主发酵阶段完成，D错误。]
11．(1)通过选择培养增加降解莠去津的细菌数量　(2)涂布器　偏低　当两个或两个以上的细胞聚集在一起长成的是一个菌落　(3)有透明带　氮气　(4)将配制的培养基灭菌后不接种，与实验组放在相同且适宜的条件下培养
解析　(1)A瓶到C瓶中的培养液是以莠去津为唯一氮源的培养基，属于选择培养基，A瓶到C瓶液体培养的目的是初步选择能降解莠去津的细菌(目的菌)同时增加该菌的数量。(2)从图中看将C瓶菌种接种到固体培养基的方法为稀释涂布平板法，因此该过程使用的接种工具是涂布器，该方法计算得到的菌数往往比实际值偏低，主要是因为当两个或两个以上的细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，进而导致统计的结果偏低。(3)一段时间后，培养基出现无透明带菌落和有透明带菌落两种菌落，需要筛选的目的菌是有透明带菌落中的细菌，即因为培养基中的莠去津被细菌利用而被分解因而出现透明带，另外一种菌落利用的氮源很可能是空气中的氮气。(4)为弄清固体培养基中的非目的菌落来自C瓶菌种还是培养基，需要设置对照组，对照组应该为空白对照，将配制的培养基灭菌后不接种，与实验组放在相同且适宜的条件下培养。
12．(1)稀释涂布平板法　使细菌分散成单个细胞，在平板上获得单菌落　(2)菌种①和③可降解分散蓝2BLN，分散蓝2BLN被降解后蓝色消失形成透明圈　菌种③　(3)随着接种量的增大，GN－1菌株对分散蓝2BLN的脱色率逐渐提高　不确定是　没有设置接种量大于20%的组别，不能确定接种量大于20%后的脱色效果
解析　(1)根据培养基中菌落的分布可知，向含分散蓝2BLN的LB固体培养基上进行接种的方法是稀释涂布平板法。用稀释涂布平板法接种时，要对菌液进行充分的稀释，可以使细菌分散成单个细胞，在平板上获得单菌落。(2)图1中的菌种①和③可以降解分散蓝2BLN，从而使菌落周围的蓝色消失，形成透明圈。菌种③周围透明圈直径与菌落直径的比值较大，所以菌种③降解分散蓝2BLN的能力较强。(3)分析图2可知，随着GN－1菌株接种量的增大，GN－1菌株对分散蓝2BLN的脱色率逐渐提高。20%不一定是最佳接种量，因为没有设置接种量大于20%的组别，不能确定接种量大于20%后的脱色效果。
13．(1)显微镜直接计数法将活菌和死菌一起计数，活菌计数法中存在多个活菌形成一个菌落的情况且只计数活菌
(2)5 000　(3)杀死涂布器上可能存在的微生物，防止微生物污染　防止温度过高杀死菌种　(4)A　A消毒液活细胞减少量最多，且杀菌时间较短，效率最高　(5)深紫
解析　(2)从100 mL细菌原液中取1 mL加入无菌水中得到10 mL稀释菌液，即稀释了10倍，再从稀释菌液中取200 μL涂布平板，即0.2 mL，已知菌落计数的结果为100。则1 mL细菌原液中细菌浓度＝(菌落数÷菌液体积)×稀释倍数＝(100个÷0.2 mL)×10＝5 000(个/mL)。2.细胞工程
1～4题每题5分，5～13题每题6分，共56分
1.(2024·安徽，15)植物细胞悬浮培养技术在生产中已得到应用。某兴趣小组尝试利用该技术培养胡萝卜细胞并获取番茄红素，设计了如图实验流程和培养装置，请同学们进行评议。下列评议不合理的是(　　)
A．实验流程中应该用果胶酶等处理愈伤组织，制备悬浮细胞
B．装置中的充气管应置于液面上方，该管可同时作为排气管
C．装置充气口需要增设无菌滤器，用于防止杂菌污染培养液
D．细胞培养需要适宜的温度，装置需增设温度监测和控制设备
2．(2024·海南华侨中学高三二模)甲品种青花菜具有由核基因控制的多种优良性状，另一远缘植物乙的细胞质中存在抗除草剂基因，欲将乙细胞质中的抗性基因引入甲中。下列相关叙述错误的是(　　)
A．操作过程中生物材料、培养基、培养环境都要严格灭菌
B．过程a中取顶芽细胞进行体细胞杂交有利于获得脱毒苗
C．过程b中可以用物理法或化学法诱导原生质体融合
D．过程c中只有活性部位互补的融合细胞才可以正常生长
3．与常规栽培技术相比，利用植物细胞培养进行药用次生代谢产物的生产具有显著的优越性，根据不同的需求可以采用不同的技术流程(如图)。下列相关叙述错误的是(　　)
A．同一植物的外植体通过不同的培养体系可得到不同的产物
B．外植体形成愈伤组织的过程中，经历了脱分化和再分化两个阶段
C．将目标产物合成途径中的关键酶基因导入悬浮细胞，有望提高产量
D．由于不受土壤、气候条件限制，利用该技术有利于缓解资源短缺问题
4．(2024·潍坊高三三模)细胞划痕实验是一种研究细胞迁移的体外实验方法。当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合，以此来观察测量细胞的迁移侵袭能力。下列说法错误的是(　　)
A．经划痕处理后的细胞需放在CO2培养箱中进行培养
B．为更好地达到实验目的可适当降低培养基中血清的浓度
C．并非所有的动物细胞都适合做划痕实验
D．划痕缩小直至愈合，完全由细胞迁移所导致
5．(2024·哈尔滨高三二模)小鼠胚胎干细胞经定向诱导可获得多种功能细胞，制备流程如图所示。下列有关叙述正确的是(　　)
A．胚胎干细胞只能从囊胚的内细胞团中分离获得
B．分离出的细胞a、b要在CO2培养箱中进行培养
C．定向诱导胚胎干细胞形成多种功能细胞时表达的基因都不同
D．向培养液中加入动物血清会刺激胚胎干细胞表现出全能性
6．(2024·青岛高三三模)线粒体置换技术是一种预防人类线粒体遗传病的技术手段。极体中主要内容物为排出的核基因组，所含线粒体数量较少，因此可以将其作为良好的核供体用于线粒体置换，其过程如图所示。下列说法正确的是(　　)
A．图中获取的极体1为第一极体，极体2为第二极体
B．图中“？”处指受精作用，精子需进行获能处理，为受精提供能量
C．该过程也可直接用患者的体细胞作为核供体
D．图中极体2的遗传物质来自供卵卵母细胞
7．(2024·甘肃，16)甘加藏羊是甘肃高寒牧区的优良品种，是季节性发情动物，每年产羔一次，每胎一羔，繁殖率较低。为促进畜牧业发展，研究人员通过体外受精、胚胎移植等胚胎工程技术提高藏羊的繁殖率，流程如图。下列叙述错误的是(　　)
A．藏羊甲需用促性腺激素处理使其卵巢卵泡发育和超数排卵
B．藏羊乙的获能精子能与刚采集到的藏羊甲的卵母细胞受精
C．受体藏羊丙需和藏羊甲进行同期发情处理
D．后代丁的遗传物质来源于藏羊甲和藏羊乙
8．第三代试管婴儿技术(PGD/PGS)是对早期胚胎细胞进行基因诊断和染色体检测后再进行胚胎移植，流程如图所示。图中检测包括PGD、PGS(PGD是指胚胎植入前的基因诊断，PGS是指胚胎植入前的染色体数目和结构检测)。下列叙述错误的是(　　)
A．采集的卵子需培养至M Ⅱ期才能与获能的精子进行受精
B．PGD和PGS技术可分别用于筛选唐氏综合征和红绿色盲
C．进行胚胎移植前不需要对夫妻双方进行免疫检查
D．“理想胚胎”需培养至桑葚胚或囊胚时期才能植入子宫
9．我国科学家成功地用iPS细胞克隆出了活体小鼠，部分流程如图所示，其中Kdm4d为组蛋白去甲基化酶，TSA为组蛋白去乙酰化酶抑制剂。下列说法正确的是(　　)
A．组蛋白去乙酰化和去甲基化有利于重构胚后续的胚胎发育过程
B．用电刺激、Ca2＋载体等方法激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育进程
C．过程③中诱导细胞融合体现了细胞膜的选择透过性
D．图示流程运用了重组DNA、体细胞核移植、胚胎移植等技术
10．(2024·湖北，10)研究者探究不同浓度的雌激素甲对牛的卵母细胞和受精卵在体外发育的影响，实验结果如表所示。根据实验数据，下列叙述错误的是(　　)
甲的浓度/(μg·mL－1) 卵母细胞/个 第一极体排出/个 成熟率/% 卵裂数/个 卵裂率/%
0 106 70 66.0 28 40.0
1 120 79 65.8 46 58.2
10 113 53 46.9 15 28.3
100 112 48 42.8 5 10.4
A.实验结果说明甲抑制卵裂过程
B．甲浓度过高抑制第一极体的排出
C．添加1 μg·mL－1的甲可提高受精后胚胎发育能力
D．本实验中，以第一极体的排出作为卵母细胞成熟的判断标准
11．(16分)紫杉醇是一种从红豆杉树皮中分离提纯的天然抗癌药物。为快速检测紫杉醇，研究人员利用细胞工程技术制备了抗紫杉醇单克隆抗体，制备过程如图1所示。回答下列问题：
(1)抗紫杉醇单克隆抗体的获得所涉及的生物技术有________________________________。
(2)图1过程①用化学方法诱导融合时可选用____________，能得到________类两两融合的细胞。
(3)为获得杂交瘤细胞，应用特定的选择培养基对细胞甲进行筛选，然后通过专一抗体检测和克隆化培养获得________________________的杂交瘤细胞。若要在体外培养液中培养筛选的杂交瘤细胞，需要将培养液放置在含95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中培养，CO2的作用是____________________。
(4)紫杉醇是红豆杉产生的一种代谢产物，欲利用植物细胞培养获得大量的紫杉醇，应将红豆杉的外植体培育到愈伤组织阶段，原因是____________________________________。研究人员用少量果胶酶处理红豆杉愈伤组织获取单细胞，由愈伤组织培养阶段转入细胞悬浮培养阶段。悬浮培养基为液体培养基，更有利于细胞的生长，原因是________________________________________。据图2分析，为使紫杉醇总产量最高，图中最适合的2,4-D浓度应为________mg·L－1。
12．(14分)(2024·西安高三模拟)苜蓿是广泛应用的豆科牧草，其叶片中的水溶性蛋白质会导致反刍动物患鼓胀病。百脉根的叶片富含单宁，能防止反刍动物鼓胀病的发生。科研人员用紫花苜蓿和百脉根培育抗鼓胀病的新型牧草，育种流程如图所示。已知R-6G可阻止线粒体的功能，IOA能抑制细胞分裂。回答下列问题：
(1)为获得原生质体，常用______________________处理植物细胞以去除细胞壁。
(2)获得的原生质体分别用IOA和R-6G处理后进行融合，培养后，只有__________细胞才能生长出愈伤组织，原因是_______________________________________________________
_____________________________________________________________________________。
(3)过程①可利用____________试剂促融，过程②③使用的培养基的主要区别是__________________________不同。
(4)由杂种细胞团经过程②③的培育得到幼苗，依据的生物学原理是________________。图示培育新型牧草所运用的生物技术的主要优点是________________________。
13．(14分)(2024·昆明高三三模)我国科学家利用动物培育可用于移植的人源器官，图示为相关过程，SIX1和SALL1基因是猪肾脏发育和肾脏细胞自我更新的必需基因。请分析回答下列问题：
(1)可用________________________(写出1种即可)化学方法激活重构胚。
(2)取猪的去核卵母细胞步骤中的“核”指的是________________________。
(3)从干细胞的特点角度分析注入人源干细胞的作用：________________________________________________________________________。
(4)代孕母猪对外来的早期胚胎__________(填“会”或“不会”)产生免疫排斥，人源肾脏用于器官移植________(填“会”或“不会”)产生免疫排斥。
(5)用基因工程等技术，选取囊胚中的某些细胞，可以确定得到的嵌合胚胎是否为人源胚胎，请简要写出实验思路：____________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案精析
1．B　[植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，欲利用愈伤组织制备悬浮细胞，可用纤维素酶和果胶酶处理愈伤组织，A合理；装置中的充气管应置于液面下方，以利于增加培养液中的溶氧量，为及时排出多余气体，排气管应置于液面上方，因此充气管不能同时作为排气管，B不合理。]
2．A　[操作过程中生物材料需要进行消毒，培养基、培养环境需要灭菌，A错误；若想获得脱毒苗，应选用茎尖或芽尖(分生组织)进行培养，因此利用顶芽细胞进行体细胞杂交有利于获得脱毒苗，B正确；过程b为诱导原生质体融合，诱导方法有物理法和化学法，如聚乙二醇融合法、离心法等，C正确；过程c中只有活性部位互补的融合细胞具有完整的细胞结构，才可以正常生长，D正确。]
3．B　[据图可知，同一植物的外植体通过不同的培养体系可得到不同的产物，如经悬浮细胞培养可得到转基因细胞系，经外植体诱导能够获得完整植株等，A正确；外植体形成愈伤组织的过程中，只经历了脱分化过程，B错误。]
4．D　[经划痕处理后的细胞需放在CO2培养箱中进行培养，以维持培养液的pH，A正确；为更好地达到实验目的，可适当降低培养基中血清的浓度，以减少细胞增殖，B正确；并非所有的动物细胞都适合做划痕实验，有些细胞不迁移，C正确；划痕缩小直至愈合，不完全由细胞迁移所导致，也有细胞增殖的原因，D错误。]
5．B　[胚胎干细胞可从早期胚胎中分离获得，早期胚胎不仅仅包括囊胚，A错误；分离出的胚胎干细胞要在CO2培养箱中进行培养，以维持培养液的pH，B正确；定向诱导胚胎干细胞形成多种功能细胞时表达的基因部分相同，如与呼吸作用有关的酶合成的基因，部分不同，如赋予细胞特定功能的有关基因，C错误；动物血清能弥补人工合成的培养基中所欠缺的未知营养成分，并不具备刺激胚胎干细胞表现出全能性的功能，D错误。]
6．A　[依据图示，极体1是由卵原细胞经过减数分裂Ⅰ产生的，因此是第一极体，由于供卵卵母细胞不具备纺锤体，不能进行分裂，故极体2是第一极体经过减数分裂Ⅱ产生，因此是第二极体，A正确；图中“？”处指受精作用，精子需进行获能处理，这里的“获能”是指具备受精的能力，而不是直接为受精作用提供能量，B错误；据图可知，该过程中利用极体作为核供体，因为极体中的线粒体数量少，适合进行线粒体置换，若直接使用患者的体细胞作为核供体可能会引入有问题的线粒体，C错误；极体是由卵原细胞经过减数分裂产生的，其遗传物质主要来自卵原细胞，由于供卵卵母细胞不具备纺锤体，不能进行分裂，故图中极体2的遗传物质来自患者卵母细胞，D错误。]
7．B　[胚胎移植过程中，需用外源促性腺激素处理供体(母藏羊甲)，促使其卵巢卵泡发育和超数排卵，A正确；刚采集的卵母细胞需培养成熟(减数分裂Ⅱ期)后才可与获能的精子进行体外受精，B错误；在胚胎移植前要对供体和接受胚胎的受体进行同期发情处理，使受体的生理状况与供体相同，C正确；后代丁是由藏羊甲的卵细胞和藏羊乙的精子结合形成的受精卵发育而来的，因此后代丁的遗传物质来源于藏羊甲和藏羊乙，D正确。]
8．B　[体外受精时，需要将采集到的卵母细胞在体外培养至M Ⅱ期，才可以与获能的精子完成受精作用，A正确；PGD是指胚胎植入前的基因诊断，可用于筛选红绿色盲，PGS是指胚胎植入前的染色体数目和结构检测，可用于筛选唐氏综合征，B错误；受体子宫对外来胚胎几乎不发生免疫反应，因此进行胚胎移植前不需要对夫妻双方进行免疫检查，C正确；“理想胚胎”需培养至桑葚胚或囊胚才能植入子宫，D正确。]
9．B　[结合题图可知，重构胚在加入含Kdm4d的mRNA和TSA后，发育成克隆鼠，而Kdm4d的mRNA表达产物为组蛋白去甲基化酶，可以使组蛋白去甲基化，TSA为组蛋白去乙酰化酶抑制剂，抑制组蛋白去乙酰化酶的作用，保持组蛋白乙酰化，即组蛋白乙酰化和去甲基化有利于重构胚后续的胚胎发育过程，A错误；在体细胞核移植过程中，用物理方法或化学方法(如电刺激、Ca2＋载体、乙醇、蛋白酶合成抑制剂等)激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育进程，B正确；过程③中诱导细胞融合体现了细胞膜的流动性，C错误；图示流程运用了体细胞核移植、胚胎移植等技术，并未运用重组DNA技术，D错误。]
10．A　[由表可知，甲低浓度时促进卵裂，高浓度时抑制卵裂，A错误；添加1 μg·mL－1的甲，卵裂数增多，卵裂率增大，即该条件可提高受精后胚胎发育能力，C正确。]
11．(1)动物细胞培养和动物细胞融合　(2)聚乙二醇(PEG)　3　(3)既能大量增殖，又能产生抗紫杉醇抗体　维持培养液的pH　(4)愈伤组织的细胞分裂快，代谢旺盛　细胞容易从液体培养基中获取营养，排出代谢产物　1.0
12．(1)纤维素酶和果胶酶　(2)融合的杂种　融合的杂种细胞生理互补，细胞代谢正常，能正常分裂　(3)PEG(或聚乙二醇)　细胞分裂素与生长素的比例　(4)植物细胞的全能性　能克服远缘杂交不亲和的障碍
13．(1)Ca2＋载体(或乙醇、蛋白酶合成抑制剂)　(2)纺锤体—染色体复合物　(3)使人源干细胞分化产生人的组织、器官　(4)不会　会　(5)选取囊胚的滋养层细胞，检测是否含有人特有的DNA序列
解析　(4)代孕母猪对植入的胚胎几乎不发生免疫排斥反应，因而可以保证移植的成功率，这是胚胎移植的基础，人源肾脏用于器官移植，人源肾脏属于外来器官，用于器官移植会引起免疫排斥。3.PCR技术与应用
1～10题每题8分，共80分
1．(2024·盐城高三模拟)PCR引物的3′端有结合模板DNA的关键碱基，5′端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列。下列相关叙述错误的是(　　)
A．图中两条子链合成一定都是从5′端向3′端延伸
B．图示表示复性阶段，该过程的温度与引物的长短有关
C．用图示引物扩增5次后，可以产生22个目标产物
D．PCR每次循环都消耗引物和原料，在实验过程中需要及时补充
2．(2020·北京，12)为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中(如图)。
为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是(　　)
A．①＋③ B．①＋②
C．③＋② D．③＋④
3．(2024·盐城高三模拟)关于DNA片段的扩增及电泳鉴定的实验，下列相关叙述错误的是(　　)
A．PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水和移液器等在使用前都必须进行高压灭菌处理
B．根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，加热到熔化，稍冷却后加入核酸染料混匀
C．电泳鉴定PCR产物时加样缓冲液中的指示剂可提示终止时刻
D．－20 ℃储存的小份缓冲液和酶，使用前从冰箱拿出，需要缓慢融化
4．(2024·太原高三模拟)为检测乳糖酶基因是否导入大肠杆菌，研究人员从受体细胞提取质粒进行PCR扩增，并进行电泳鉴定，结果观察到的DNA条带不止一条。下列有关叙述错误的是(　　)
A．DNA分子带正电还是负电与电泳缓冲液的pH有关
B．出现多条DNA条带可能是扩增时设计的引物过短
C．出现多条DNA条带可能是扩增时模板DNA被污染
D．DNA分子的电泳迁移速率与其大小成正比
5．以DNA复制为基础的双脱氧链终止法是最早的基因测序方法，在反应体系中需加入ddNTP(有ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP 4种，图1)和dNTP(有dATP、dGTP、dCTP、dTTP 4种，图2)。当以3′－CCATGCAC－5′为模板测定链中碱基A的位置时，子链复制延伸到第三位碱基A时，若与其配对的原料是ddTTP，则子链延伸终止；若与其配对的原料是dTTP，则子链继续延伸；直到第七位的碱基A时，又会出现以上两种配对的可能，这样就能在一个体系中得出多种长度的子链，再依此类推，可以知道模板链上的其他碱基的位置。图3是以该技术的测序原理得到某DNA的电泳图谱。下列说法不正确的是(　　)
A．每个反应体系中应加入相同的模板链、一种ddNTP和四种dNTP
B．ddNTP和dNTP都可脱去两分子磷酸为反应体系提供能量和原料
C．由图3可知复制出的DNA子链的碱基序列是5′—ATCGCATCAT－3′
D．ddNTP的脱氧核糖3′上脱氧导致其无法连接下一个核苷酸5′上的磷酸基团
6．常见PCR只能扩增两引物之间的DNA序列，要扩增已知DNA序列两侧的未知DNA序列，可用反向PCR技术。反向PCR技术扩增的原理如图所示。下列叙述错误的是(　　)
A．酶切阶段，L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列
B．环化阶段，可选用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶
C．图中引物，应选择引物1和引物4，且二者间不能互补配对
D．PCR扩增，将温度调至72 ℃的目的是使引物与模板链结合
7．巢式PCR是指先后用外引物和内引物扩增目的基因的方法。其原理为先以比目的基因大的DNA片段为模板，用外引物(F1、R1)进行扩增，获得大量含目的基因的中间产物，再以扩增后的中间产物为模板，用内引物(F2、R2)扩增目的基因，如图所示。下列说法错误的是(　　)
A．两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链DNA片段
B．第二轮PCR反应能否进行，是对第一轮PCR反应正确性的鉴定
C．由于和两套引物都互补的靶序列较少，该技术可大大提高扩增的特异性
D．如果两套引物一起加入反应体系中，外引物的复性温度应显著低于内引物
8．乳酸菌是乳酸的传统生产菌，但耐酸能力较差，影响产量；酿酒酵母耐酸能力较强，但不产乳酸。研究者将乳酸菌内催化乳酸生成的乳酸脱氢酶基因(LDH)导入酿酒酵母，获得能产生乳酸的酵母工程菌株。图示为通过双酶切构建重组质粒的过程。GTG为原核生物偏好的起始密码子编码序列，ATG为真核生物偏好的起始密码子编码序列。下列说法正确的是(　　)
A．引物2的3′端序列应包含Xba Ⅰ的识别序列
B．重组质粒以能合成尿嘧啶的酵母菌株为受体
C．PCR反应时，缓冲液中一般要添加Ca2＋来激活相关酶
D．引物1的5′端序列应考虑将GTG改为ATG
9．(2024·唐山高三模拟)荧光定量PCR是一种定量计算待测样品的初始模板量的方法。在PCR反应体系中加入特异性的荧光探针，荧光探针可以掺入新合成的DNA链中，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，通过对扩增反应中的荧光强度进行实时检测，最后通过标准曲线定量计算初始模板量。如图为某荧光定量PCR的标准曲线。下列说法错误的是(　　)
A．一定范围内，荧光强度与扩增出的DNA量呈正相关
B．每个反应管内荧光探针的量相同
C．样品甲的初始模板量大于样品乙
D．荧光强度不再变化时PCR反应停止
10．(2024·漳州高三一模)基因定点突变的目的是通过定向改变基因内一个或少数几个碱基来改变多肽链上一个或几个氨基酸。大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR反应即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作为第二轮PCR扩增的大引物，过程如图所示。下列叙述错误的是(　　)
A．第一轮PCR过程中复性所用的温度应低于第二轮PCR复性的温度
B．PCR扩增的定点诱变产物需具备启动子、终止子等结构才能进行转录和翻译
C．第一轮PCR的产物的两条DNA链作为第二轮PCR所用的引物
D．将某蛋白质的第21位组氨酸(CAC)改造成酪氨酸(UAC)，属于蛋白质工程
11．(20分)TGF－β信号通路可通过S蛋白去磷酸化抑制癌细胞增殖，该过程中N蛋白磷酸化后被激活，可使S蛋白发生磷酸化。药物SPD可通过影响R蛋白来增强细胞对TGF－β信号通路的响应。为探索药物SPD治疗癌症的机理，需构建基因表达载体以获得融合蛋白S－HA、N－HA和R－HA。HA是一种短肽，连接在S、N或R蛋白的羧基端(不影响S、N或R的功能)，细胞中只有带HA标签的融合蛋白能与介质上的HA抗体结合，从而分离得到HA标签融合蛋白。
(1)用于PCR扩增S基因的引物5′端分别加入了限制酶Nhe Ⅰ和Hind Ⅲ的识别序列，将扩增后的S基因插入载体上，构建含S－HA融合基因的表达载体，如图1所示，其中“TACCCAT”是HA编码链的起始序列。将重组载体导入细胞后，表达的蛋白有S蛋白的氨基酸序列但没有HA的氨基酸序列，据图1分析，出现该问题的原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
该问题解决后将重组载体再次导入细胞，表达出了融合蛋白，但却不是所需的融合蛋白，据图1分析，可能的原因是_________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)融合蛋白表达成功并分离得到R－HA和磷酸化的S－HA、N－HA。将三种融合蛋白按照图2所示的组合方式分别在缓冲液中进行反应，检测S－HA和N－HA的磷酸化水平，结果如图2所示，推测R蛋白的作用是__________________________________________
________________________________________________________________________。
向细胞培养液中加入不同浓度SPD处理相同时间，通过电泳检测细胞中R蛋白水平，结果如图3所示，推测SPD对R蛋白的影响是__________________________________
________________________________________________________________________。
(3)据以上结果推测，药物SPD治疗癌症的机理是
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案精析
1．D　[Taq DNA聚合酶只能从引物的3′端开始延伸DNA子链，所以两条子链合成一定都是从5′端向3′端延伸，A正确；图示表示复性阶段，该过程的温度与引物的长短、碱基组成等有关，引物长度越长或者GC碱基含量越高，则复性的温度设置越高，B正确；经过5次循环后会产生25＝32(个)DNA，其中双链不等长的DNA有2×5＝10(个)，因此扩增5次后可以产生32－10＝22(个)目标产物，C正确；PCR所需要的引物和原料是一次性添加的，在实验过程中不需要补充，D错误。]
2．B　[若要检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，需要检测是否含有高效启动子序列和HMA3基因序列，应选择的引物组合是①＋②，B符合题意。]
3．A　[PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前都必须进行高压灭菌处理，移液器不需要进行高压灭菌处理，A错误；电泳鉴定PCR产物时加样缓冲液中的指示剂溴酚蓝迁移速度较快，可提示电泳的终止时刻，C正确；PCR所用缓冲液和酶从冰箱拿出之后，应放在冰块上缓慢融化，这样才能不破坏缓冲液中稳定性较差的成分，同样保护酶的活性不被破坏，D正确。]
4．D　[DNA分子带正电还是负电与电泳缓冲液的pH有关，电泳缓冲液的pH大于DNA的等电点时，DNA带负电；电泳缓冲液的pH小于DNA的等电点时，DNA带正电，A正确；扩增时设计的引物过短会导致引物的特异性下降，致使反应结果中出现大量非特异性结合条带，电泳出现多条DNA条带，B正确；双链DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移速率与其大小成反比，较大的分子通过凝胶孔的效率低于较小的分子，因此分子越大，迁移速率越慢，D错误。]
5．C　[双脱氧链终止法是在相同的模板DNA链中分别加入一种ddNTP和四种dNTP的反应体系中进行，由于模板链相同，复制时DNA子链在进行碱基互补配对到T时，用到了对应的ddATP、dATP，若随机配对上的是ddATP，则该链复制停止，若随机配对上的是dATP，则复制继续进行，直到下一个对应的碱基T又会重新出现上述配对的可能，这样在一个体系中就会因碱基T的配对而出现多条长短不同的DNA链；依此类推，分别可以测出模板链碱基是A、C、G每个体系下的短链，再进行凝胶电泳分离，最短的链跑得最快，最早合成，而子链的复制是从5′→3′的方向，所以由图3可以读出子链碱基序列从上到下为3′－ATCGCATCAT－5′，总共需要四个体系，分别测出四个碱基的顺序，A正确，C错误；ddNTP和dNTP同时带有特殊的化学键，且脱去两分子磷酸后可以为DNA复制提供原料，B正确；由图1和图2可知，ddNTP和dNTP的区别在于五碳糖的3号位是否脱氧，ddNTP 3号位为－H，无法与下一个脱氧核苷酸的磷酸基团连接，D正确。]
6．D　[在酶切阶段，已知序列L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列，不然会将已知序列L切断，造成序列识别混乱，A正确；T4 DNA连接酶或E.coli DNA连接酶都可以用来连接黏性末端，因此环化阶段，可选用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶，B正确；PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3′端通过碱基互补配对结合，为保证延伸的是已知序列两侧的未知序列，应选择引物1和引物4，且二者间不能互补配对，C正确；PCR扩增中，将温度调至72 ℃的目的是耐高温的DNA聚合酶将4种脱氧核苷酸根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，D错误。]
7．D　[两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链DNA片段，以便与模板链互补配对，A正确；第二轮PCR使内引物以第一轮PCR产物为模板进行再次扩增，第二轮PCR反应能否进行，是对第一轮PCR反应正确性的鉴定，B正确；由于和两套引物互补的靶序列较少，该技术可大大提高扩增的特异性，将需要的目的基因扩增出来，C正确；如果两套引物一起加入反应体系中，外引物复性温度要明显高于内引物，使外引物先进行反应，D错误。]
8．D　[根据题意可知，含GTG的一端为LDH基因的起始端，为保证通过双酶切以正确方向插入质粒，设计引物1的5′端序列需要包含BamH Ⅰ的识别序列，引物2的5′端序列应包含Xba Ⅰ的识别序列，A错误；结合题意可知，质粒上有作为标记基因的尿嘧啶合成酶基因，所以本过程中重组质粒以不能合成尿嘧啶的酵母菌株为受体，然后在缺乏尿嘧啶的选择培养基上培养，不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株不能生存，导入重组质粒的酿酒酵母菌株因为获得了尿嘧啶合成酶基因可以正常生存，从而起到筛选作用，B错误；真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活，因此，PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2＋，C错误；设计引物1的5′端序列，应考虑将编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，以便目的基因在酵母细胞中更好地表达，D正确。]
9．D　[在PCR反应体系中加入特异性的荧光探针，荧光探针可以掺入新合成的DNA链中，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，因此一定范围内，荧光强度与扩增出的DNA量呈正相关，A正确；最终各反应管的荧光强度一样，说明每个反应管内添加的荧光探针的量相同，B正确；PCR扩增时，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，因此DNA数量越多，荧光强度越大，样品甲达到最大荧光强度所用的时间短于乙，因此样品甲的初始模板量大于样品乙，C正确；荧光强度不再变化可能是因为荧光探针或原料等消耗尽，若为前者，此后PCR反应仍在进行，D错误。]
10．C　[为了使两轮PCR反应在同一支试管中进行，引物设计时应考虑不同的复性温度，第一轮PCR过程中复性所用的温度应低于第二轮PCR复性的温度，A正确；若要使目的基因可以表达出蛋白质，则产物需具备启动子和终止子，诱导基因转录和翻译，B正确；除了第一轮产物作为第二轮PCR扩增的大引物外，第二轮PCR仍需加入另一种侧翼引物，以便进行另一条链的延伸，C错误；将某蛋白质的第21位组氨酸(CAC)改造成酪氨酸(UAC)，应使诱变引物中包含ATG或TAC序列，该过程属于蛋白质工程技术范畴，D正确。]
11．(1)PCR扩增时未在引物上将S基因编码终止密码子的TGA删除，导致融合基因翻译提前终止，未表达出HA的氨基酸序列　HA编码序列的第一个碱基与HA编码序列前的载体的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致HA的mRNA的密码子被错误读取　(2)R蛋白对S蛋白和N蛋白去磷酸化　SPD可促进R蛋白的表达　(3)一方面，SPD通过促进R蛋白表达，对N蛋白去磷酸化后间接降低S蛋白的磷酸化水平，从而抑制癌细胞增殖；另一方面，SPD通过促进R蛋白表达对S蛋白去磷酸化，直接降低S蛋白的磷酸化水平，从而抑制癌细胞增殖
解析　(1)由图1可知，S基因的TGA没有对应的氨基酸，说明其编码的是终止密码子，将重组载体导入细胞后，表达的蛋白有S蛋白的氨基酸序列但没有HA的氨基酸序列，原因是PCR扩增时未在引物上将S基因编码终止密码子的TGA删除，导致融合基因翻译提前终止，未表达出HA的氨基酸序列。由于HA编码链的起始序列是“TACCCAT”，由图可知，HA编码序列的第一个碱基与HA编码序列前的载体的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致HA的mRNA的密码子被错误读取，所以会出现表达出了融合蛋白，却不是所需的融合蛋白的现象。(2)由①与②、③与④的检测结果对比可知，②组加入R－HA后p－S－HA的含量比①少，④组加入R－HA后p－N－HA的含量比③少，由此推测R蛋白对S蛋白和N蛋白有去磷酸化的作用。由图2可知，随着SPD浓度的增加，R蛋白的条带越宽，说明SPD可促进R蛋白的表达。4.基因工程
1～4题每题5分，5～10题每题6分，共56分
1．(2024·江西，12)γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E.coli A，构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E.coli B。下列叙述正确的是(　　)
A．图示表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB
B．E.coli B发酵生产γ-氨基丁酸时，L-谷氨酸钠的作用是供能
C．E.coli A和E.coli B都能高效降解γ-氨基丁酸
D．可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒
2．(2024·郑州高三模拟)自然界中很少出现蓝色的花，天然蓝色花出现的主要原因是花瓣细胞液泡中的花青素在碱性条件下显蓝色。我国科学家利用链霉菌的靛蓝合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)构建了基因表达载体(如图)，通过农杆菌转化法将上述基因导入白玫瑰，在细胞质基质中形成稳定显色的靛蓝。下列相关叙述正确的是(　　)
A．不同限制酶的识别序列都是由6个脱氧核苷酸组成的
B．将idgS基因插入Ti质粒时使用的限制酶是SpeⅠ和BamH Ⅰ
C．将sfp基因插入Ti质粒时使用的限制酶是PmeⅠ和SacⅠ
D．启动子和终止子不表达出蛋白质，都属于基因的调控序列
3．由于PCR扩增出的目的基因末端为平末端，且无合适的限制酶识别序列，需借助中间载体P将目的基因接入载体E。图示为两种载体的结构和相关限制酶的识别序列，下列叙述正确的是(　　)
A．构建重组载体P时，应选择EcoRⅤ进行酶切，再用T4 DNA连接酶连接
B．为了便于该目的基因接入载体E，可用限制酶EcoRⅤ或SmaⅠ切割载体P
C．载体P不能作为基因表达载体，是因为它不含起始密码子和终止密码子
D．若受体细胞表现出抗性基因的相应性状，表明重组载体成功导入受体细胞
4．目的基因和载体如果用同一种限制酶处理，连接时会出现正反接的情况，为鉴定筛选出的表达载体中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR后，结合电泳技术鉴定，图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，其中目的基因为长度300 bp的片段。下列有关说法错误的是(　　)
A．PCR复性温度不宜太低，避免引物错配和模板链形成双链
B．电泳条带迁移的位置和速度与DNA分子的大小和构象有关
C．选取引物甲、丙，扩增出450 bp长度片段时，可以说明目的基因正接
D．选取引物甲、乙，扩增出400 bp长度片段时，可以说明目的基因反接
5．普通棉花中β-甘露糖苷酶基因表达出的GhMnaA2能催化半纤维素降解，使棉纤维长度变短。为了培育长绒棉，科研人员构建了反义GhMnaA2基因表达载体(将正义GhMnaA2基因与载体反向连接)，获得了转基因长绒棉新品种，具体过程如图所示，图中Sma Ⅰ、Not Ⅰ、Hind Ⅲ和BamH Ⅰ代表相应的酶切位点。用Sma Ⅰ和Not Ⅰ切割某正义表达载体可获得3 kb、18 kb、28 kb、59 kb 4种长度的DNA片段。下列叙述正确的是(　　)
A．正义GhMnaA2基因的转录方向是B→A
B．过程①得到的表达载体均为反义表达载体
C．反义GhMnaA2基因可能通过抑制GhMnaA2基因的翻译来保证棉纤维长度
D．用Not Ⅰ切割反义表达载体获得的DNA片段的长度为21 kb和87 kb
6．双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了图示表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析不正确的是(　　)
A．可用农杆菌转化法将构建好的表达载体导入植物细胞
B．为连入GUS基因，需用SalⅠ和SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒
C．在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入该表达载体的微生物受体细胞
D．可通过观察是否出现荧光和蓝色物质确认双向启动子的作用
7．(2024·信阳高三期末)在构建基因表达载体时，传统方法常受限于限制酶识别序列。科研人员研发了新的DNA重组方法：In－Fusion技术。该技术关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列(即同源序列)，然后用In－Fusion酶处理，使同源序列形成黏性末端，最终形成的重组质粒会在受体细胞内形成完整的重组序列，主要操作过程如图所示。下列叙述错误的是(　　)
A．推测In－Fusion酶的作用是识别同源序列、形成黏性末端、连接磷酸二酯键
B．质粒A端和B端的序列不同，可防止目的基因与质粒反向连接及自身环化
C．形成重组质粒时，如果温度远高于50 ℃，黏性末端的碱基更容易互补配对
D．该技术对目的基因进行PCR，需要经历3次循环才能得到两端含引物1和引物2的目的基因
8．(2024·河池高三三模)研究人员将目的基因插入质粒，构建重组质粒的过程如图所示，再将该重组质粒导入大肠杆菌中。由β-半乳糖苷酶基因编码产生的β-半乳糖苷酶可分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈蓝色，否则菌落为白色。下列叙述错误的是(　　)
A．将目的基因插入质粒中时，需要用到的酶有Xho Ⅰ、Nhe Ⅰ和DNA连接酶
B．需要用Ca2＋处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态
C．将按图示构建的重组质粒导入大肠杆菌后，大肠杆菌可正常表达该目的基因
D．在含X-gal的培养基上培养导入了重组质粒的大肠杆菌，可出现蓝色菌落
9．CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理如图1所示。科研人员根据猪的细胞表面抗原基因RAG1的启动子设计了sgRNA1和sgRNA2，并利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了两种基因敲除猪，检测基因敲除猪体内的RAG1基因表达情况如图2所示。下列说法错误的是(　　)
A．CRISPR/Cas9识别目标DNA序列主要与sgRNA序列的特异性相关
B．基因敲除猪的细胞表面抗原减少，器官移植过程中免疫排斥作用减弱
C．两种sgRNA都可引导Cas9在转录水平上减弱RAG1基因的表达
D．据图2可知，用sgRNA2制备的基因敲除猪用于器官移植效果更好
10．(2024·泰安高三一模)Cre/LoxP系统能实现特定基因的敲除(如图1)。把几种荧光蛋白基因和Cre酶能识别并切割的序列(LoxP1和LoxP2)串在一起，构建表达载体T(如图2)。部分荧光蛋白基因会被Cre酶随机“剪掉”，且两个LoxP1之间或两个LoxP2之间的基因，最多会被Cre酶敲除一次，剩下的部分得以表达，随机呈现不同的颜色。下列说法错误的是(　　)
A．Cre酶切下一个待敲除基因的过程，需要破坏四个磷酸二酯键
B．若小鼠细胞含一个表达载体T(不含Cre酶)，其肌肉组织细胞呈红色
C．若小鼠细胞含一个表达载体T(含Cre酶)，其脑组织细胞呈红色或黄色或蓝色
D．若小鼠细胞含两个表达载体T(含Cre酶)，其一个脑组织细胞内可能随机出现两种颜色
11．(14分)(2024·山东，25节选)研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。
LB/RB：T－DNA的边界序列；Kanr：卡那霉素抗性基因；AmpR氨苄青霉素抗性基因。
甲　载体信息
乙　目标基因L部分序列
丙　限制酶识别序列、切割位点及电泳结果
(1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越________(填“高”或“低”)。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有________种。载体信息如图甲所示，经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5′－________－3′和5′－________－3′。
(2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素________筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是________，其中纯合的突变植株是________(填序号)。
12．(14分)(2024·揭阳高三期末)人促红细胞生成素(EPO)是一种可用于治疗肾性贫血的糖蛋白类激素，可用乳腺生物反应器生产EPO。科研人员利用大鼠乳清酸蛋白(WAP)基因上游的调控序列及启动子和3′UTR序列构建了基因表达载体。构建前，科研人员扩增了WAP基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入EPO基因中，以确定WAP基因启动子的具体位置。相关信息如图所示，回答下列问题：
(1)为将扩增后的产物定向插入基因表达载体中，以指导EPO基因的表达，需要在引物末端添加特定的限制酶识别序列。由图中信息可知，在P1～P4末端添加的序列所对应的限制酶是________，在A末端添加的序列所对应的限制酶是________。
(2)将通过PCR处理后的含不同长度的WAP基因上游序列与EPO基因连接，构建成表达载体的过程中，需要________种限制酶切割上述DNA片段。检测转基因雌性大鼠时发现，导入含P1～P3与A扩增产物的个体乳汁中有EPO，而含P4与A扩增产物的个体没有EPO生成。含P4与A扩增产物的个体没有EPO生成的原因是___________________________
________________________________________________________________________。
(3)该实验中，在EPO基因上游插入大鼠WAP基因启动子的理由是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)科研人员不选用大肠杆菌作为该实验的受体细胞，从基因表达的角度分析，其原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
13．(16分)(2024·潍坊高三二模)A蛋白是某种激素合成的关键酶。为鉴定该激素合成的部位及生理作用，某科研团队利用无缝克隆技术将A蛋白结合蛋白基因(P基因)与β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS基因)融合，构建A蛋白检测探针，通过农杆菌转化法导入拟南芥进行实验。相关原理、过程及质粒的结构如图所示，回答下列问题：
注：①bar为抗草甘膦(一种除草剂)基因；TetR为四环素抗性基因；AmpR为氨苄青霉素抗性基因；②F1、F2、R1、R2为引物；③BamH Ⅰ、Sma Ⅰ、Bcl Ⅰ为限制酶。
(1)无缝克隆时所需的酶除T5核酸外切酶外还有__________________。用无缝克隆技术构建GUS－P融合基因的关键是引物R2 5′端序列与________________________互补。
(2)利用双酶切法将融合基因插入Ti质粒，选用的限制酶为______________。扩增融合基因所需的引物R1和F2应选用下列引物组合为________。
①5′-…CTTGGATGAT-3′　②5′-…TAAGTTGTCT-3′　③5′-…ATTCAACAGA-3′　④5′-…TCTGTTGAAT-3′
(3)利用农杆菌转化法将融合基因导入农杆菌、拟南芥细胞的过程中，需要筛选两次，这两次筛选分别是
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)β-葡萄糖苷酸酶可以水解X－Gluc呈蓝色，将转基因拟南芥置于不同培养液中培养一段时间，然后分离不同部位的组织分别加入X－Gluc进行鉴定，结果如表所示：
部位 根 茎 叶
完全培养液 蓝色 浅蓝 浅蓝
缺磷培养液 深蓝 蓝色 浅蓝
分析表明，该激素最主要的合成部位是________，通过实验结果分析该激素的生理作用是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案精析
1．A　[由图示可知，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB，A正确；由题干可知，E.coli B以L 谷氨酸钠为底物高效生产γ 氨基丁酸，因此L 谷氨酸钠为反应底物，而不是起供能作用，B错误；E.coli A和E.coli B均为生产γ 氨基丁酸的菌种，故二者均不能高效降解γ 氨基丁酸，C错误；根据题干及题图给出的信息，无法推断出是否有其他酶能够替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒，D错误。]
2．D　[大多数限制酶的识别序列由6个脱氧核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的脱氧核苷酸组成，A错误；由图可以看出，idgS基因插入Ti质粒的SpeⅠ和SacⅠ两个限制酶识别位点之间，sfp基因插入Ti质粒的启动子1和终止子1之间；将sfp基因插入Ti质粒时，可使用限制酶BamHⅠ，将idgS基因插入Ti质粒时，可用SpeⅠ和SacⅠ进行双酶切割，B、C错误；启动子和终止子不表达出蛋白质，都属于基因的调控序列，D正确。]
3．A　[由于载体E只有产生黏性末端的酶切位点，要使中间载体P接入载体E，同时防止载体E自身环化，需要用两种限制酶分别切割载体E和中间载体P，据图可知，中间载体P和载体E均含有XhoⅠ和PstⅠ酶识别序列，故可选用XhoⅠ和PstⅠ酶进行酶切，载体P的这两种酶识别序列中含有EcoRⅤ识别位点，并且其切割产生平末端，可以用于连接目的基因，SmaⅠ酶虽然也能切割得到平末端，但是其识别位点没有位于XhoⅠ和PstⅠ酶识别位点之间，故不能选择其对中间载体P进行切割，连接平末端用T4 DNA连接酶，A正确，B错误；由图可知，不直接选择P构建表达载体是因为它不含启动子与终止子，C错误；受体细胞表现出抗性基因的相应性状，可能是导入了重组质粒，也可能只导入了空质粒(不含目的基因的质粒)，D错误。]
4．C　[复性是在高温解旋后降低温度让引物与模板链结合，复性温度不宜太低，避免引物错配和模板链形成双链，A正确；电泳条带迁移的位置和速度与DNA分子的大小和构象有关，电泳一段时间后，较大的DNA分子迁移距离小，离加样孔近，而较小的DNA分子迁移距离大，离加样孔远，B正确；由于使用的引物是甲和丙，没有与基因相应位置配对，因此不管目的基因正接还是反接，扩增出的片段均为450 bp，C错误；选取引物甲和乙，扩增出400 bp长度片段时，可以说明目的基因反接，若正接，不能扩增出100 bp的片段，D正确。]
5．C　[由图可知，反义表达载体中，反义GhMnaA2基因转录方向是B→A，则正义GhMnaA2基因的转录方向是A→B，A错误；由于只能由Sma Ⅰ来构建反义表达载体，因此过程①得到的表达载体可能为反义表达载体，也可能为正义表达载体，B错误；反义GhMnaA2基因转录出来的RNA与正常转录的mRNA互补，从而阻止其与核糖体结合，即反义GhMnaA2基因可能通过抑制GhMnaA2基因的翻译来保证棉纤维长度，C正确；用Sma Ⅰ和Not Ⅰ切割正义表达载体可获得3 kb、18 kb、28 kb、59 kb 4种长度的DNA片段，据此判断左侧Sma Ⅰ和Not Ⅰ之间的长度是59 kb，A位置处Sma Ⅰ和Not Ⅰ之间的长度是3 kb，B位置处Sma Ⅰ和Not Ⅰ之间的长度是18 kb，右上角E6位置处Sma Ⅰ和Not Ⅰ之间的长度是28 kb，故用Not Ⅰ切割反义表达载体获得的DNA片段的长度应分别为18＋28＝46(kb)和3＋59＝62(kb)，D错误。]
6．B　[将基因表达载体导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，A正确；如果用SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒时就会破坏LUC基因，B错误；如果成功导入含有壮观霉素抗性基因的基因表达载体，受体细胞就具有抗壮观霉素的能力，在含有壮观霉素的培养基上能生存，因此可以筛选出成功导入表达载体的微生物受体细胞，C正确；双向启动子如果正常表达，就会合成荧光素酶和β 葡萄糖苷酶，二者催化底物分别产生荧光或生成蓝色物质，从而确定双向启动子的作用，D正确。]
7．C　[分析题意可知，本技术的过程是在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列(即同源序列)，然后用In－Fusion酶处理，使同源序列形成黏性末端，最终形成的重组质粒会在受体细胞内形成完整的重组序列，推测In－Fusion酶的作用是识别同源序列、形成黏性末端，并且使目的基因与线性化质粒通过磷酸二酯键连接形成重组质粒，A正确；若用限制酶切割后黏性末端相同，会导致自身环化和反向连接等，质粒A端和B端的序列不同，可防止目的基因与质粒反向连接及自身环化，B正确；重组质粒形成时如果温度远高于50 ℃，氢键不容易形成，黏性末端的碱基不容易互补配对，C错误；根据DNA半保留复制的特点，可知PCR第3轮循环产生的DNA分子存在等长的两条核苷酸链，即仅含引物之间的序列，因此，需要经过3轮循环才能得到两端含引物1和引物2的目的基因，D正确。]
8．C　[目的基因两侧含有限制酶Xho Ⅰ、Nhe Ⅰ的识别序列，将目的基因插入质粒中时，需要用到限制酶Xho Ⅰ、Nhe Ⅰ切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接在一起，A正确；将目的基因导入受体细胞时，需要用Ca2＋处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态，B正确；将按图示构建的重组质粒导入大肠杆菌后，由于目的基因的转录方向和启动子的方向相反，大肠杆菌不能正常表达该目的基因，C错误；在含X gal的培养基上培养导入了重组质粒的大肠杆菌，β 半乳糖苷酶基因编码产生的β 半乳糖苷酶可分解X gal产生蓝色物质，使菌落呈蓝色，D正确。]
9．D　[CRISPR/Cas9识别目标DNA序列主要与sgRNA编码序列有关，即主要与sgRNA序列的特异性相关，A正确；猪的细胞表面抗原会导致器官移植时发生免疫排斥，基因敲除猪的细胞表面抗原减少，器官移植过程中免疫排斥作用减弱，提高了器官移植的成功率，B正确；转录是以DNA的一条链为模板合成RNA的过程，启动子是RNA聚合酶识别与结合的位点，用于驱动基因的转录，科研人员根据猪的细胞表面抗原基因RAG1的启动子设计了sgRNA1和sgRNA2，故两种sgRNA都可引导Cas9在转录水平上减弱RAG1基因的表达，C正确；据图2可知，与对照组相比，用sgRNA1制备的基因敲除猪RAG1基因表达量更低，说明用sgRNA1制备的基因敲除猪用于器官移植效果更好，D错误。]
10．B　[DNA单链上相邻的两个脱氧核苷酸之间通过磷酸二酯键相连，DNA由两条单链螺旋缠绕形成，Cre酶切下一个待敲除基因的过程中，需要切断基因前后两端，因此需要破坏四个磷酸二酯键，A正确；据图可知，小鼠有编码红、黄、蓝荧光蛋白的基因，前端有脑组织特异性表达的启动子，肌肉细胞不会表达颜色基因，故若小鼠细胞含一个表达载体T(不含Cre酶)，其肌肉组织细胞呈无色，B错误；小鼠脑组织细胞内有2个相同表达载体T(含Cre酶)，Cre酶对每个DNA片段随机剪切，因而细胞的颜色由细胞内两种荧光蛋白的颜色叠加而成，故其脑组织细胞可能随机出现两种颜色，D正确。]
11．(1)低　256(或44)　GTTT　CAAT(或CAAT　GTTT)
(2)卡那霉素　SacⅠ　④
解析　(1)单链突出序列NNNN为黏性末端，N代表任意碱基，所以，用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上能得到256种黏性末端。载体上有2个BsaⅠ酶切位点，最后两个空序列为GTTT和CAAT，方向均从5′端到3′端。(2)导入大豆细胞中的T－DNA片段中含有卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。根据图甲可知，目标基因L的目标序列跟突变序列之间只在SacⅠ酶切位点上存在差异，BamHⅠ和EcoRⅠ这两个酶切位点完全相同，根据图丙及题意可知，要以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，并对PCR产物完全酶切后进行电泳从而判断植株含有的是目标序列还是突变序列，因此只能选用限制酶SacⅠ，突变序列存在限制酶SacⅠ酶切位点，但是目标序列没有，因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带会出现两条，目标序列是一条，根据图丙结果可知，只有④为纯合的突变植株。
12．(1)Cla Ⅰ　Mun Ⅰ　(2)4　P4与A扩增产物不含完整的WAP基因的启动子，EPO基因不表达　(3)能使EPO基因在大鼠的乳腺细胞中特异性表达　(4)EPO基因是真核生物的基因，该基因转录出的mRNA无法在大肠杆菌细胞内加工成熟，表达出来的产物不是EPO
解析　(1)需要将WAP基因上游的调控序列及启动子和3′UTR序列与EPO基因相连，则扩增的WAP基因上游的调控序列及启动子和3′UTR序列的5′端不能含有目的基因上的酶切位点，则P1～P4末端添加的序列所对应的限制酶是Cla Ⅰ，WAP基因上游的调控序列及启动子和3′UTR序列的3′端需要与EPO基因相连，但是不能破坏EPO基因序列，也不能破坏WAP基因上游的调控序列及启动子和3′UTR序列，则A末端添加的序列所对应的限制酶是Mun Ⅰ。(2)需要用两种限制酶切割WAP基因上游的调控序列及启动子和3′UTR序列，用两种限制酶切割EPO基因，所以共需要4种限制酶切割上述DNA片段。P4与A扩增产物不含完整的WAP基因的启动子，EPO基因不表达，则含P4与A扩增产物的个体没有EPO生成。(3)启动子具有组织特异性，大鼠WAP基因启动子能使EPO基因在大鼠的乳腺细胞中特异性表达，所以在EPO基因上游插入大鼠WAP基因启动子。(4)EPO基因是真核生物的基因，该基因转录出的mRNA无法在大肠杆菌细胞内被加工成熟，表达出来的产物不是EPO，所以不选用大肠杆菌作为该实验的受体细胞。
13．(1)DNA聚合酶和DNA连接酶　引物F1 3′端序列
(2)Bcl Ⅰ和Sma Ⅰ　①④　(3)先筛选出能在含四环素培养基上生长而不能在含氨苄青霉素培养基上生长的农杆菌，再用含草甘膦的培养基筛选出导入融合基因的拟南芥细胞　(4)根　促进植物对磷元素的吸收
解析　(1)在复性过程中，两个片段的黏性末端可根据互补序列进行配对结合，但由于T5核酸外切酶作用后形成的黏性末端大于互补配对的区段(同源序列)，因此存在缺口，需用DNA聚合酶将缺口补齐，再用DNA连接酶将两个DNA片段连接起来。DNA的两条链是反向平行的，用无缝克隆技术构建GUS－P融合基因的关键是引物R2 5′端序列与引物F1 3′端序列互补。(2)利用双酶切法将融合基因插入Ti质粒的T－DNA区，如果使用BamH Ⅰ，会破坏Ti质粒上的TetR和AmpR，故选择Bcl Ⅰ和Sma Ⅰ。根据融合基因的放大图可知，扩增时以DNA的两条链分别作模板，融合基因的3′端序列可以与④5′ …TCTGTTGAAT 3′配对，5′端序列的互补链可以与①5′ …CTTGGATGAT 3′配对，因此扩增融合基因所需的引物R1和F2应选用的组合为①④。(3)利用农杆菌转化法将融合基因导入农杆菌、拟南芥细胞的过程中，需要筛选两次，这两次筛选分别是先筛选出能在含四环素培养基上生长而不能在含氨苄青霉素培养基上生长的农杆菌，再用含草甘膦的培养基筛选出导入融合基因的拟南芥细胞。(4)β 葡萄糖苷酸酶可以水解X－Gluc呈蓝色，根据表格信息可知，在完全培养液中，只有根呈现蓝色，说明该激素最主要的合成部位是根，与完全培养液相比，在缺磷培养液中，根的颜色变为深蓝，说明该激素的生理作用是促进植物对磷元素的吸收。

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