资源简介

专题八　生物技术与工程
第1练　发酵工程 (主干排查)
(每题4分，共48分)
1．(2023·山东，12)以下是以泡菜坛为容器制作泡菜时的4个处理：①沸盐水冷却后再倒入坛中；②盐水需要浸没全部菜料；③盖好坛盖后，向坛盖边沿的水槽中注满水；④检测泡菜中亚硝酸盐的含量。下列说法正确的是：
A．①主要是为了防止菜料表面的醋酸杆菌被杀死
B．②的主要目的是用盐水杀死菜料表面的杂菌
C．③是为了使气体只能从泡菜坛排出而不能进入
D．④可检测到完整发酵过程中亚硝酸盐含量逐渐降低
2．(2022·湖北，10)关于白酒、啤酒和果酒的生产，下列叙述错误的是：
A．在白酒、啤酒和果酒的发酵初期需要提供一定的氧气
B．白酒、啤酒和果酒酿制的过程也是微生物生长繁殖的过程
C．葡萄糖转化为乙醇所需的酶既存在于细胞质基质，也存在于线粒体
D．生产白酒、啤酒和果酒的原材料不同，但发酵过程中起主要作用的都是酵母菌
3．(2024·湖北，1)制醋、制饴、制酒是我国传统发酵技术。醋酸菌属于好氧型原核生物，常用于食用醋的发酵。下列叙述错误的是：
A．食用醋的酸味主要来源于乙酸
B．醋酸菌不适宜在无氧条件下生存
C．醋酸菌含有催化乙醇氧化成乙酸的酶
D．葡萄糖在醋酸菌中的氧化分解发生在线粒体内
4．(2024·河北，18改编)中国传统白酒多以泥窖为发酵基础，素有“千年老窖万年糟”“以窖养糟，以糟养泥”之说。多年反复利用的老窖池内壁窖泥中含有大量与酿酒相关的微生物。下列叙述错误的是：
A．传统白酒的酿造是在以酿酒酵母为主的多种微生物共同作用下完成的
B．窖池内各种微生物形成了相对稳定的体系，使酿造过程不易污染杂菌
C．从窖泥中分离的酿酒酵母扩大培养时，需在CO2或N2环境中进行
D．从谷物原料发酵形成的酒糟中，可分离出产淀粉酶的微生物
5．(2022·山东，14)青霉菌处在葡萄糖浓度不足的环境中时，会通过分泌青霉素杀死细菌，以保证自身生存所需的能量供应。目前已实现青霉素的工业化生产，关于该生产过程，下列说法错误的是：
A．发酵液中的碳源不宜使用葡萄糖
B．可用深层通气液体发酵技术提高产量
C．选育出的高产菌株经扩大培养后才可接种到发酵罐中
D．青霉素具有杀菌作用，因此发酵罐不需严格灭菌
6．(2022·山东，20改编)啤酒的工业化生产中，大麦经发芽、焙烤、碾磨、糖化、蒸煮、发酵、消毒等工序后，最终过滤、调节、分装。下列说法不正确的是：
A．用赤霉素处理大麦，可使大麦种子无须发芽就能产生α-淀粉酶
B．焙烤是为了利用高温杀死大麦种子胚并进行灭菌
C．糖浆经蒸煮、冷却后需接种酵母菌进行发酵
D．通过转基因技术可减少啤酒酵母双乙酰的生成，缩短啤酒的发酵周期
7．(2023·浙江6月选考，12)小曲白酒清香纯正，以大米、大麦、小麦等为原料，以小曲为发酵剂酿造而成。小曲中所含的微生物主要有好氧型微生物霉菌、兼性厌氧型微生物酵母菌，还有乳酸菌、醋酸菌等细菌。酿酒的原理主要是酵母菌在无氧条件下利用葡萄糖发酵产生酒精。传统酿造工艺流程如图所示。关于小曲白酒的酿造过程，下列叙述错误的是：
A．糖化主要是利用霉菌将淀粉水解为葡萄糖
B．发酵液样品的蒸馏产物有无酒精，可用酸性重铬酸钾溶液检测
C．若酿造过程中酒变酸，则发酵坛密封不严
D．蒸熟并摊晾的原料加入糟醅，立即密封可高效进行酒精发酵
8．(2024·黑吉辽，19改编)某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病，其筛选流程及抗性检测如图。下列操作错误的是：
A．在大量感染香蕉枯萎病的香蕉种植园内，从未感病植株上采集样品
B．将采集的样品充分消毒后，用蒸馏水冲洗，收集冲洗液进行无菌检测
C．将无菌检测合格的样品研磨，经稀释涂布平板法分离得到内生菌的单菌落
D．判断内生菌的抗性效果需比较有无接种内生菌的平板上的病原菌菌斑大小
9．(2024·贵州，14)酵母菌W是一种产果胶酶工程菌。为探究酵母菌W的果胶酶产量与甲醇浓度(Ⅰ<Ⅱ<Ⅲ)的关系，将酵母菌W以相同的初始接种量接种到发酵罐，在适宜条件下培养，结果如图所示。下列叙述正确的是：
A．发酵罐中接种量越高，酵母菌W的K值越大
B．甲醇浓度为Ⅲ时，酵母菌W的果胶酶合成量最高
C．72 h前，三组实验中，甲醇浓度为Ⅱ时，产果胶酶速率最高
D．96 h后，是酵母菌W用于工业生产中收集果胶酶的最佳时期
10．(2021·山东，20)含硫蛋白质在某些微生物的作用下产生硫化氢导致生活污水发臭。硫化氢可以与硫酸亚铁铵结合形成黑色沉淀。为探究发臭水体中甲、乙菌是否产生硫化氢及两种菌的运动能力，用穿刺接种的方法，分别将两种菌接种在含有硫酸亚铁铵的培养基上进行培养，如图所示。若两种菌繁殖速度相等，下列说法错误的是：
A．乙菌的运动能力比甲菌强
B．为不影响菌的运动需选用液体培养基
C．该实验不能比较出两种菌产生硫化氢的量
D．穿刺接种等接种技术的核心是防止杂菌的污染
11．(2021·江苏，18改编)为提高一株石油降解菌的净化能力，将菌涂布于石油为唯一碳源的固体培养基上，以致死率为90%的辐照剂量诱变处理。下列叙述合理的是：
A．将培养基分装于培养皿中后灭菌，可降低培养基污染的概率
B．涂布用的菌浓度应控制在30～300个/mL
C．需通过预实验考察辐射时间对存活率的影响，以确定最佳诱变时间
D．随意挑取培养基上长出的单菌落，给纯化后进行降解效率分析
12．(2023·广东，10)研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌。根据堆肥温度变化曲线(如图)和选择培养基筛选原理来判断，下列最可能筛选到目标菌的条件组合是：
A．a点时取样、尿素氮源培养基
B．b点时取样、角蛋白氮源培养基
C．b点时取样、蛋白胨氮源培养基
D．c点时取样、角蛋白氮源培养基
(每题4分，共52分)
1．(2024·大连高三三模)某生物活动小组分别用3种不同浓度的食盐制作泡菜，该活动小组记录的亚硝酸盐含量与发酵天数的关系如图所示。下列说法正确的是：
A．该实验自变量只有发酵时间，因变量是亚硝酸盐含量
B．检测亚硝酸盐含量的目的是了解乳酸菌的生长状况
C．泡菜腌制过程中，腌制时间过短和食盐用量过少都可能导致亚硝酸盐含量增加
D．泡菜制作时，发酵液表面可能会产生一层白膜，该膜是由乳酸菌繁殖形成的
2．(2024·沧州高三三模)某同学利用图示简易发酵瓶制作橘子酒，下列相关叙述正确的是：
A．橘子汁仅为酵母菌提供了生长所需的水和碳源
B．a管是进气管，b管是出气管，两者的作用不能交换
C．磁力搅拌子搅拌频率应该是发酵早期高，发酵晚期低
D．发酵过程中持续增加的除酒精浓度外，还有温度和酵母菌的数量
3．(2024·贵阳高三一模)酿醋在我国已经有上千年的历史。如图表示我国传统发酵技术酿醋的主要流程，图中麸皮含有多种维生素和钙、铁等无机盐，营养成分适宜，能为制醋补充有效成分。下列叙述错误的是：
A．糯米加入前需进行高压蒸汽灭菌处理
B．加入的菌种①是酵母菌，菌种②是醋酸菌
C．拌麸皮的操作有利于菌种②的繁殖和代谢
D．采用高温浓缩淋出的醋，可以起到杀菌的作用
4．(2024·桂林高三二模)桑葚玫瑰酒既融合了桑葚和玫瑰的果香、花香，又使其营养价值和功能活性增加，极大地满足人们的需求。图1为制作桑葚玫瑰酒的装置图；图2为不同桑葚汁与玫瑰质量比对花色苷含量、酒精度和感官评分(感官评分越高，品质越好)的影响。下列相关叙述错误的是：
A．图1中排气口连接长而弯曲的胶管可避免其他微生物进入装置
B．酿造桑葚玫瑰酒和桑葚玫瑰醋所利用的微生物都能通过线粒体进行有氧呼吸
C．由图2可知，桑葚汁与玫瑰质量比对酒精度影响不大
D．花色苷含量随桑葚汁与玫瑰质量比的增大而降低，质量比为4∶1时酒的感官评分最高
5．(2024·芜湖高三二模)甜米酒又称酒酿，多以糯米为原料拌入酒曲发酵而成。传统家庭手工制作，产品品质不稳定，容易酸败，如图是工业化生产米酒的流程，其中发酵过程分为主发酵和后发酵两个阶段。据图判断下列说法错误的是：
A．性状优良的酵母菌菌种可以从自然界中筛选，也可以通过诱变育种或基因工程育种获得
B．发酵时要严格控制温度、pH和溶解氧等发酵条件，以免影响微生物的生长繁殖和代谢物的形成
C．酵母菌的繁殖在主发酵阶段完成，而大部分糖的分解和代谢物的生成在后发酵阶段完成
D．罐装、封口、杀菌要在限定时间内完成，若时间过长，产品会腐败变酸
6．(2024·南京高三一模)图示为啤酒生产的主要流程，下列相关叙述错误的是：
A．粉碎有利于麦芽中的淀粉与α-淀粉酶充分接触，缩短糖化过程时间
B．麦汁煮沸的主要目的是抑制糖化过程后残留酶的活性同时杀死麦汁中微生物
C．加入酒花的主要目的是提供酵母菌菌种有利于主发酵进行并产生大量酒精
D．主发酵结束后发酵液还要在低温密闭的环境下储存一段时间才能形成成熟啤酒
7．(2024·淄博高三一模)甲醇蛋白是毕赤酵母的胞内蛋白，可用甲醇作碳源来培养毕赤酵母生产甲醇蛋白。毕赤酵母无毒性，甲醇对大多数微生物有毒性。下列叙述错误的是：
A．筛选能高效利用甲醇的毕赤酵母时，培养基应以甲醇为唯一碳源
B．虽然甲醇对多数微生物有毒性，发酵生产甲醇蛋白时也需检测是否有杂菌污染
C．发酵时，发酵温度、培养液的渗透压和pH影响甲醇蛋白产量
D．用作动物饲料时，需从毕赤酵母菌体中分离、纯化甲醇蛋白
8．(2024·六安高三一模)为保障粮食安全，我国科研人员以富含纤维素的农业残渣(秸秆)为原料，利用基因工程改造面包酵母使其表面携带相关酶，可同时高效生产人工淀粉和单细胞蛋白。部分生产工艺如图，下列叙述正确的是：
A．面包酵母的增殖不能促进纤维二糖水解及淀粉合成
B．生产单细胞蛋白时选择26 ℃、pH 5.5的条件为宜
C．本生产过程最宜在不加通气和搅拌的啤酒发酵罐中进行
D．生产前培养基高压蒸汽灭菌的条件可为121 ℃、20 min
9．(2024·沧州高三二模)从海水样本中分离粘质沙雷氏菌时，所用的海生菌肉汤培养基的成分如表所示。下列叙述错误的是：
蛋白胨5.00 g·L－1 MgCl2 5.90 g·L－1 NaHCO3 0.16 g·L－1
酵母提取物1.00 g·L－1 Na2SO4 3.24 g·L－1 KBr 0.08 g·L－1
柠檬酸铁0.10 g·L－1 CaCl2 1.80 g·L－1 SrCl2 34.00 g·L－1
NaCl 19.45 g·L－1 KCl 0.55 g·L－1 H3BO3 22.00 g·L－1
A.蛋白胨只为粘质沙雷氏菌提供碳源，该菌生长需要多种微量元素
B．若从牛肉膏、硫酸铵、硝酸钾中筛选优质氮源，每次应只添加其中一种
C．该培养基应在灭菌前调节pH，其不能用于分离粘质沙雷氏菌获得单菌落
D．该培养基添加了NaCl，具有抑制某些微生物生长的作用，属于选择培养基
10．(2024·南通高三三模)发酵乳中含有丰富的乳酸菌。科研人员利用CaCO3－MRS培养基(蛋白胨10 g、牛肉膏粉5 g、酵母膏粉4 g、葡萄糖20 g、磷酸氢二钾2 g、乙酸钠5 g、柠檬酸三铵2 g、硫酸镁0.2 g、硫酸锰0.05 g、琼脂15 g、碳酸钙25 g)从发酵乳中分离纯化乳酸菌，下列相关叙述正确的是：
A．能为乳酸菌提供碳源的有蛋白胨、牛肉膏粉、酵母膏粉、葡萄糖、琼脂
B．接种前应将发酵乳置于121 ℃、100 kPa条件下处理15～30 min
C．涂布接种后应在培养皿盖上标记接种日期和接种者，并倒置培养
D．挑取溶钙圈直径与菌落直径比值较大的菌落进一步划线纯化
11．(2024·襄阳高三三模)科学家按照图示流程分离牛瘤胃中的纤维素分解菌，并在刚果红培养基平板上筛选到有透明降解圈的菌落。下列叙述正确的是：
A．微生物的纯培养物是指不含有任何代谢废物的微生物培养物
B．空白平板使用前已进行灭菌，接种后未长出菌落的平板可以直接丢弃
C．过程②所使用的接种方法是稀释涂布平板法，统计结果往往比实际值偏低
D．培养基表面均加入一层无菌的石蜡主要是为了防止杂菌的污染
12．(2024·三明高三二模)圆褐固氮菌可独立固定空气中的氮气，且能够分泌生长素。巨大芽孢杆菌可将有机磷降解为可溶性磷。二者组合可将有机厨余垃圾迅速分解为水和二氧化碳。为制备分解有机厨余垃圾的微生物菌剂，某科研小组对两种菌种进行了最佳接种比例的探究实验，得出如图实验结果。下列说法错误的是：
A．圆褐固氮菌和巨大芽孢杆菌在生长过程中都需要氮源
B．统计活菌数量可采用稀释涂布平板法
C．处理该厨余垃圾，两种菌种的最佳接种比例为1∶2
D．两种菌种的组合菌剂还可制成微生物肥料施用到土壤中，提高农作物的产量
13．(2024·南通高三二模)黑曲霉是一种丝状真菌，其代谢产物广泛应用于食品加工等领域。食品工业以红薯粉为原料经黑曲霉发酵获得柠檬酸，图示为生产柠檬酸的简要流程图。下列叙述正确的是：
A．黑曲霉与生产果醋时所用主要微生物的代谢类型相同
B．将菌种接种至a培养基时，浸泡在酒精中的涂布器使用前需在火焰上灼烧
C．若发酵罐c中的原料为大豆粉，可利用黑曲霉水解大豆中的淀粉制成酱油
D．分离、提纯获得微生物细胞本身或其代谢产物是发酵工程的中心环节
答案精析
真题演练
1．C　[沸盐水冷却后再倒入坛中，盐水煮沸是为了杀灭杂菌，冷却之后使用是为了保证乳酸菌等微生物的生命活动不受影响，A错误；盐水需要浸没全部菜料，制造无氧环境，有利于乳酸菌的无氧呼吸，B错误；盖好坛盖后，向坛盖边沿的水槽中注满水，是为了隔绝空气、防止杂菌污染等，C正确；腌制泡菜过程中亚硝酸盐的含量先增多后减少，D错误。]
2．C　[在白酒、啤酒和果酒的发酵初期需要提供一定的氧气，让酵母菌大量繁殖，再进行酒精发酵，A正确；白酒、啤酒和果酒酿制的过程也是微生物生长繁殖的过程，如发酵初期酵母菌大量繁殖，B正确；葡萄糖转化为乙醇的过程发生在细胞质基质中，所需的酶存在于细胞质基质中，不存在于线粒体，C错误；生产白酒一般使用高粱，啤酒一般使用麦芽，果酒则使用对应的水果，但在发酵过程中都主要依赖酵母菌产生酒精，D正确。]
3．D　[醋酸菌是好氧型细菌，不适宜在无氧的条件下生存，B正确；制醋时，在缺失糖源的情况下，醋酸菌将乙醇转化为乙醛，再将乙醛转化为乙酸，因此醋酸菌体内含有催化乙醇氧化成乙酸的酶，C正确；醋酸菌属于细菌，没有核膜包被的细胞核和众多细胞器，因此没有线粒体，且葡萄糖的氧化分解不发生在线粒体内，D错误。]
4．C　[白酒的酿造主要依靠酿酒酵母，由于窖泥中含有大量与酿酒相关的微生物，故传统白酒的酿造是在以酿酒酵母为主的多种微生物共同作用下完成的，A正确；窖池内各种微生物形成了相对稳定的体系，且酿造过程产生的酒精也会抑制杂菌的生长与繁殖，使酿造过程不易污染杂菌，B正确；酵母菌是兼性厌氧菌，与无氧呼吸相比，细胞有氧呼吸产生的能量更多，更能满足酵母菌大量繁殖时的需求，因此，对分离的酿酒酵母扩大培养时需要在有氧的条件下进行，C错误；谷物原料如高粱、玉米、大米等富含淀粉，用谷物原料发酵形成酒糟的过程中，有淀粉分解形成糖浆的过程，因此从谷物原料发酵形成的酒糟中可分离出产淀粉酶的微生物，D正确。]
5．D　[青霉菌处于葡萄糖浓度不足的环境中会通过分泌青霉素杀死细菌；提供相同含量的碳源，葡萄糖溶液单位体积中溶质微粒较多，会导致细胞失水，发酵液中的碳源不宜使用葡萄糖，乳糖是二糖，可被水解为半乳糖和葡萄糖，是青霉菌生长的最佳碳源，可以被青霉菌缓慢利用而维持青霉素分泌的有利条件，A正确；青霉菌的代谢类型为异养需氧型，可用深层通气液体发酵技术提高产量，B正确；选育出的高产青霉素菌株经扩大培养纯化后，才可接种到发酵罐中进行工业化生产，C正确；为了防止细菌、其他真菌等微生物的污染，获得纯净的青霉素，发酵罐仍需严格灭菌，D错误。]
6．B　[赤霉素能促进种子的萌发，据此可推测若用赤霉素处理大麦，可诱导α 淀粉酶相关基因的表达，促进α 淀粉酶的合成，进而使大麦种子无须发芽就能产生α 淀粉酶，A正确；焙烤可以杀死大麦种子的胚，但不使淀粉酶失活，没有进行灭菌，B错误；糖浆经蒸煮(产生风味组分、终止酶的进一步作用，并对糖浆灭菌)、冷却后再接种酵母菌进行发酵，防止高温杀死菌种，C正确；转基因技术已被用来减少啤酒酵母双乙酰的生成，缩短啤酒的发酵周期，属于转基因技术在微生物领域的应用，D正确。]
7．D　[由于酿酒酵母不能直接利用淀粉发酵产生酒精(乙醇)，故糖化过程主要是利用霉菌分泌的淀粉酶将淀粉分解为葡萄糖，以供发酵利用，A正确；发酵液样品的蒸馏产物有无酒精，可用酸性重铬酸钾溶液检测，若存在酒精，则酒精与酸性的重铬酸钾反应呈灰绿色，B正确；酿造过程应在无氧条件下进行，若密封不严，会导致醋酸菌在有氧条件下发酵产生醋酸而使酒变酸，C正确；蒸熟并摊晾的原料需要冷却后才可加入糟醅，以免杀死菌种，且需要在有氧条件下培养一段时间，让酵母菌大量繁殖，此后再密封进行酒精发酵，D错误。]
8．B　[由题干信息“某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病”可知，在大量感染香蕉枯萎病的香蕉种植园内，从未感病植株上采集样品，A正确；获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染；将采集的样品充分消毒后，用无菌水冲洗，收集冲洗液进行无菌检测，B错误；由题图可知，样品研磨后进行了稀释涂布，可见将无菌检测合格的样品研磨，经稀释涂布平板法分离得到内生菌的单菌落，C正确；由题图抗性检测可知，判断内生菌的抗性效果需设置对照组和实验组，对照组不接种内生菌得到病原菌菌斑，实验组接种内生菌得到病原菌菌斑，然后比较对照组和实验组的菌斑大小，实验组病原菌菌斑越小表明内生菌抗性效果越好，D正确。]
9．C　[K值为一定的环境条件下所能维持的种群最大数量，因此K值的大小与资源和空间等因素有关，与接种量无关，A错误；由图可知，甲醇浓度为Ⅱ时，酵母菌W的果胶酶合成量最高，B错误；72 h前，三组实验中，曲线Ⅱ的斜率最大，即甲醇浓度为Ⅱ时，产果胶酶速率最高，C正确；96 h后，酵母菌W的果胶酶产量下降，不是收集果胶酶的最佳时期，D错误。]
10．B　[从图中可以看出甲菌在试管中分布范围小于乙菌，说明了乙菌的运动能力比甲菌强，A正确；为不影响菌的运动需选用半固体培养基，B错误；该实验可以根据黑色沉淀的多少初步比较细菌产生硫化氢的能力，但不能测定产生硫化氢的量，C正确；微生物接种技术的核心是防止杂菌的污染，D正确。]
11．C　[培养基应先灭菌再分装于培养皿中，A不合理；涂布时所用菌液一般为0.1 mL，平板上的菌落应介于30～300个，涂布用的菌浓度应控制在300～3 000个/mL，B不合理；需通过预实验考察辐射时间对存活率的影响，再进行正式实验，以确定最佳诱变时间，C合理；石油降解菌能分解石油获得碳源，形成菌落，挑取培养基上长出的较大单菌落，经纯化后进行降解效率分析，以获得能高效降解石油的菌种，D不合理。]
12．D　[研究目的是筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌，因此目标菌既要耐高温，又要能够高效降解角蛋白，所以应在c点取样，并且用角蛋白氮源培养基进行选择培养，D正确。]
模拟预测
1．C　[该实验的自变量有发酵时间、食盐溶液的浓度，因变量是亚硝酸盐含量，A错误；泡菜在腌制过程中会有亚硝酸盐产生，膳食中的亚硝酸盐一般不会危害人体健康，但如果人体摄入过量会发生中毒，甚至死亡，所以检测亚硝酸盐含量的目的是使亚硝酸盐含量在安全范围，保证食品安全，B错误；随着腌制时间的延长，亚硝酸盐含量的变化趋势是先增加后减少，且在本实验中5%的食盐溶液处理效果比3%的食盐溶液处理效果好，所以腌制时间过短和食盐用量过少都可能导致亚硝酸盐含量增加，C正确；该膜是由酵母菌繁殖形成的，D错误。]
2．C　[橘子汁含有丰富的营养物质，可为酵母菌的生长提供水、无机盐、碳源和氮源等，A错误；a管没有插入液面，应为出气管，如果出气管插入发酵液，排放CO2时会因瓶内压力大而导致发酵液溢出，b管是进气管，插入发酵液中可以增加发酵液的溶氧量，使酵母菌在前期能进行有氧呼吸而大量繁殖，B错误；酒精发酵过程中酵母菌的数量并非持续增加，发酵前期和中期酵母菌的数量增长曲线基本呈“S”形，到了发酵后期，营养物质的不断减少、酒精浓度的增加都会抑制酵母菌的生长，酵母菌数量会不断减少，D错误。]
3．A　[糯米粉碎后还需蒸煮，故加入前只需要洗净控干处理，不需要灭菌，A错误；酵母菌在无氧条件下能进行酒精发酵，醋酸菌可用于制作各种风味的醋，所以加入的菌种①是酵母菌，菌种②是醋酸菌，B正确；麸皮能为制醋补充有效成分，拌麸皮的操作有利于提升发酵材料中氧气含量，有利于菌种②(醋酸菌)的繁殖和代谢，C正确；高温可以起到杀菌的作用，因此采用高温浓缩淋出的醋可以起到杀菌作用，D正确。]
4．B　[桑葚玫瑰醋利用的菌种是醋酸菌，醋酸菌是原核生物，无线粒体，B错误；由图2可知，随着桑葚汁与玫瑰质量比增大，酒精度几乎没有变化，说明桑葚汁与玫瑰质量比对酒精度影响不大，C正确。]
5．C　[发酵工程的第一步就是选育菌种，性状优良的菌种可以从自然界中筛选，也可以通过诱变育种或基因工程育种获得，A正确；发酵罐内发酵是发酵工程的中心环节，要严格控制温度、pH和溶解氧等发酵条件，环境条件的改变不仅会影响微生物的生长繁殖，而且会影响微生物代谢物的形成，B正确；酵母菌的繁殖、大部分糖的分解和代谢物的生成都在主发酵阶段完成，C错误；罐装、封口、杀菌要在限定时间内完成，若时间过长，容易受杂菌污染，产品会腐败变酸，D正确。]
6．C　[糖化的目的是将麦芽中的淀粉等有机物水解为小分子物质，形成糖浆，故粉碎过程有利于淀粉与α 淀粉酶的充分接触，缩短糖化过程所用的时间，A正确；麦汁煮沸的主要目的是使淀粉酶失活，终止酶的进一步作用，并对糖浆灭菌，B正确；加入酒花的主要目的是赋予啤酒特殊的香味，赋予啤酒爽快的苦味，增加防腐能力，提高啤酒的非生物稳定性，防止煮沸时窜味，C错误；主发酵结束后，发酵液还不适合饮用，要在低温、密闭的环境下储存一段时间进行后发酵，这样才能形成澄清、成熟的啤酒，D正确。]
7．D
8．D　[由图可知，面包酵母表面携带促进纤维二糖水解的酶和促进淀粉合成的酶，因此其增殖能促进纤维二糖水解及淀粉合成，A错误；生产单细胞蛋白就是使面包酵母增殖，酵母增殖的适宜温度为28～32 ℃，适宜pH为4.0～5.0，B错误；由题意可知，本生产过程是为了高效生产人工淀粉和单细胞蛋白，需要使面包酵母增殖，应当在有氧环境下进行，C错误；高压蒸汽灭菌是在121 ℃、100 kPa条件下处理15～30 min，将培养基彻底灭菌，以避免培养基上的微生物影响实验结果，D正确。]
9．A　[培养基中的蛋白胨可为粘质沙雷氏菌提供碳源、氮源和维生素等，A错误；筛选最佳氮源时，培养基中每次应只添加牛肉膏、硫酸铵、硝酸钾中的一种，B正确；该培养基应在灭菌前调节pH，该培养基没有添加琼脂，是液体培养基，不能分离出粘质沙雷氏菌的单菌落，C正确；选择培养基是允许特定种类的微生物生长、同时抑制或阻止其他微生物生长的培养基，该培养基中添加了NaCl，能抑制某些不耐盐的微生物的生长，属于选择培养基，D正确。]
10．D　[琼脂作为凝固剂，不会被微生物利用，不能为乳酸菌提供碳源，A错误；接种前高压蒸汽灭菌处理，会杀死发酵乳中的乳酸菌，这样就无法分离纯化乳酸菌，B错误；涂布接种后应在培养皿底部标记接种日期和接种者，并倒置培养，C错误。]
11．C　[由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，指的是没有被杂菌污染的微生物，而不是不含有代谢废物的微生物培养物，A错误；接种后未长出菌落的培养基，也可能有少量微生物，为避免污染环境，丢弃前要进行灭菌处理，B错误；过程②所使用的接种方法是稀释涂布平板法，如果使用稀释涂布平板法统计纤维素分解菌的种群密度，由于两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，所得结果往往比实际值偏低，C正确；反刍动物的瘤胃中不含氧气，其中存在的纤维素分解菌适宜在无氧条件下生存和繁殖，因此培养基表面均加入一层无菌的石蜡主要是为了保证培养的无氧环境，D错误。]
12．C　[微生物的生长一般都需要水、碳源、氮源和无机盐等营养物质，圆褐固氮菌的氮源来自空气中的氮气，巨大芽孢杆菌的氮源来自培养基，A正确；实验的因变量是有机垃圾的分解量(以二者的有效菌落数为指标)，接种量比例为1∶2的有效菌落数小于接种量为1∶1的有效菌落数，故接种量比例1∶1时分解有机厨余垃圾的能力强，C错误；植物在生长的过程中要吸收一定量的含N、P的无机盐和二氧化碳等营养物质，圆褐固氮菌可独立固定空气中的氮气，且能够分泌生长素，巨大芽孢杆菌可将有机磷降解为可溶性磷，二者能为植物提供含N、P的无机盐和二氧化碳等营养物质，故两菌种的组合菌剂还可制成微生物肥料施用到土壤中，提高农作物的产量，D正确。]
13．A　[由培养时需要振荡培养可知，黑曲霉的异化作用类型为需氧型，因此其代谢类型为异养需氧型，制作果醋利用的是醋酸菌，它的代谢类型也为异养需氧型，A正确；由图可知，a培养基中是平板划线法得到的菌落，将菌种接种至a培养基时，应将接种环在火焰上灼烧灭菌，B错误；大豆中的主要成分是蛋白质，若以大豆为主要原料，可利用黑曲霉产生蛋白酶，将原料中的蛋白质水解成小分子的肽和氨基酸，然后经淋洗、调制制成酱油产品，C错误；发酵工程的中心环节是发酵罐内发酵，不是分离、提纯获得微生物细胞本身或其代谢产物，D错误。](共60张PPT)
专题八　
第1练
发酵工程
1.(2023·山东，12)以下是以泡菜坛为容器制作泡菜时的4个处理：①沸盐水冷却后再倒入坛中；②盐水需要浸没全部菜料；③盖好坛盖后，向坛盖边沿的水槽中注满水；④检测泡菜中亚硝酸盐的含量。下列说法正确的是
A.①主要是为了防止菜料表面的醋酸杆菌被杀死
B.②的主要目的是用盐水杀死菜料表面的杂菌
C.③是为了使气体只能从泡菜坛排出而不能进入
D.④可检测到完整发酵过程中亚硝酸盐含量逐渐降低
真题演练
PART ONE
√
沸盐水冷却后再倒入坛中，盐水煮沸是为了杀灭杂菌，冷却之后使用是为了保证乳酸菌等微生物的生命活动不受影响，A错误；
盐水需要浸没全部菜料，制造无氧环境，有利于乳酸菌的无氧呼吸，B错误；
盖好坛盖后，向坛盖边沿的水槽中注满水，是为了隔绝空气、防止杂菌污染等，C正确；
腌制泡菜过程中亚硝酸盐的含量先增多后减少，D错误。
2.(2022·湖北，10)关于白酒、啤酒和果酒的生产，下列叙述错误的是
A.在白酒、啤酒和果酒的发酵初期需要提供一定的氧气
B.白酒、啤酒和果酒酿制的过程也是微生物生长繁殖的过程
C.葡萄糖转化为乙醇所需的酶既存在于细胞质基质，也存在于线粒体
D.生产白酒、啤酒和果酒的原材料不同，但发酵过程中起主要作用的都
是酵母菌
√
在白酒、啤酒和果酒的发酵初期需要提供一定的氧气，让酵母菌大量繁殖，再进行酒精发酵，A正确；
白酒、啤酒和果酒酿制的过程也是微生物生长繁殖的过程，如发酵初期酵母菌大量繁殖，B正确；
葡萄糖转化为乙醇的过程发生在细胞质基质中，所需的酶存在于细胞质基质中，不存在于线粒体，C错误；
生产白酒一般使用高粱，啤酒一般使用麦芽，果酒则使用对应的水果，但在发酵过程中都主要依赖酵母菌产生酒精，D正确。
3.(2024·湖北，1)制醋、制饴、制酒是我国传统发酵技术。醋酸菌属于好氧型原核生物，常用于食用醋的发酵。下列叙述错误的是
A.食用醋的酸味主要来源于乙酸
B.醋酸菌不适宜在无氧条件下生存
C.醋酸菌含有催化乙醇氧化成乙酸的酶
D.葡萄糖在醋酸菌中的氧化分解发生在线粒体内
√
醋酸菌是好氧型细菌，不适宜在无氧的条件下生存，B正确；
制醋时，在缺失糖源的情况下，醋酸菌将乙醇转化为乙醛，再将乙醛转化为乙酸，因此醋酸菌体内含有催化乙醇氧化成乙酸的酶，C正确；
醋酸菌属于细菌，没有核膜包被的细胞核和众多细胞器，因此没有线粒体，且葡萄糖的氧化分解不发生在线粒体内，D错误。
4.(2024·河北，18改编)中国传统白酒多以泥窖为发酵基础，素有“千年老窖万年糟”“以窖养糟，以糟养泥”之说。多年反复利用的老窖池内壁窖泥中含有大量与酿酒相关的微生物。下列叙述错误的是
A.传统白酒的酿造是在以酿酒酵母为主的多种微生物共同作用下完成的
B.窖池内各种微生物形成了相对稳定的体系，使酿造过程不易污染杂菌
C.从窖泥中分离的酿酒酵母扩大培养时，需在CO2或N2环境中进行
D.从谷物原料发酵形成的酒糟中，可分离出产淀粉酶的微生物
√
白酒的酿造主要依靠酿酒酵母，由于窖泥中含有大量与酿酒相关的微生物，故传统白酒的酿造是在以酿酒酵母为主的多种微生物共同作用下完成的，A正确；
窖池内各种微生物形成了相对稳定的体系，且酿造过程产生的酒精也会抑制杂菌的生长与繁殖，使酿造过程不易污染杂菌，B正确；
酵母菌是兼性厌氧菌，与无氧呼吸相比，细胞有氧呼吸产生的能量更多，更能满足酵母菌大量繁殖时的需求，因此，对分离的酿酒酵母扩大培养时需要在有氧的条件下进行，C错误；
谷物原料如高粱、玉米、大米等富含淀粉，用谷物原料发酵形成酒糟的过程中，有淀粉分解形成糖浆的过程，因此从谷物原料发酵形成的酒糟中可分离出产淀粉酶的微生物，D正确。
5.(2022·山东，14)青霉菌处在葡萄糖浓度不足的环境中时，会通过分泌青霉素杀死细菌，以保证自身生存所需的能量供应。目前已实现青霉素的工业化生产，关于该生产过程，下列说法错误的是
A.发酵液中的碳源不宜使用葡萄糖
B.可用深层通气液体发酵技术提高产量
C.选育出的高产菌株经扩大培养后才可接种到发酵罐中
D.青霉素具有杀菌作用，因此发酵罐不需严格灭菌
√
青霉菌处于葡萄糖浓度不足的环境中会通过分泌青霉素杀死细菌；提供相同含量的碳源，葡萄糖溶液单位体积中溶质微粒较多，会导致细胞失水，发酵液中的碳源不宜使用葡萄糖，乳糖是二糖，可被水解为半乳糖和葡萄糖，是青霉菌生长的最佳碳源，可以被青霉菌缓慢利用而维持青霉素分泌的有利条件，A正确；
青霉菌的代谢类型为异养需氧型，可用深层通气液体发酵技术提高产量，B正确；
选育出的高产青霉素菌株经扩大培养纯化后，才可接种到发酵罐中进行工业化生产，C正确；
为了防止细菌、其他真菌等微生物的污染，获得纯净的青霉素，发酵罐仍需严格灭菌，D错误。
6.(2022·山东，20改编)啤酒的工业化生产中，大麦经发芽、焙烤、碾磨、糖化、蒸煮、发酵、消毒等工序后，最终过滤、调节、分装。下列说法不正确的是
A.用赤霉素处理大麦，可使大麦种子无须发芽就能产生α-淀粉酶
B.焙烤是为了利用高温杀死大麦种子胚并进行灭菌
C.糖浆经蒸煮、冷却后需接种酵母菌进行发酵
D.通过转基因技术可减少啤酒酵母双乙酰的生成，缩短啤酒的发酵周期
√
赤霉素能促进种子的萌发，据此可推测若用赤霉素处理大麦，可诱导α-淀粉酶相关基因的表达，促进α-淀粉酶的合成，进而使大麦种子无须发芽就能产生α-淀粉酶，A正确；
焙烤可以杀死大麦种子的胚，但不使淀粉酶失活，没有进行灭菌，B错误；
糖浆经蒸煮(产生风味组分、终止酶的进一步作用，并对糖浆灭菌)、冷却后再接种酵母菌进行发酵，防止高温杀死菌种，C正确；
转基因技术已被用来减少啤酒酵母双乙酰的生成，缩短啤酒的发酵周期，属于转基因技术在微生物领域的应用，D正确。
7.(2023·浙江6月选考，12)小曲白酒清香纯正，以大米、大麦、小麦等为原料，以小曲为发酵剂酿造而成。小曲中所含的微生物主要有好氧型微生物霉菌、兼性厌氧型微生物酵母菌，还有乳酸菌、醋酸菌等细菌。酿酒的原理主要是酵母菌在无氧条件下利用葡萄糖发酵产生酒精。传统酿造工艺流程如图所示。关于小曲白酒的酿造过程，下列叙述错误的是
A.糖化主要是利用霉菌将淀粉水解为葡萄糖
B.发酵液样品的蒸馏产物有无酒精，可用酸性重铬酸钾溶液检测
C.若酿造过程中酒变酸，则发酵坛密封不严
D.蒸熟并摊晾的原料加入糟醅，立即密封可高效进行酒精发酵
√
由于酿酒酵母不能直接利用淀粉发酵产生酒精(乙醇)，故糖化过程主要是利用霉菌分泌的淀粉酶将淀粉分解为葡萄糖，以供发酵利用，A正确；
发酵液样品的蒸馏产物有无酒精，可用酸性重铬酸钾溶液检测，若存在酒精，则酒精与酸性的重铬酸钾反应呈灰绿色，B正确；
酿造过程应在无氧条件下进行，若密封不严，会导致醋酸菌在有氧条件下发酵产生醋酸而使酒变酸，C正确；
蒸熟并摊晾的原料需要冷却后才可加入糟醅，以免杀死菌种，且需要在有氧条件下培养一段时间，让酵母菌大量繁殖，此后再密封进行酒精发酵，D错误。
A.在大量感染香蕉枯萎病的香蕉种植园内，从未感病植株上采集样品
B.将采集的样品充分消毒后，用蒸馏水冲洗，收集冲洗液进行无菌检测
C.将无菌检测合格的样品研磨，经稀释涂布平板法分离得到内生菌的单菌落
D.判断内生菌的抗性效果需比较有无接种内生菌的平板上的病原菌菌斑大小
8.(2024·黑吉辽，19改编)某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病，其筛选流程及抗性检测如图。下列操作错误的是
√
由题干信息“某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病”可知，在大量感染香蕉枯萎病的香蕉种植园内，从未感病植株上采集样品，A正确；
获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染；将采集的样品充分消毒后，用无菌水冲洗，收集冲洗液进行无菌检测，B错误；
由题图可知，样品研磨后进行了稀释涂布，可见将无菌检测合格的样品研磨，经稀释涂布平板法分离得到内生菌的单菌落，C正确；
由题图抗性检测可知，判断内生菌的抗性效果需设置对照组和实验组，对照组不接种内生菌得到病原菌菌斑，实验组接种内生菌得到病原菌菌斑，然后比较对照组和实验组的菌斑大小，实验组病原菌菌斑越小表明内生菌抗性效果越好，D正确。
9.(2024·贵州，14)酵母菌W是一种产果胶酶工程菌。为探究酵母菌W的果胶酶产量与甲醇浓度(Ⅰ<Ⅱ<Ⅲ)的关系，将酵母菌W以相同的初始接种量接种到发酵罐，在适宜条件下培养，结果如图所示。下列叙述正确的是
A.发酵罐中接种量越高，酵母菌W的K值越大
B.甲醇浓度为Ⅲ时，酵母菌W的果胶酶合成量最高
C.72 h前，三组实验中，甲醇浓度为Ⅱ时，产果胶
酶速率最高
D.96 h后，是酵母菌W用于工业生产中收集果胶酶的最佳时期
√
K值为一定的环境条件下所能维持的种群最大数量，因此K值的大小与资源和空间等因素有关，与接种量无关，A错误；
由图可知，甲醇浓度为Ⅱ时，酵母菌W的果胶酶合成量最高，B错误；
72 h前，三组实验中，曲线Ⅱ的斜率最大，即甲醇浓度为Ⅱ时，产果胶酶速率最高，C正确；
96 h后，酵母菌W的果胶酶产量下降，不是收集果胶酶的最佳时期，D错误。
10.(2021·山东，20)含硫蛋白质在某些微生物的作用下产生硫化氢导致生活污水发臭。硫化氢可以与硫酸亚铁铵结合形成黑色沉淀。为探究发臭水体中甲、乙菌是否产生硫化氢及两种菌的运动能力，用穿刺接种的方法，分别将两种菌接种在含有硫酸亚铁铵的培养基上进行培养，如图所示。若两种菌繁殖速度相等，下列说法错误的是
A.乙菌的运动能力比甲菌强
B.为不影响菌的运动需选用液体培养基
C.该实验不能比较出两种菌产生硫化氢的量
D.穿刺接种等接种技术的核心是防止杂菌的污染
√
从图中可以看出甲菌在试管中分布范围小于乙菌，说明了乙菌的运动能力比甲菌强，A正确；
为不影响菌的运动需选用半固体培养基，B错误；
该实验可以根据黑色沉淀的多少初步比较细菌产生硫化氢的能力，但不能测定产生硫化氢的量，C正确；
微生物接种技术的核心是防止杂菌的污染，D正确。
11.(2021·江苏，18改编)为提高一株石油降解菌的净化能力，将菌涂布于石油为唯一碳源的固体培养基上，以致死率为90%的辐照剂量诱变处理。下列叙述合理的是
A.将培养基分装于培养皿中后灭菌，可降低培养基污染的概率
B.涂布用的菌浓度应控制在30～300个/mL
C.需通过预实验考察辐射时间对存活率的影响，以确定最佳诱变时间
D.随意挑取培养基上长出的单菌落，给纯化后进行降解效率分析
√
培养基应先灭菌再分装于培养皿中，A不合理；
涂布时所用菌液一般为0.1 mL，平板上的菌落应介于30～300个，涂布用的菌浓度应控制在300～3 000个/mL，B不合理；
需通过预实验考察辐射时间对存活率的影响，再进行正式实验，以确定最佳诱变时间，C合理；
石油降解菌能分解石油获得碳源，形成菌落，挑取培养基上长出的较大单菌落，经纯化后进行降解效率分析，以获得能高效降解石油的菌种，D不合理。
12.(2023·广东，10)研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌。根据堆肥温度变化曲线(如图)和选择培养基筛选原理来判断，下列最可能筛选到目标菌的条件组合是
A.a点时取样、尿素氮源培养基
B.b点时取样、角蛋白氮源培养基
C.b点时取样、蛋白胨氮源培养基
D.c点时取样、角蛋白氮源培养基
√
研究目的是筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌，因此目标菌既要耐高温，又要能够高效降解角蛋白，所以应在c点取样，并且用角蛋白氮源培养基进行选择培养，D正确。
1.(2024·大连高三三模)某生物活动小组分别用3种不同浓度的食盐制作泡菜，该活动小组记录的亚硝酸盐含量与发酵天数的关系如图所示。下列说法正确的是
A.该实验自变量只有发酵时间，因变量是亚硝酸盐含量
B.检测亚硝酸盐含量的目的是了解乳酸菌的生长状况
C.泡菜腌制过程中，腌制时间过短和食盐用量过少都可
能导致亚硝酸盐含量增加
D.泡菜制作时，发酵液表面可能会产生一层白膜，该膜
是由乳酸菌繁殖形成的
模拟预测
PART TWO
√
该实验的自变量有发酵时间、食盐溶液的浓度，因变量是亚硝酸盐含量，A错误；
泡菜在腌制过程中会有亚硝酸盐产生，膳食中的亚硝酸盐一般不会危害人体健康，但如果人
体摄入过量会发生中毒，甚至死亡，所以检测亚硝酸盐含量的目的是使亚硝酸盐含量在安全范围，保证食品安全，B错误；
随着腌制时间的延长，亚硝酸盐含量的变化趋势是先增加后减少，且在本实验中5%的食盐溶液处理效果比3%的食盐溶液处理效果好，所以腌制时间过短和食盐用量过少都可能导致亚硝酸盐含量增加，C正确；
该膜是由酵母菌繁殖形成的，D错误。
2.(2024·沧州高三三模)某同学利用图示简易发酵瓶制作橘子酒，下列相关叙述正确的是
A.橘子汁仅为酵母菌提供了生长所需的水和碳源
B.a管是进气管，b管是出气管，两者的作用不能交换
C.磁力搅拌子搅拌频率应该是发酵早期高，发酵晚期低
D.发酵过程中持续增加的除酒精浓度外，还有温度和酵母菌的数量
√
橘子汁含有丰富的营养物质，可为酵母菌的生长提供水、无机盐、碳源和氮源等，A错误；
a管没有插入液面，应为出气管，如果出气管插入发酵液，排放CO2时会因瓶内压力大而导
致发酵液溢出，b管是进气管，插入发酵液中可以增加发酵液的溶氧量，使酵母菌在前期能进行有氧呼吸而大量繁殖，B错误；
酒精发酵过程中酵母菌的数量并非持续增加，发酵前期和中期酵母菌的数量增长曲线基本呈“S”形，到了发酵后期，营养物质的不断减少、酒精浓度的增加都会抑制酵母菌的生长，酵母菌数量会不断减少，D错误。
3.(2024·贵阳高三一模)酿醋在我国已经有上千年的历史。如图表示我国传统发酵技术酿醋的主要流程，图中麸皮含有多种维生素和钙、铁等无机盐，营养成分适宜，能为制醋补充有效成分。下列叙述错误的是
A.糯米加入前需进行高压蒸汽
灭菌处理
B.加入的菌种①是酵母菌，菌种
②是醋酸菌
C.拌麸皮的操作有利于菌种②的繁殖和代谢
D.采用高温浓缩淋出的醋，可以起到杀菌的作用
√
酵母菌在无氧条件下能进行酒精发酵，醋酸菌可用于制作各种风味的醋，所以加入的菌种①是酵母菌，菌种②是醋酸菌，B正确；
麸皮能为制醋补充有效成分，拌麸皮的操作有利于提升发酵材料中氧气含量，有利于菌种②(醋酸菌)的繁殖和代谢，C正确；
高温可以起到杀菌的作用，因此采用高温浓缩淋出的醋可以起到杀菌作用，D正确。
糯米粉碎后还需蒸煮，故加入前只需要洗净控干处理，不需要灭菌，A错误；
4.(2024·桂林高三二模)桑葚玫瑰酒既融合了桑葚和玫瑰的果香、花香，又使其营养价值和功能活性增加，极大地满足人们的需求。图1为制作桑葚玫瑰酒的装置图；图2为不同桑葚汁与玫瑰质量比对花色苷含量、酒精度和感官评分(感官评分越高，品质越好)的影响。下列相关叙述错误的是
A.图1中排气口连接长而弯曲的胶管可避免其他微生物进入装置
B.酿造桑葚玫瑰酒和桑葚玫瑰醋所利用的微生物都能通过线粒体
进行有氧呼吸
C.由图2可知，桑葚汁与玫瑰质量比对酒精度影响不大
D.花色苷含量随桑葚汁与玫瑰质量比的增大而降
低，质量比为4∶1时酒的感官评分最高
√
桑葚玫瑰醋利用的菌种是醋酸菌，醋酸菌是原核生物，无线粒体，B错误；
由图2可知，随着桑葚汁与玫瑰质量比增大，酒精度几乎没有变化，说明桑葚汁与玫瑰质量比对酒精度影响不大，C正确。
5.(2024·芜湖高三二模)甜米酒又称酒酿，多以糯米为原料拌入酒曲发酵而成。传统家庭手工制作，产品品质不稳定，容易酸败，如图是工业化生产米酒的流程，其中发酵过程分为主发酵和后发酵两个阶段。据图判断下列说法错误的是
A.性状优良的酵母菌菌种可以从自然界中筛选，也可以通过诱变育种或
基因工程育种获得
B.发酵时要严格控制温度、pH和溶解氧等发酵条件，以免影响微生物的
生长繁殖和代谢物的形成
C.酵母菌的繁殖在主发酵阶段完成，而大部分糖的分解和代谢物的生成
在后发酵阶段完成
D.罐装、封口、杀菌要在限定时间内完成，若时间过长，产品会腐败变酸
√
发酵工程的第一步就是选育菌种，性状优良的菌种可以从自然界中筛选，也可以通过诱变育种或基因工程育种获得，A正确；
发酵罐内发酵是发酵工程的中心环节，要严格控制温度、pH和溶解氧等发酵条件，环境条件的改变不仅会影响微生物的生长繁殖，而且会影响微生物代谢物的形成，B正确；
酵母菌的繁殖、大部分糖的分解和代谢物的生成都在主发酵阶段完成，C错误；
罐装、封口、杀菌要在限定时间内完成，若时间过长，容易受杂菌污染，产品会腐败变酸，D正确。
A.粉碎有利于麦芽中的淀粉与α-
淀粉酶充分接触，缩短糖化过
程时间
B.麦汁煮沸的主要目的是抑制糖化过程后残留酶的活性同时杀死麦汁中
微生物
C.加入酒花的主要目的是提供酵母菌菌种有利于主发酵进行并产生大量
酒精
D.主发酵结束后发酵液还要在低温密闭的环境下储存一段时间才能形成
成熟啤酒
6.(2024·南京高三一模)图示为啤酒生产的主要流程，下列相关叙述错误的是
√
糖化的目的是将麦芽中的淀粉等有机物水解为小分子物质，形成糖浆，故粉碎过程有利于淀粉与α-淀粉酶的充分接触，缩短糖化过程所用的时间，A正确；
麦汁煮沸的主要目的是使淀粉酶失活，终止酶的进一步作用，并对糖浆灭菌，B正确；
加入酒花的主要目的是赋予啤酒特殊的香味，赋予啤酒爽快的苦味，增加防腐能力，提高啤酒的非生物稳定性，防止煮沸时窜味，C错误；
主发酵结束后，发酵液还不适合饮用，要在低温、密闭的环境下储存一段时间进行后发酵，这样才能形成澄清、成熟的啤酒，D正确。
7.(2024·淄博高三一模)甲醇蛋白是毕赤酵母的胞内蛋白，可用甲醇作碳源来培养毕赤酵母生产甲醇蛋白。毕赤酵母无毒性，甲醇对大多数微生物有毒性。下列叙述错误的是
A.筛选能高效利用甲醇的毕赤酵母时，培养基应以甲醇为唯一碳源
B.虽然甲醇对多数微生物有毒性，发酵生产甲醇蛋白时也需检测是否有
杂菌污染
C.发酵时，发酵温度、培养液的渗透压和pH影响甲醇蛋白产量
D.用作动物饲料时，需从毕赤酵母菌体中分离、纯化甲醇蛋白
√
8.(2024·六安高三一模)为保障粮食安全，我国科研人员以富含纤维素的农业残渣(秸秆)为原料，利用基因工程改造面包酵母使其表面携带相关酶，可同时高效生产人工淀粉和单细胞蛋白。部分生产工艺如图，下列叙述正确的是
A.面包酵母的增殖不能促进纤维二糖水解及
淀粉合成
B.生产单细胞蛋白时选择26 ℃、pH 5.5的条
件为宜
C.本生产过程最宜在不加通气和搅拌的啤酒
发酵罐中进行
D.生产前培养基高压蒸汽灭菌的条件可为121 ℃、20 min
√
由图可知，面包酵母表面携带促进纤维二糖水解的酶和促进淀粉合成的酶，因此其增殖能促进纤维二糖水解及淀粉合成，A错误；
生产单细胞蛋白就是使面包酵母增殖，酵母增殖的适宜温度为28～32 ℃，适宜
pH为4.0～5.0，B错误；
由题意可知，本生产过程是为了高效生产人工淀粉和单细胞蛋白，需要使面包酵母增殖，应当在有氧环境下进行，C错误；
高压蒸汽灭菌是在121 ℃、100 kPa条件下处理15～30 min，将培养基彻底灭菌，以避免培养基上的微生物影响实验结果，D正确。
9.(2024·沧州高三二模)从海水样本中分离粘质沙雷氏菌时，所用的海生菌肉汤培养基的成分如表所示。下列叙述错误的是
蛋白胨5.00 g·L－1 MgCl2 5.90 g·L－1 NaHCO3 0.16 g·L－1
酵母提取物1.00 g·L－1 Na2SO4 3.24 g·L－1 KBr 0.08 g·L－1
柠檬酸铁0.10 g·L－1 CaCl2 1.80 g·L－1 SrCl2 34.00 g·L－1
NaCl 19.45 g·L－1 KCl 0.55 g·L－1 H3BO3 22.00 g·L－1
A.蛋白胨只为粘质沙雷氏菌提供碳源，该菌生长需要多种微量元素
B.若从牛肉膏、硫酸铵、硝酸钾中筛选优质氮源，每次应只添加其中一种
C.该培养基应在灭菌前调节pH，其不能用于分离粘质沙雷氏菌获得单菌落
D.该培养基添加了NaCl，具有抑制某些微生物生长的作用，属于选择培养基
√
培养基中的蛋白胨可为粘质沙雷氏菌提供碳源、氮源和维生素等，A错误；
筛选最佳氮源时，培养基中每次应只添加牛肉膏、硫酸铵、硝酸钾中的一种，B正确；
该培养基应在灭菌前调节pH，该培养基没有添加琼脂，是液体培养基，不能分离出粘质沙雷氏菌的单菌落，C正确；
选择培养基是允许特定种类的微生物生长、同时抑制或阻止其他微生物生长的培养基，该培养基中添加了NaCl，能抑制某些不耐盐的微生物的生长，属于选择培养基，D正确。
10.(2024·南通高三三模)发酵乳中含有丰富的乳酸菌。科研人员利用CaCO3－MRS培养基(蛋白胨10 g、牛肉膏粉5 g、酵母膏粉4 g、葡萄糖20 g、磷酸氢二钾2 g、乙酸钠5 g、柠檬酸三铵2 g、硫酸镁0.2 g、硫酸锰0.05 g、琼脂15 g、碳酸钙25 g)从发酵乳中分离纯化乳酸菌，下列相关叙述正确的是
A.能为乳酸菌提供碳源的有蛋白胨、牛肉膏粉、酵母膏粉、葡萄糖、琼脂
B.接种前应将发酵乳置于121 ℃、100 kPa条件下处理15～30 min
C.涂布接种后应在培养皿盖上标记接种日期和接种者，并倒置培养
D.挑取溶钙圈直径与菌落直径比值较大的菌落进一步划线纯化
√
琼脂作为凝固剂，不会被微生物利用，不能为乳酸菌提供碳源，A错误；
接种前高压蒸汽灭菌处理，会杀死发酵乳中的乳酸菌，这样就无法分离纯化乳酸菌，B错误；
涂布接种后应在培养皿底部标记接种日期和接种者，并倒置培养，C错误。
A.微生物的纯培养物是指不含有任何代谢废物的微生物培养物
B.空白平板使用前已进行灭菌，接种后未长出菌落的平板可以直接丢弃
C.过程②所使用的接种方法是稀释涂布平板法，统计结果往往比实际值
偏低
D.培养基表面均加入一层无菌的石蜡主要是为了防止杂菌的污染
11.(2024·襄阳高三三模)科学家按照图示流程分离牛瘤胃中的纤维素分解菌，并在刚果红培养基平板上筛选到有透明降解圈的菌落。下列叙述正确的是
√
含有代谢废物的微生物培养物，A错误；
接种后未长出菌落的培养基，也可能有少量微生物，为避免污染环境，丢弃前要进行灭菌处理，B错误；
过程②所使用的接种方法是稀释涂布平板法，如果使用稀释涂布平板法统计纤维素分解菌的种群密度，由于两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，所得结果往往比实际值偏低，C正确；
由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，指的是没有被杂菌污染的微生物，而不是不
反刍动物的瘤胃中不含氧气，其中存在的纤维素分解菌适宜在无氧条件下生存和繁殖，因此培养基表面均加入一层无菌的石蜡主要是为了保证培养的无氧环境，D错误。
12.(2024·三明高三二模)圆褐固氮菌可独立固定空气中的氮气，且能够分泌生长素。巨大芽孢杆菌可将有机磷降解为可溶性磷。二者组合可将有机厨余垃圾迅速分解为水和二氧化碳。为制备分解有机厨余垃圾的微生物菌剂，某科研小组对两种菌种进行了最佳接种比例的探究实验，得出如图实验结果。下列说法错误的是
A.圆褐固氮菌和巨大芽孢杆菌在生长过程中都需
要氮源
B.统计活菌数量可采用稀释涂布平板法
C.处理该厨余垃圾，两种菌种的最佳接种比例为1∶2
D.两种菌种的组合菌剂还可制成微生物肥料施用到土壤中，提高农作物的产量
√
微生物的生长一般都需要水、碳源、氮源和无机盐等营养物质，圆褐固氮菌的氮源来自空气中的氮气，巨大芽孢杆菌的氮源来自培养基，A正确；
实验的因变量是有机垃圾的分解量(以二者的有效菌落数为指标)，接种量比例为1∶2的有效菌落数小于接种量为1∶1的有效菌落数，故接种量比例1∶1时分解有机厨余垃圾的能力强，C错误；
植物在生长的过程中要吸收一定量的含N、P的无机盐和二氧化碳等营养物质，圆褐固氮菌可独立固定空气中的氮气，且能够分泌生长素，巨大芽孢杆菌可将有机磷降
解为可溶性磷，二者能为植物提供含N、P的无机盐和二氧化碳等营养物质，故两菌种的组合菌剂还可制成微生物肥料施用到土壤中，提高农作物的产量，D正确。
A.黑曲霉与生产果醋时所用主要微生
物的代谢类型相同
B.将菌种接种至a培养基时，浸泡在
酒精中的涂布器使用前需在火焰上灼烧
C.若发酵罐c中的原料为大豆粉，可利用黑曲霉水解大豆中的淀粉制成酱油
D.分离、提纯获得微生物细胞本身或其代谢产物是发酵工程的中心环节
13.(2024·南通高三二模)黑曲霉是一种丝状真菌，其代谢产物广泛应用于食品加工等领域。食品工业以红薯粉为原料经黑曲霉发酵获得柠檬酸，图示为生产柠檬酸的简要流程图。下列叙述正确的是
√
由培养时需要振荡培养可知，黑曲霉的异化作用类型为需氧型，因此其代谢类型为异养需氧型，制作果醋利用的是醋酸菌，它的代谢类型也为异养需氧型，A正确；
由图可知，a培养基中是平板划线法得到的菌落，将菌种接种至a培养基时，应将接种环在火焰上灼烧灭菌，B错误；
大豆中的主要成分是蛋白质，若以大豆为主要原料，可利用黑曲霉产生蛋白酶，将原料中的蛋白质水解成小分子的肽和氨基酸，然后经淋洗、调制制成酱油产品，C错误；
发酵工程的中心环节是发酵罐内发酵，不是分离、提纯获得微生物细胞本身或其代谢产物，D错误。第2练　细胞工程和胚胎工程 (主干排查)
(每题4分，共48分)
1．(2024·甘肃，15)兰州百合栽培过程中易受病毒侵染，造成品质退化。某研究小组尝试通过组织培养技术获得脱毒苗，操作流程如图。下列叙述正确的是：
A．①为脱分化过程，1号培养基中的愈伤组织是排列规则的薄壁组织团块
B．②为再分化过程，愈伤组织细胞分化时可能会发生基因突变或基因重组
C．3号培养基用于诱导生根，其细胞分裂素浓度与生长素浓度的比值大于1
D．百合分生区附近的病毒极少，甚至无病毒，可以作为该研究中的外植体
2．(2024·黑吉辽，6)迷迭香酸具有多种药理活性。进行工厂化生产时，先诱导外植体形成愈伤组织，再进行细胞悬浮培养获得迷迭香酸，加入诱导剂茉莉酸甲酯可大幅提高产量。下列叙述错误的是：
A．迷迭香顶端幼嫩的茎段适合用作外植体
B．诱导愈伤组织时需加入NAA和脱落酸
C．悬浮培养时需将愈伤组织打散成单个细胞或较小的细胞团
D．茉莉酸甲酯改变了迷迭香次生代谢产物的合成速率
3．(2024·安徽，15)植物细胞悬浮培养技术在生产中已得到应用。某兴趣小组尝试利用该技术培养胡萝卜细胞并获取番茄红素，设计了以下实验流程和培养装置(如图)，请同学们进行评议。下列评议不合理的是：
A．实验流程中应该用果胶酶等处理愈伤组织，制备悬浮细胞
B．装置中的充气管应置于液面上方，该管可同时作为排气管
C．装置充气口需要增设无菌滤器，用于防止杂菌污染培养液
D．细胞培养需要适宜的温度，装置需增设温度监测和控制设备
4．(2024·湖北，11)植物甲抗旱、抗病性强，植物乙分蘖能力强、结实性好。科研人员通过植物体细胞杂交技术培育出兼有甲、乙优良性状的植物丙，过程如图所示。下列叙述错误的是：
A．过程①中酶处理的时间差异，原因可能是两种亲本的细胞壁结构有差异
B．过程②中常采用灭活的仙台病毒或PEG诱导原生质体融合
C．过程④和⑤的培养基中均需要添加生长素和细胞分裂素
D．可通过分析植物丙的染色体，来鉴定其是否为杂种植株
5．(2024·黑吉辽，14)从小鼠胚胎中分离获取胚胎成纤维细胞进行贴壁培养，在传代后的不同时间点检测细胞数目，结果如图。下列叙述正确的是：
A．传代培养时，培养皿需密封防止污染
B．选取①的细胞进行传代培养比②更合理
C．直接用离心法收集细胞进行传代培养
D．细胞增长进入平台期可能与细胞密度过大有关
6．(2022·福建，3)我国科研人员在航天器微重力环境下对多能干细胞的分化进行了研究，发现与正常重力相比，多能干细胞在微重力环境下加速分化为功能健全的心肌细胞。下列叙述错误的是：
A．微重力环境下多能干细胞和心肌细胞具有相同的细胞周期
B．微重力环境下进行人体细胞的体外培养需定期更换培养液
C．多能干细胞在分化过程中蛋白质种类和数量发生了改变
D．该研究有助于了解微重力对细胞生命活动的影响
7．(2023·北京，12)甲状旁腺激素(PTH)水平是人类多种疾病的重要诊断指标。研究者制备单克隆抗体用于快速检测PTH，下列有关制备过程的叙述不正确的是：
A．需要使用动物细胞培养技术
B．需要制备用PTH免疫的小鼠
C．利用抗原－抗体结合的原理筛选杂交瘤细胞
D．筛选能分泌多种抗体的单个杂交瘤细胞
8．(2024·湖北，10)研究者探究不同浓度的雌激素甲对牛的卵母细胞和受精卵在体外发育的影响，实验结果如表所示。根据实验数据，下列叙述错误的是：
甲的浓度/(μg/mL) 卵母细胞/个 第一极体排出/个 成熟率/% 卵裂数/个 卵裂率/%
0 106 70 66.0 28 40.0
1 120 79 65.8 46 58.2
10 113 53 46.9 15 28.3
100 112 48 42.8 5 10.4
A.实验结果说明甲抑制卵裂过程
B．甲浓度过高抑制第一极体的排出
C．添加1 μg/mL的甲可提高受精后胚胎发育能力
D．本实验中，以第一极体的排出作为卵母细胞成熟的判断标准
9．(2024·甘肃，16)甘加藏羊是甘肃高寒牧区的优良品种，是季节性发情动物，每年产羔一次，每胎一羔，繁殖率较低。为促进畜牧业发展，研究人员通过体外受精、胚胎移植等胚胎工程技术提高藏羊的繁殖率，流程如图。下列叙述错误的是：
A．藏羊甲需用促性腺激素处理使其卵巢卵泡发育和超数排卵
B．藏羊乙的获能精子能与刚采集到的藏羊甲的卵母细胞受精
C．受体藏羊丙需和藏羊甲进行同期发情处理
D．后代丁的遗传物质来源于藏羊甲和藏羊乙
10．(2023·广东，3)科学家采用体外受精技术获得紫羚羊胚胎，并将其移植到长角羚羊体内，使后者成功妊娠并产仔，该工作有助于恢复濒危紫羚羊的种群数量。此过程不涉及的操作是：
A．超数排卵 B．精子获能处理
C．细胞核移植 D．胚胎培养
11．(2024·湖北，5)波尔山羊享有“世界山羊之王”的美誉，具有生长速度快、肉质细嫩等优点。生产中常采用胚胎工程技术快速繁殖波尔山羊。下列叙述错误的是：
A．选择遗传性状优良的健康波尔母山羊进行超数排卵处理
B．胚胎移植前可采集滋养层细胞进行遗传学检测
C．普通品质的健康杜泊母绵羊不适合作为受体
D．生产中对提供精子的波尔公山羊不需要筛选
12．(2024·北京，11)我国科学家体外诱导食蟹猴胚胎干细胞，形成了类似囊胚的结构(类囊胚)，为研究灵长类胚胎发育机制提供了实验体系(如图)。下列相关叙述错误的是：
A．实验证实食蟹猴胚胎干细胞具有分化潜能
B．实验过程中使用的培养基含有糖类
C．类囊胚的获得利用了核移植技术
D．可借助胚胎移植技术研究类囊胚的后续发育
(每题4分，共48分)
1．(2024·南京高三一模)通过植物细胞工程对光果甘草进行培养以获得药物甘草西定，过程如图所示。下列相关叙述正确的是：
A．过程③通常先在生长素与细胞分裂素比例高的培养基中培养
B．过程④常用射线或化学物质处理即可获得大量所需的突变体植株丙
C．所得三种植株中乙和丙的遗传信息与甲相同，植株丁和甲是同一物种
D．过程⑥中甘草西定可通过植物细胞培养获得，应将愈伤组织细胞悬浮培养
2．(2024·宜春高三一模)花椰菜种植时容易遭受病菌侵害形成病斑，紫罗兰具有一定的抗病性。科研人员利用植物体细胞杂交技术培育具有抗病性状的花椰菜新品种，如图1所示。通过蛋白质电泳技术分析了亲本及过程④获得的植株1～5中的特定蛋白，结果如图2所示。下列有关叙述正确的是：
A．图1过程①是在无菌水中进行的，过程③是在固体培养基中进行
B．图2中1、2、3为杂种植株，4、5分别为花椰菜和紫罗兰
C．图2中通过蛋白质电泳技术获得了有关氨基酸序列的数据信息
D．确定杂种植株后，可用在叶片上喷施细菌悬浮液的方法筛选出其中抗病性强的植株
3．(2024·吉安高三模拟)微囊法是一种动物细胞培养法，其方法是将一定数量的动物细胞封闭在半透膜的微囊中，然后再将这种包含有细胞的微囊悬浮于培养液中培养。培养液中的水和营养物质可透过半透膜进入微囊供应给细胞，细胞的代谢物也可透过半透膜被排出，而细胞分泌的大分子物质则被阻留而积累于囊内。下列有关叙述错误的是：
A．微囊法培养能保护细胞少受损伤，有利于大规模培养动物细胞
B．微囊法培养动物细胞，有利于获得高度纯化的大分子细胞产物
C．微囊悬浮培养能防止培养过程中出现细胞贴壁生长和接触抑制现象
D．培养时要向培养液通入95%的空气和5%的CO2组成的混合气体
4．(2024·沧州高三一模)目前肺类器官主要有两种培养方式：其一是诱导多能干细胞(iPS细胞)生成；其二是将肺上皮干细胞与筛选后的体细胞进行共培养(过程如图所示)。下列叙述不正确的是：
A．配制动物细胞培养液时除考虑各种营养成分外，还应考虑渗透压
B．培养肺类装配体时需定期更换培养液，以便清除代谢废物等
C．iPS细胞具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织
D．肺类器官A和B细胞中的DNA相同，RNA和蛋白质存在差异
5．(2024·大庆高三二模)世界首例体细胞克隆猴在中国产生，体细胞克隆猴的成功将为人类健康作出巨大贡献，培育克隆猴的流程如图所示。据图分析，下列叙述不正确的是：
A．将成纤维细胞注入去核卵母细胞前，用灭活的仙台病毒短暂处理的目的是利于细胞融合
B．组蛋白的甲基化和乙酰化不利于重构胚完成细胞分裂和发育过程
C．克隆猴“中中”和“华华”的细胞质基因来自猴A和猴B
D．体细胞克隆猴的成功便于建立某些疾病模型和药物筛选
6．(2024·荆州高三三模)种间体细胞核移植(iSCNT)将供体动物体细胞与来自不同种的家畜去核卵母细胞融合并激活，以获得较多的重构胚，进而获得动物个体。因野生动物数量少，采集精子或卵子开展常规辅助生殖较为困难，而从活体采集体细胞利用iSCNT技术获得动物个体，可一定程度维持濒危动物数量。下列叙述正确的是：
A．iSCNT技术必须通过显微操作技术将供体细胞的细胞核取出，然后注入去核的卵母细胞
B．若从野生动物体内采集到的体细胞数目较少，可先用添加动物血清的固体培养基培养
C．因受体不会对来自供体的胚胎发生免疫排斥反应，代孕母体可以任意选择不同种的家畜
D．同一野生动物经iSCNT技术获得的多个重构胚中，遗传物质可能不完全相同
7．(2024·朔州高三二模)VP1为引起手足口病的主要病毒EV71中的特异性结构蛋白，以VP1蛋白为抗原制备单克隆抗体的过程如图所示。下列叙述错误的是：
A．克隆化培养可用液体培养基，除提供细胞所需营养物质外，还需加入血清
B．骨髓瘤细胞和B淋巴细胞融合与植物原生质体融合的诱导方法相同
C．通过HAT培养基和抗体检测筛选，可得到产VP1蛋白抗体的杂交瘤细胞
D．从注射过VP1蛋白的小鼠脾脏中可获取产VP1蛋白抗体的B淋巴细胞
8．急性肝衰竭是一种致命的疾病，死亡率很高。目前，肝移植仍然是治疗肝衰竭的唯一有效方法。由于肝脏器官的短缺，肝细胞移植被作为肝移植的替代策略。用海藻酸盐微胶囊包裹可增殖人肝细胞获得类器官，并用于移植，是治疗肝衰竭的一种有前途的策略。下列叙述错误的是：
A．供体肝组织需先用胰蛋白酶将其分散，再进行原代培养
B．开放式培养肝细胞，有利于细胞代谢产生CO2及时溢出
C．异体移植细胞会发生免疫排斥，用海藻酸盐包裹有利于形成免疫保护屏障
D．若人肝细胞类器官与空微囊治疗组的效果相当，可证明微胶囊包裹不影响肝细胞功能
9．科研人员利用雄鼠多能干细胞(PSC)诱导产生精子，并使其成功与卵细胞进行受精作用，得到正常后代，操作流程如图所示。这项研究为治疗人类男性无精症导致的不孕不育提供了重要参考。下列分析错误的是：
A．PSC经诱导分化形成精原细胞的过程中，染色体的数目一般不会发生变化
B．为提高受精的成功率，步骤④可加入多个分化出的精子
C．步骤⑤受精卵在体外培养时需提供95%氧气和5%CO2的混合气体环境
D．早期胚胎需培养至囊胚或桑葚胚期才能植入正常鼠的子宫
10．(2024·石家庄高三期末)线粒体置换技术是将妈妈携带突变线粒体的卵母细胞核移植到去核的健康线粒体捐赠者卵母细胞中获得的重构卵母细胞，与携带者丈夫精子进行受精，从而获得重构胚也就是通常说的“三亲胚胎”，也被称为“第四代试管婴儿”。下列有关说法错误的是：
A．重构卵母细胞需培养成熟才可以与获能精子受精
B．第四代试管婴儿的DNA来自携带者与其丈夫
C．第四代试管婴儿可避免线粒体疾病
D．第四代试管婴儿的培育还需要经历早期胚胎培养和胚胎移植等技术
11．(2024·绍兴高三二模)2023年，我国科学家成功地在猪胚胎中培育出含有人细胞的肾脏。科学家先利用基因编辑技术获得免疫缺陷猪胚胎，再将经特殊处理的人体干细胞注入猪胚胎的特定位置，并将胚胎移入代孕母体的子宫内进行培养，最终培育出拥有70%人细胞且功能正常的肾脏。下列叙述正确的是：
A．人体干细胞培养需置于含有95%空气和5%氧气的培养箱中
B．待猪胚胎发育至原肠胚时方可注入人体干细胞
C．代孕母体需提前注射外源促性腺激素等以调整其发情周期
D．上述方法制备的肾脏移植到人体，一定不会发生免疫排斥
12．(2024·沧州高三三模)我国科研人员通过两种途径获得了小鼠“人造精子”——孤雄单倍体胚胎干细胞，将“人造精子”注入卵细胞后形成受精卵并成功获得多只健康小鼠，“人造精子”培育流程如图所示。下列叙述不正确的是：
A．两种途径获得的小鼠“人造精子”均使用了细胞核移植技术
B．培养过程不仅要在无菌环境中进行还需定时更换培养基
C．利用“人造精子”进行受精的过程与体外受精过程并不相同
D．“人造精子”为治疗某些男性不育症提供了新的思路和方法
答案精析
真题演练
1．D　[观察题图可知，分生组织经过程①获得愈伤组织，因此①为脱分化，1号培养基中的愈伤组织是不定形(排列不规则)的薄壁组织团块，A错误；愈伤组织经过程②长出芽，因此②为再分化，愈伤组织细胞分化(有丝分裂)时可能会发生基因突变，但基因重组发生在减数分裂过程中，B错误；3号培养基用于诱导生根，其细胞分裂素浓度与生长素浓度的比值应该小于1，C错误。]
2．B　[迷迭香顶端幼嫩的茎段适合用作外植体，因为其生长旺盛，分裂能力较强，A正确；诱导愈伤组织时需加入生长素和细胞分裂素，B错误；悬浮培养时需将愈伤组织打散成单个细胞或较小的细胞团，从而可获得更多的营养物质和氧气，促进细胞分裂，C正确；加入诱导剂茉莉酸甲酯可大幅提高产量，推测茉莉酸甲酯改变了迷迭香次生代谢产物(不是植物生长所必需的)的合成速率，D正确。]
3．B　[植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，欲利用愈伤组织制备悬浮细胞，可用纤维素酶和果胶酶处理愈伤组织，A合理；装置中的充气管应置于液面下方，以利于增加培养液中的溶氧量，为及时排出多余气体，排气管应置于液面上方，因此充气管不能同时作为排气管，B不合理。]
4．B　[酶解是为了去除植物细胞的细胞壁，过程①中酶处理的时间不同，说明两种亲本的细胞壁结构有差异，A正确；过程②为原生质体的融合，常用化学试剂如PEG诱导原生质体融合，灭活的仙台病毒可诱导动物细胞融合，不能用于植物原生质体融合，B错误；过程④脱分化和⑤再分化的培养基中均需要添加生长素和细胞分裂素，但二者在两过程中的比例不同，C正确；植物丙是植物甲和植物乙体细胞杂交形成的个体，应具备两者的遗传物质，因此可通过分析植物丙的染色体，来鉴定其是否为杂种植株，D正确。]
5．D　[传代培养时需要营造无菌、无毒以及95%空气＋5%CO2的气体环境，而非密封，A错误；①的细胞还未快速增长，此时进行传代培养没有意义，应选②的细胞进行传代培养，B错误；对于贴壁生长的细胞进行传代培养时，需要先用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集，之后，将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养，C错误。]
6．A　[连续分裂的细胞才具有细胞周期，心肌细胞已经高度分化，不能再分裂，没有细胞周期，A错误；进行细胞的体外培养需定期更换培养液，避免代谢废物对细胞的毒害作用，B正确；细胞分化的本质是基因的选择性表达，故多能干细胞在分化过程中蛋白质种类和数量发生了改变，C正确；由题意可知，多能干细胞在微重力环境下能加速分化，所以该研究有助于了解微重力对细胞生命活动的影响，D正确。]
7．D　[单克隆抗体制备过程中需要对骨髓瘤细胞等进行培养，即需要使用动物细胞培养技术，A正确；该操作的目的是制备单克隆抗体用于快速检测PTH，故应用PTH刺激小鼠，使其产生相应的B淋巴细胞，B正确；抗原与抗体的结合具有特异性，可利用抗原－抗体结合的原理筛选杂交瘤细胞，C正确；由于一种B淋巴细胞经分化形成浆细胞后通常只能产生一种抗体，故筛选出的单个杂交瘤细胞无法分泌多种抗体，D错误。]
8．A　[由表可知，甲低浓度时促进卵裂，高浓度时抑制卵裂，A错误；添加1 μg/mL的甲，卵裂数增多，卵裂率增大，即该条件可提高受精后胚胎发育能力，C正确；第一极体的排出说明卵子完成了减数分裂Ⅰ，卵母细胞成熟的判断标准是第一极体的排出，D正确。]
9．B　[胚胎移植过程中，需用外源促性腺激素处理供体(母藏羊甲)，促使其卵巢卵泡发育和超数排卵，A正确；刚采集的卵母细胞需培养成熟(减数分裂Ⅱ期)后才可与获能的精子进行体外受精，B错误；在胚胎移植前要对供体和接受胚胎的受体进行同期发情处理，使受体的生理状况与供体相同，C正确；后代丁是由藏羊甲的卵细胞和藏羊乙的精子结合形成的受精卵发育而来的，因此后代丁的遗传物质来源于藏羊甲和藏羊乙，D正确。]
10．C　[由题干信息可知，该过程通过体外受精获得胚胎，再通过胚胎移植，使长角羚羊成功妊娠并产仔，因此需要进行超数排卵、精子获能处理，并对获得的受精卵进行胚胎培养；由于该过程为有性生殖，因此不涉及细胞核移植，C符合题意。]
11．D　[选择遗传性状优良、生产能力强的健康波尔母山羊作为供体，进行超数排卵处理，A正确；滋养层细胞将来发育成胎膜和胎盘，胚胎移植前，可采集部分滋养层细胞进行遗传学检测，B正确；胚胎移植的受体需要满足的条件是与供体同种且生理状态相同，而山羊和绵羊是不同的物种，因此普通品质的健康杜泊母绵羊不适合作为受体，C正确；生产中需选择品质良好的波尔公山羊提供精子，D错误。]
12．C　[实验过程中使用培养基培养胚胎干细胞，因此培养基中需含有糖类，为细胞提供能源物质，B正确；类囊胚的获得没有利用核移植技术，利用的是动物细胞培养技术，C错误；可借助胚胎移植技术将类囊胚移植到相应的雌性受体中继续发育，从而可以用来研究类囊胚的后续发育，D正确。]
模拟预测
1．D　[生长素/细胞分裂素的值高时，利于生根，该值低时利于生芽，过程③需先生芽，再生根，所以需要先在生长素与细胞分裂素比例低的培养基中培养，A错误；过程④常用射线或化学物质处理后，经筛选并进一步培养才能获得大量所需的突变体植株丙，B错误；所得三种植株中乙和丙的遗传信息不一定与甲相同，因为植株丙是诱变育种得到的，遗传信息可能会发生改变，植株丁是经植物体细胞杂交技术获得的，其染色体数目改变，与甲不是同一物种，C错误。]
2．D　[为避免原生质体吸水涨破，图1过程①是在无菌的等渗或略高渗溶液中进行的，而不是在无菌水中进行的，A错误；4和5含有紫罗兰和花椰菜两种类型的蛋白质，说明是杂种植株，而1、2、3只有花椰菜中的蛋白质，说明不是杂种植株，B错误；蛋白质电泳技术是根据不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同，该技术不能获得有关氨基酸序列的数据信息，C错误；确定杂种植株后，可将病菌悬浮液均匀喷施于杂种植株叶片上，一段时间后，测定病斑面积占叶片总面积的百分比，筛选出抗病性强的杂种植株，D正确。]
3．C　[微囊悬浮培养能防止培养过程中细胞贴壁生长，但是仍然会出现接触抑制现象，C错误。]
4．C
5．B　[结合题图可知，重构胚在注入Kdm4d的mRNA和TSA后，能够发育成克隆猴，而Kdm4d的mRNA表达产物为组蛋白去甲基化酶，可以使组蛋白去甲基化，TSA为组蛋白去乙酰化酶抑制剂，抑制组蛋白去乙酰化酶的作用，保持组蛋白乙酰化，即组蛋白乙酰化和去甲基化有利于重构胚后续的胚胎发育过程，B错误。]
6．D　[动物细胞核移植技术中普遍使用的去核方法是显微操作法，也有人采用梯度离心、紫外线短时间照射和化学物质处理等方法，A错误；若从野生动物体内采集到的体细胞数目较少，可先用添加动物血清的液体培养基进行培养，以增加体细胞的数目，B错误；同种胚胎移植时受体一般不会对来自供体的胚胎发生免疫排斥反应，种间胚胎移植为了保证成功率，应尽量选择亲缘关系较近的代孕母体，C错误；在种间体细胞核移植(iSCNT)过程中，去核的卵母细胞来自不同种的家畜(驯养动物)，获得的重构胚的细胞质遗传物质可能不同，因此同一野生动物经iSCNT技术获得的多个重构胚中，遗传物质可能不完全相同，D正确。]
7．B　[骨髓瘤细胞和B淋巴细胞融合与植物原生质体融合的诱导方法不完全相同，如诱导骨髓瘤细胞和B淋巴细胞融合过程特有的方法是灭活病毒诱导法，B错误。]
8．D　[若海藻酸盐微胶囊包裹的可增殖人肝细胞类器官与空微囊治疗组的效果相当，说明空微囊也可以治疗肝衰竭，不能证明微胶囊包裹不影响肝细胞功能，D错误。]
9．C　[动物细胞培养需要一定的气体环境，即95%空气和5%CO2的混合气体环境，C错误。]
10．B　[细胞中的DNA包括核DNA和质DNA，第四代试管婴儿的核DNA来自携带者及其丈夫，质DNA几乎全部来自捐赠者，B错误。]
11．C
12．A　[据图可知，第一条途径是通过受精作用使精子细胞核进入卵细胞后再去掉卵细胞的细胞核，从而获得胚胎干细胞，第二条途径获得胚胎干细胞是先去掉卵母细胞的细胞核，再将精子注入卵母细胞中，只有第二条途径使用了细胞核移植技术，A错误；培养胚胎干细胞使用了动物细胞培养技术，该技术需要在无菌环境下进行，另外还需定时更换培养基，一方面为细胞提供营养物质，另一方面也可以去除细胞产生的有害物质，B正确；“人造精子”不需要获能，将其注入卵细胞中就可进行受精作用，而参与体外受精的精子需经获能处理，C正确；若能以这种思路培育出人类的“人造精子”，可用于治疗因精子数量和质量问题导致的某些男性不育症，D正确。](共46张PPT)
专题八　
第2练
细胞工程和胚胎工程
1.(2024·甘肃，15)兰州百合栽培过程中易受病毒侵染，造成品质退化。某研究小组尝试通过组织培养技术获得脱毒苗，操作流程如图。下列叙述正确的是
A.①为脱分化过程，1号培养基中的愈伤组织是排列规则的薄壁组织团块
B.②为再分化过程，愈伤组织细胞分化时可能会发生基因突变或基因重组
C.3号培养基用于诱导生根，其细胞分裂素浓度与生长素浓度的比值大于1
D.百合分生区附近的病毒极少，甚至无病毒，可以作为该研究中的外植体
真题演练
PART ONE
√
观察题图可知，分生组织经过程①获得愈伤组织，因此①为脱分化，1号培养基中的愈伤组织是不定形(排列不规则)的薄壁组织团块，A错误；
愈伤组织经过程②长出芽，因此②为再分化，愈伤组织细胞分化(有丝分裂)时可能会发生基因突变，但基因重组发生在减数分裂过程中，B错误；
3号培养基用于诱导生根，其细胞分裂素浓度与生长素浓度的比值应该小于1，C错误。
2.(2024·黑吉辽，6)迷迭香酸具有多种药理活性。进行工厂化生产时，先诱导外植体形成愈伤组织，再进行细胞悬浮培养获得迷迭香酸，加入诱导剂茉莉酸甲酯可大幅提高产量。下列叙述错误的是
A.迷迭香顶端幼嫩的茎段适合用作外植体
B.诱导愈伤组织时需加入NAA和脱落酸
C.悬浮培养时需将愈伤组织打散成单个细胞或较小的细胞团
D.茉莉酸甲酯改变了迷迭香次生代谢产物的合成速率
√
迷迭香顶端幼嫩的茎段适合用作外植体，因为其生长旺盛，分裂能力较强，A正确；
诱导愈伤组织时需加入生长素和细胞分裂素，B错误；
悬浮培养时需将愈伤组织打散成单个细胞或较小的细胞团，从而可获得更多的营养物质和氧气，促进细胞分裂，C正确；
加入诱导剂茉莉酸甲酯可大幅提高产量，推测茉莉酸甲酯改变了迷迭香次生代谢产物(不是植物生长所必需的)的合成速率，D正确。
3.(2024·安徽，15)植物细胞悬浮培养技术在生产中已得到应用。某兴趣小组尝试利用该技术培养胡萝卜细胞并获取番茄红素，设计了以下实验流程和培养装置(如图)，请同学们进行评议。下列评议不合理的是
A.实验流程中应该用果胶酶等处理愈伤组织，制备悬浮细胞
B.装置中的充气管应置于液面上方，该管可同时作为排气管
C.装置充气口需要增设无菌滤器，用于防止杂菌污染培养液
D.细胞培养需要适宜的温度，装置需增设温度监测和控制设备
√
植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，欲利用愈伤组织制备悬浮细胞，可用纤维素酶和果胶酶处理愈伤组织，A合理；
装置中的充气管应置于液面下方，以利于增加培
养液中的溶氧量，为及时排出多余气体，排气管应置于液面上方，因此充气管不能同时作为排气管，B不合理。
4.(2024·湖北，11)植物甲抗旱、抗病性强，植物乙分蘖能力强、结实性好。科研人员通过植物体细胞杂交技术培育出兼有甲、乙优良性状的植物丙，过程如图所示。下列叙述错误的是
A.过程①中酶处理的时间差异，原因可能是
两种亲本的细胞壁结构有差异
B.过程②中常采用灭活的仙台病毒或PEG诱
导原生质体融合
C.过程④和⑤的培养基中均需要添加生长素
和细胞分裂素
D.可通过分析植物丙的染色体，来鉴定其是否为杂种植株
√
酶解是为了去除植物细胞的细胞壁，过程①中酶处理的时间不同，说明两种亲本的细胞壁结构有差异，A正确；
过程②为原生质体的融合，常用化学试剂如PEG诱导原生质体融合，灭活的仙台病毒可诱导动物细胞融合，不能用于植
物原生质体融合，B错误；
过程④脱分化和⑤再分化的培养基中均需要添加生长素和细胞分裂素，但二者在两过程中的比例不同，C正确；
植物丙是植物甲和植物乙体细胞杂交形成的个体，应具备两者的遗传物质，因此可通过分析植物丙的染色体，来鉴定其是否为杂种植株，D正确。
5.(2024·黑吉辽，14)从小鼠胚胎中分离获取胚胎成纤维细胞进行贴壁培养，在传代后的不同时间点检测细胞数目，结果如图。下列叙述正确的是
A.传代培养时，培养皿需密封防止污染
B.选取①的细胞进行传代培养比②更合理
C.直接用离心法收集细胞进行传代培养
D.细胞增长进入平台期可能与细胞密度过大有关
√
传代培养时需要营造无菌、无毒以及95%空气＋5%CO2的气体环境，而非密封，A错误；
①的细胞还未快速增长，此时进行传代培养没有意义，应选②的细胞进行传代培养，B错误；
对于贴壁生长的细胞进行传代培养时，需要先用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集，之后，将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养，C错误。
6.(2022·福建，3)我国科研人员在航天器微重力环境下对多能干细胞的分化进行了研究，发现与正常重力相比，多能干细胞在微重力环境下加速分化为功能健全的心肌细胞。下列叙述错误的是
A.微重力环境下多能干细胞和心肌细胞具有相同的细胞周期
B.微重力环境下进行人体细胞的体外培养需定期更换培养液
C.多能干细胞在分化过程中蛋白质种类和数量发生了改变
D.该研究有助于了解微重力对细胞生命活动的影响
√
连续分裂的细胞才具有细胞周期，心肌细胞已经高度分化，不能再分裂，没有细胞周期，A错误；
进行细胞的体外培养需定期更换培养液，避免代谢废物对细胞的毒害作用，B正确；
细胞分化的本质是基因的选择性表达，故多能干细胞在分化过程中蛋白质种类和数量发生了改变，C正确；
由题意可知，多能干细胞在微重力环境下能加速分化，所以该研究有助于了解微重力对细胞生命活动的影响，D正确。
7.(2023·北京，12)甲状旁腺激素(PTH)水平是人类多种疾病的重要诊断指标。研究者制备单克隆抗体用于快速检测PTH，下列有关制备过程的叙述不正确的是
A.需要使用动物细胞培养技术
B.需要制备用PTH免疫的小鼠
C.利用抗原－抗体结合的原理筛选杂交瘤细胞
D.筛选能分泌多种抗体的单个杂交瘤细胞
√
单克隆抗体制备过程中需要对骨髓瘤细胞等进行培养，即需要使用动物细胞培养技术，A正确；
该操作的目的是制备单克隆抗体用于快速检测PTH，故应用PTH刺激小鼠，使其产生相应的B淋巴细胞，B正确；
抗原与抗体的结合具有特异性，可利用抗原－抗体结合的原理筛选杂交瘤细胞，C正确；
由于一种B淋巴细胞经分化形成浆细胞后通常只能产生一种抗体，故筛选出的单个杂交瘤细胞无法分泌多种抗体，D错误。
8.(2024·湖北，10)研究者探究不同浓度的雌激素甲对牛的卵母细胞和受精卵在体外发育的影响，实验结果如表所示。根据实验数据，下列叙述错误的是
甲的浓度/(μg/mL) 卵母细胞/个 第一极体排出/个 成熟率/% 卵裂数/个 卵裂率/%
0 106 70 66.0 28 40.0
1 120 79 65.8 46 58.2
10 113 53 46.9 15 28.3
100 112 48 42.8 5 10.4
A.实验结果说明甲抑制卵裂过程
B.甲浓度过高抑制第一极体的排出
C.添加1 μg/mL的甲可提高受精后胚胎发育能力
D.本实验中，以第一极体的排出作为卵母细胞成熟的判断标准
√
由表可知，甲低浓度时促进卵裂，高浓度时抑制卵裂，A错误；
添加1 μg/mL的甲，卵裂数增多，卵裂率增大，即该条件可提高受精后胚胎发育能力，C正确；
第一极体的排出说明卵子完成了减数分裂Ⅰ，卵母细胞成熟的判断标准是第一极体的排出，D正确。
9.(2024·甘肃，16)甘加藏羊是甘肃高寒牧区的优良品种，是季节性发情动物，每年产羔一次，每胎一羔，繁殖率较低。为促进畜牧业发展，研究人员通过体外受精、胚胎移植等胚胎工程技术提高藏羊的繁殖率，流程如图。下列叙述错误的是
A.藏羊甲需用促性腺激素处理使其
卵巢卵泡发育和超数排卵
B.藏羊乙的获能精子能与刚采集到
的藏羊甲的卵母细胞受精
C.受体藏羊丙需和藏羊甲进行同期发情处理
D.后代丁的遗传物质来源于藏羊甲和藏羊乙
√
胚胎移植过程中，需用外源促性腺激素处理供体(母藏羊甲)，促使其卵巢卵泡发育和超数排卵，A正确；
刚采集的卵母细胞需培养成熟(减数分裂Ⅱ期)后才可与获能的精子进行
体外受精，B错误；
在胚胎移植前要对供体和接受胚胎的受体进行同期发情处理，使受体的生理状况与供体相同，C正确；
后代丁是由藏羊甲的卵细胞和藏羊乙的精子结合形成的受精卵发育而来的，因此后代丁的遗传物质来源于藏羊甲和藏羊乙，D正确。
10.(2023·广东，3)科学家采用体外受精技术获得紫羚羊胚胎，并将其移植到长角羚羊体内，使后者成功妊娠并产仔，该工作有助于恢复濒危紫羚羊的种群数量。此过程不涉及的操作是
A.超数排卵 B.精子获能处理
C.细胞核移植 D.胚胎培养
√
由题干信息可知，该过程通过体外受精获得胚胎，再通过胚胎移植，使长角羚羊成功妊娠并产仔，因此需要进行超数排卵、精子获能处理，并对获得的受精卵进行胚胎培养；由于该过程为有性生殖，因此不涉及细胞核移植，C符合题意。
11.(2024·湖北，5)波尔山羊享有“世界山羊之王”的美誉，具有生长速度快、肉质细嫩等优点。生产中常采用胚胎工程技术快速繁殖波尔山羊。下列叙述错误的是
A.选择遗传性状优良的健康波尔母山羊进行超数排卵处理
B.胚胎移植前可采集滋养层细胞进行遗传学检测
C.普通品质的健康杜泊母绵羊不适合作为受体
D.生产中对提供精子的波尔公山羊不需要筛选
√
选择遗传性状优良、生产能力强的健康波尔母山羊作为供体，进行超数排卵处理，A正确；
滋养层细胞将来发育成胎膜和胎盘，胚胎移植前，可采集部分滋养层细胞进行遗传学检测，B正确；
胚胎移植的受体需要满足的条件是与供体同种且生理状态相同，而山羊和绵羊是不同的物种，因此普通品质的健康杜泊母绵羊不适合作为受体，C正确；
生产中需选择品质良好的波尔公山羊提供精子，D错误。
A.实验证实食蟹猴胚胎干细胞具有分化潜能
B.实验过程中使用的培养基含有糖类
C.类囊胚的获得利用了核移植技术
D.可借助胚胎移植技术研究类囊胚的后续发育
12.(2024·北京，11)我国科学家体外诱导食蟹猴胚胎干细胞，形成了类似囊胚的结构(类囊胚)，为研究灵长类胚胎发育机制提供了实验体系(如图)。下列相关叙述错误的是
√
实验过程中使用培养基培养胚胎干细胞，因此培养基中需含有糖类，为细胞提供能源物质，B正确；
类囊胚的获得没有利用核移植技术，利用的是动物细胞培养技术，C错误；
可借助胚胎移植技术将类囊胚移植到相应的雌性受体中继续发育，从而可以用来研究类囊胚的后续发育，D正确。
1.(2024·南京高三一模)通过植物细胞工程对光果甘草进行培养以获得药物甘草西定，过程如图所示。下列相关叙述正确的是
A.过程③通常先在生长素与细胞分裂素
比例高的培养基中培养
B.过程④常用射线或化学物质处理即可
获得大量所需的突变体植株丙
C.所得三种植株中乙和丙的遗传信息与
甲相同，植株丁和甲是同一物种
D.过程⑥中甘草西定可通过植物细胞培养获得，应将愈伤组织细胞悬浮培养
模拟预测
PART TWO
√
生长素/细胞分裂素的值高时，利于生根，该值低时利于生芽，过程③需先生芽，再生根，所以需要先在生长素与细胞分裂素比例低的培养基中培养，A错误；
过程④常用射线或化学物质处理后，经筛选并进一步培养才能获得大量所需的突变体植株丙，B错误；
所得三种植株中乙和丙的遗传信息不一定与甲相同，因为植株丙是诱变育种得到的，遗传信息可能会发生改变，植株丁是经植物体细胞杂交技术获得的，其染色体数目改变，与甲不是同一物种，C错误。
2.(2024·宜春高三一模)花椰菜种植时容易遭受病菌侵害形成病斑，紫罗兰具有一定的抗病性。科研人员利用植物体细胞杂交技术培育具有抗病性状的花椰菜新品种，如图1所示。通过蛋白质电泳技术分析了亲本及过程④获得的植株1～5中的特定蛋白，结果如图2所示。下列有关叙述正确的是
A.图1过程①是在无菌水中进行的，过程③是在固体培养基中进行
B.图2中1、2、3为杂种植株，4、5分别为花椰菜和紫罗兰
C.图2中通过蛋白质电泳技术获得了有关氨基酸序列的数据信息
D.确定杂种植株后，可用在叶片上喷施细菌悬浮液的方法筛选出其中抗
病性强的植株
√
为避免原生质体吸水涨破，图1过程①是在无菌的等渗或略高渗溶液中进行的，而不是在无菌水中进行的，A错误；
4和5含有紫罗兰和花椰菜两种类型的蛋白质，说明是杂种植株，而1、2、3只有花椰菜中的蛋白质，说明不是杂种植株，B错误；
蛋白质电泳技术是根据不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同，该技术不能获得有关氨基酸序列的数据信息，C错误；
确定杂种植株后，可将病菌悬浮液均匀喷施于杂种植株叶片上，一段时间后，测定病斑面积占叶片总面积的百分比，筛选出抗病性强的杂种植株，D正确。
3.(2024·吉安高三模拟)微囊法是一种动物细胞培养法，其方法是将一定数量的动物细胞封闭在半透膜的微囊中，然后再将这种包含有细胞的微囊悬浮于培养液中培养。培养液中的水和营养物质可透过半透膜进入微囊供应给细胞，细胞的代谢物也可透过半透膜被排出，而细胞分泌的大分子物质则被阻留而积累于囊内。下列有关叙述错误的是
A.微囊法培养能保护细胞少受损伤，有利于大规模培养动物细胞
B.微囊法培养动物细胞，有利于获得高度纯化的大分子细胞产物
C.微囊悬浮培养能防止培养过程中出现细胞贴壁生长和接触抑制现象
D.培养时要向培养液通入95%的空气和5%的CO2组成的混合气体
√
微囊悬浮培养能防止培养过程中细胞贴壁生长，但是仍然会出现接触抑制现象，C错误。
4.(2024·沧州高三一模)目前肺类器官主要有两种培养方式：其一是诱导多能干细胞(iPS细胞)生成；其二是将肺上皮干细胞与筛选后的体细胞进行共培养(过程如图所示)。下列叙述不正确的是
A.配制动物细胞培养液时除考虑各种营养成分
外，还应考虑渗透压
B.培养肺类装配体时需定期更换培养液，以便
清除代谢废物等
C.iPS细胞具有组织特异性，只能分化成特定的
细胞或组织
D.肺类器官A和B细胞中的DNA相同，RNA和蛋白质存在差异
√
5.(2024·大庆高三二模)世界首例体细胞克隆猴在中国产生，体细胞克隆猴的成功将为人类健康作出巨大贡献，培育克隆猴的流程如图所示。据图分析，下列叙述不正确的是
A.将成纤维细胞注入去核卵母细胞前，用
灭活的仙台病毒短暂处理的目的是利于
细胞融合
B.组蛋白的甲基化和乙酰化不利于重构胚
完成细胞分裂和发育过程
C.克隆猴“中中”和“华华”的细胞质基因来自猴A和猴B
D.体细胞克隆猴的成功便于建立某些疾病模型和药物筛选
√
化，即组蛋白乙酰化和去甲基化有利于重构胚后续的胚胎发育过程，B错误。
结合题图可知，重构胚在注入Kdm4d的mRNA和TSA后，能够发育成克隆猴，而Kdm4d的mRNA表达产物为组蛋白去甲基化酶，可以使组蛋白去甲基化，TSA为组蛋白去乙酰化酶抑制剂，抑制组蛋白去乙酰化酶的作用，保持组蛋白乙酰
6.(2024·荆州高三三模)种间体细胞核移植(iSCNT)将供体动物体细胞与来自不同种的家畜去核卵母细胞融合并激活，以获得较多的重构胚，进而获得动物个体。因野生动物数量少，采集精子或卵子开展常规辅助生殖较为困难，而从活体采集体细胞利用iSCNT技术获得动物个体，可一定程度维持濒危动物数量。下列叙述正确的是
A.iSCNT技术必须通过显微操作技术将供体细胞的细胞核取出，然后注入去核
的卵母细胞
B.若从野生动物体内采集到的体细胞数目较少，可先用添加动物血清的固体培
养基培养
C.因受体不会对来自供体的胚胎发生免疫排斥反应，代孕母体可以任意选择不
同种的家畜
D.同一野生动物经iSCNT技术获得的多个重构胚中，遗传物质可能不完全相同
√
动物细胞核移植技术中普遍使用的去核方法是显微操作法，也有人采用梯度离心、紫外线短时间照射和化学物质处理等方法，A错误；
若从野生动物体内采集到的体细胞数目较少，可先用添加动物血清的液体培养基进行培养，以增加体细胞的数目，B错误；
同种胚胎移植时受体一般不会对来自供体的胚胎发生免疫排斥反应，种间胚胎移植为了保证成功率，应尽量选择亲缘关系较近的代孕母体，C错误；
在种间体细胞核移植(iSCNT)过程中，去核的卵母细胞来自不同种的家畜(驯养动物)，获得的重构胚的细胞质遗传物质可能不同，因此同一野生动物经iSCNT技术获得的多个重构胚中，遗传物质可能不完全相同，D正确。
7.(2024·朔州高三二模)VP1为引起手足口病的主要病毒EV71中的特异性结构蛋白，以VP1蛋白为抗原制备单克隆抗体的过程如图所示。下列叙述错误的是
A.克隆化培养可用液体培养基，除提
供细胞所需营养物质外，还需加入
血清
B.骨髓瘤细胞和B淋巴细胞融合与植物
原生质体融合的诱导方法相同
C.通过HAT培养基和抗体检测筛选，可得到产VP1蛋白抗体的杂交瘤细胞
D.从注射过VP1蛋白的小鼠脾脏中可获取产VP1蛋白抗体的B淋巴细胞
√
骨髓瘤细胞和B淋巴细胞融合与植物原生质体融合的诱导方法不完全相同，如诱导骨髓瘤细胞和B淋巴细胞融合过程特有的方法是灭活病毒诱导法，B错误。
8.急性肝衰竭是一种致命的疾病，死亡率很高。目前，肝移植仍然是治疗肝衰竭的唯一有效方法。由于肝脏器官的短缺，肝细胞移植被作为肝移植的替代策略。用海藻酸盐微胶囊包裹可增殖人肝细胞获得类器官，并用于移植，是治疗肝衰竭的一种有前途的策略。下列叙述错误的是
A.供体肝组织需先用胰蛋白酶将其分散，再进行原代培养
B.开放式培养肝细胞，有利于细胞代谢产生CO2及时溢出
C.异体移植细胞会发生免疫排斥，用海藻酸盐包裹有利于形成免疫保护
屏障
D.若人肝细胞类器官与空微囊治疗组的效果相当，可证明微胶囊包裹不
影响肝细胞功能
√
若海藻酸盐微胶囊包裹的可增殖人肝细胞类器官与空微囊治疗组的效果相当，说明空微囊也可以治疗肝衰竭，不能证明微胶囊包裹不影响肝细胞功能，D错误。
A.PSC经诱导分化形成精原细胞的过
程中，染色体的数目一般不会发生
变化
B.为提高受精的成功率，步骤④可加入多个分化出的精子
C.步骤⑤受精卵在体外培养时需提供95%氧气和5%CO2的混合气体环境
D.早期胚胎需培养至囊胚或桑葚胚期才能植入正常鼠的子宫
9.科研人员利用雄鼠多能干细胞(PSC)诱导产生精子，并使其成功与卵细胞进行受精作用，得到正常后代，操作流程如图所示。这项研究为治疗人类男性无精症导致的不孕不育提供了重要参考。下列分析错误的是
√
动物细胞培养需要一定的气体环境，即95%空气和5%CO2的混合气体环境，C错误。
11.(2024·绍兴高三二模)2023年，我国科学家成功地在猪胚胎中培育出含有人细胞的肾脏。科学家先利用基因编辑技术获得免疫缺陷猪胚胎，再将经特殊处理的人体干细胞注入猪胚胎的特定位置，并将胚胎移入代孕母体的子宫内进行培养，最终培育出拥有70%人细胞且功能正常的肾脏。下列叙述正确的是
A.人体干细胞培养需置于含有95%空气和5%氧气的培养箱中
B.待猪胚胎发育至原肠胚时方可注入人体干细胞
C.代孕母体需提前注射外源促性腺激素等以调整其发情周期
D.上述方法制备的肾脏移植到人体，一定不会发生免疫排斥
√
12.(2024·沧州高三三模)我国科研人员通过两种途径获得了小鼠“人造精子”——孤雄单倍体胚胎干细胞，将“人造精子”注入卵细胞后形成受精卵并成功获得多只健康小鼠，“人造精子”培育流程如图所示。下列叙述不正确的是
A.两种途径获得的小鼠“人造精子”均
使用了细胞核移植技术
B.培养过程不仅要在无菌环境中进行还
需定时更换培养基
C.利用“人造精子”进行受精的过程与
体外受精过程并不相同
D.“人造精子”为治疗某些男性不育症提供了新的思路和方法
√
据图可知，第一条途径是通过受精作用使精子细胞核进入卵细胞后再去掉卵细胞的细胞核，从而获得胚胎干细胞，第二条途径获得胚胎干细胞是先去掉卵母细胞的细胞核，
再将精子注入卵母细胞中，只有第二条途径使用了细胞核移植技术，A错误；
培养胚胎干细胞使用了动物细胞培养技术，该技术需要在无菌环境下进行，另外还需定时更换培养基，一方面为细胞提供营养物质，另一方面也可以去除细胞产生的有害物质，B正确；
“人造精子”不需要获能，将其注入卵细胞中就可进行受精作用，而参与体外受精的精子需经获能处理，C正确；
若能以这种思路培育出人类的“人
造精子”，可用于治疗因精子数量和质量问题导致的某些男性不育症，D正确。第3练　限制酶的选择 (重点突破)
1．(每空3分，共12分)(2024·河北，22节选)新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。回答下列问题：
实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为______________________________________________启动子。Nos为终止子，其作用为____________。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶____________和__________对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。
2．(每空4分，共8分)(2024·全国甲，38节选)某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。回答下列问题：
质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，与用酶a单酶切相比，用酶a和酶b双酶切的优点体现在_______________________________
__________________________________________________________(答出两点即可)；使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是________________。
3．(每空1分，共7分)(2021·福建，21节选)微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将枣树的MT基因导入大肠杆菌构建工程菌。回答下列问题：
(1)根据枣树的MT cDNA的核苷酸序列设计了相应的引物(图1甲)，通过PCR扩增MT基因。已知A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。选用的引物组合应为__________。
(2)本实验中，PCR所用的DNA聚合酶扩增出的MT基因的末端为平末端。由于载体E只有能产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将MT基因接入载体E。载体P和载体E的酶切位点及相应的酶切序列如图1乙所示。
①选用__________酶将载体P切开，再用__________(填“T4 DNA”或“E.coliDNA”)连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。
②载体P′不具有表达MT基因的__________和__________。选用__________酶组合对载体P′和载体E进行酶切，将切下的MT基因和载体E用DNA连接酶进行连接，将得到的混合物导入到用__________离子处理的大肠杆菌，筛出MT工程菌。
4．(4分)(2022·湖北，24节选)如图是S基因的cDNA和载体的限制性内切核酸酶(限制性核酸内切酶)酶谱。为了成功构建重组表达载体，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用____________________酶切割S基因的cDNA和载体。
5．(2分)(2020·北京，17节选)枯草芽孢杆菌可分泌纤维素酶。研究者筛选到一株降解纤维素能力较强的枯草芽孢杆菌菌株(B菌)，从中扩增得到了一种纤维素酶(C1酶)基因。将获得的C1酶基因与高效表达载体(HT质粒)连接，再导入B菌，以期获得降解纤维素能力更强的工程菌。
C1酶基因以B链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5′→3′。为了使C1酶基因按照正确的方向与已被酶切的HT质粒连接，扩增C1酶基因时在其两端添加了SmaⅠ和BamHⅠ的酶切位点。该基因内部没有这两种酶切位点。图中酶切位点1和2所对应的酶分别是________________________。
6．(每空4分，共8分)(2022·福建，13节选)美西螈具有很强的再生能力。研究表明，美西螈的巨噬细胞在断肢再生的早期起重要作用。为研究巨噬细胞的作用机制，科研人员制备了抗巨噬细胞表面标志蛋白CD14的单克隆抗体，具体方法如下。回答下列问题：
基因工程抗原的制备：
(1)根据美西螈CD14基因的核苷酸序列，合成引物，利用PCR扩增CD14片段。已知DNA聚合酶催化引物的3′—OH与加入的脱氧核苷酸的5′—P形成磷酸二酯键，则新合成链的延伸方向是________(填“ 5′→3′ ”或“ 3′→5′ ”)。
(2)载体和CD14片段的酶切位点及相应的酶切 抗性基因序列如图所示。用Xho Ⅰ和Sal Ⅰ分别酶切CD14和载体后连接，CD14接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA。可进一步用这两种限制酶对CD14的连接方向进行鉴定，理由是_____________________
________________________________________________________________________。
1．(每空2分，共16分)研究人员将人胰岛素基因转入大肠杆菌培育出能生产人胰岛素的工程菌，该过程所用的质粒与含人胰岛素基因的DNA上相关限制酶的酶切位点分别如图1、图2所示。BamHⅠ识别的碱基序列为G↓GATCC；BclⅠ识别的碱基序列为T↓GATCA；Sau3AⅠ识别的碱基序列为↓GATC；HindⅢ识别的碱基序列为A↓AGCTT。请回答下列问题：
(1)生产该大肠杆菌，需要获取目的基因，研究人员常从人______________细胞中获取mRNA，通过________过程得到cDNA，然后用________技术对cDNA进行扩增。
(2)用图中质粒和目的基因构建基因表达载体时，应该选择限制酶______切割质粒，选择限制酶______(只选择一种)切割目的基因，用该方法切割目的基因、质粒后______(填“能”或“不能”)防止目的基因的自身环化或与质粒的反向连接。
(3)构建基因表达载体时，若要通过PCR扩增的方法，检测目的基因是否插入质粒，应该选择图中的______(填“甲、乙”“甲、丙”或“丙、丁”)处碱基序列设计引物，若______________________，说明已成功将目的基因插入质粒。
2．(每空1分，共9分)L-天冬酰胺酶因其能水解L-天冬酰胺(丙烯酰胺的前体)，而有效降低油炸食品中潜在致癌物质丙烯酰胺的含量，在食品安全领域受到高度关注。某科研机构欲利用pET22b质粒将L-天冬酰胺酶基因导入对氨苄青霉素敏感的宿主菌中，以构建高效表达L-天冬酰胺酶的菌株。图1是L-天冬酰胺酶基因附近的限制酶切点以及基因两侧的部分碱基序列，图2是pET22b质粒的结构模式图及其涉及的限制酶切点，其中的LacZ基因编码产生的半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈蓝色，否则菌落为白色。回答下列问题：
(1)利用PCR从提取的DNA中扩增目的基因时需要引物，引物的作用是________________________________________________________________________。要将L-天冬酰胺酶基因导入到pET22b质粒中，需使用的两种限制酶是________________________。
(2)若图1下方的序列为目的基因的部分碱基序列，则获取目的基因时设计B端的引物序列是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
_________________________________________________________(只写出16个碱基即可)。
(3)利用感受态法的转化成功率并不是100%，科研人员将转化后的宿主菌接种在含氨苄青霉素和X-gal的固体培养基上，以此筛选出成功导入重组质粒的宿主菌。
①若只使用限制酶EcoRⅠ构建重组质粒，导入重组质粒的菌落呈现__________色，这些菌落__________(填“能”“不能”或“不一定能”)产生L-天冬酰胺酶，理由是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
②若使用(1)中的限制酶处理，则菌落呈______色的为符合要求的宿主菌，理由是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)能够发挥作用的L-天冬酰胺酶是由4个亚基形成的，如果选择大肠杆菌作为受体菌，只能从大肠杆菌中提取到4条单链肽链，不能得到有活性的L-天冬酰胺酶，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
3．(每空1分，共8分)(2024·西安高三三模)牛凝乳酶是一种在未断奶的小牛胃中发现的蛋白酶，它能促使牛奶凝结来生产奶酪。然而，牛凝乳酶的供应量有限，科学家将编码牛凝乳酶的基因导入大肠杆菌中，以希望实现牛凝乳酶的批量生产，其中目的基因和质粒的示意图如图所示，NcoⅠ、EcoRⅠ、XhoⅠ表示限制酶。回答下列问题：
(1)科学家从牛胃黏膜细胞中提取mRNA，通过______形成cDNA，再利用PCR技术获得目的基因，上述两个过程所需要的原料是______(填“相同”或“不同”)的。
(2)根据图中信息分析，为了将目的基因和质粒重组，需要使用限制酶和__________酶，其中应选择的两种限制酶是______________，不选择另外一种限制酶的原因是________________________________________________________________________。
(3)将目的基因和质粒连接形成重组质粒，然后导入大肠杆菌中。选择大肠杆菌作为受体细胞，是因为大肠杆菌具有_______________(答出2点)等特点。为初步筛选重组质粒是否导入大肠杆菌细胞中，需要在培养基中添加______________(填“氨苄青霉素”或“四环素”)。
(4)通过实验获取了A、B两组成功导入了重组质粒的大肠杆菌，将这两组大肠杆菌在适宜条件下培养一段时间，将两组大肠杆菌表达出的产物加入牛奶中，发现A组牛奶未凝结，B组牛奶出现凝结现象，该结果说明了______________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
4．(每空2分，共10分)(2024·汕头高三模拟)研究发现，P5CS基因能促进脯氨酸的大量合成进而提高植物耐盐碱能力。某研究小组利用基因工程等技术将从野生茄子中获得的P5CS基因(简称StP5CS基因)导入到结球甘蓝细胞中，培育出了耐盐碱的结球甘蓝转基因新品种，实验流程如图所示。
(1)过程③通过____________法将StP5CS基因导入结球甘蓝细胞中，获得耐盐碱的结球甘蓝转基因新品种。
(2)根据图示可知，Bar基因的作用是________________________；若Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ为5种限制酶及其酶切位点，为使StP5CS基因最终能正确表达，过程①应选用________(填符号)进行酶切。
(3)启动子位于基因的上游，是____________识别和结合的部位，耐盐碱的结球甘蓝转基因植株细胞是以StP5CS基因的________(填“a链”或“b链”)为模板进行转录，并最终使植株表现出耐盐碱性状。
5．(每空1分，共6分)(2024·佛山高三三模)拟南芥体内的基因X具有多个启动子，通过一种光受体对不同光质刺激进行应答，选择不同的启动子并转录出长度不同的mRNA，从而表达出存在于细胞内不同位置的蛋白质，使拟南芥呈现出不同的生长状态。其相关蛋白的合成过程如图1所示。
(1)启动子与起始密码子发挥的作用分别是_________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)据图1分析，与蛋白质X②相比，蛋白质X①的a末端在结构上的特点是________________________________________________________________________。
(3)研究人员通过特定技术，将绿色荧光蛋白(GFP)基因的片段(GFP基因不含启动子和终止子)插入基因X的特定位置，使表达出的蛋白质X①、X②能带有绿色荧光蛋白，以实现它们在细胞内的可视化，由此得到A系植株。
①根据图1，GFP基因片段不能插入基因X的B位置，原因是__________________________。
②根据图2中GFP基因两侧的碱基序列选择表格中的______________酶可以将其从染色体基因组中切割下来。
限制酶 识别序列 限制酶 识别序列
BamHⅠ G↓GATCC CCTAG↑G NotⅠ G↓CGGCCGC CGCCGGC↑G
HindⅢ A↓AGCTT TTCGA↑A EcoRⅠ G↓AATTC CTTAA↑G
(4)研究人员在A系植株的基础上，去除光受体基因后得到B系植株。随后，分别在黑暗条件和红光条件下培养A、B两系植株，培养条件及观测到荧光的部位如表所示。
植物类型 光照条件
黑暗条件 红光条件
A系植株 细胞质基质 叶绿体
B系植株 细胞质基质 细胞质基质
综合以上研究结果，红光条件下A系植株与B系植株基因X表达所使用的启动子分别是______________，判断依据是______________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案精析
真题演练
1．水稻胚乳细胞中特异表达的基因的　终止转录　HindⅢ　EcoRⅠ
解析　根据题意可知，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP(启动子)应为水稻胚乳中特异表达的基因的启动子。Nos为终止子，其作用为终止转录过程。GtP内部含有KpnⅠ的酶切位点，用KpnⅠ酶切会破坏启动子，Nos下游含有SacⅠ的酶切位点，用SacⅠ酶切会使重组基因表达载体缺失终止子，故构建基因表达载体时，可选择限制酶HindⅢ和EcoRⅠ对r2HN基因与载体进行酶切。
2．避免目的基因和质粒的反向连接，防止目的基因和质粒的自身环化　T4 DNA连接酶
解析　构建重组质粒时，与单酶切相比，采用双酶切法可以形成不同的黏性末端，双酶切可以避免目的基因和质粒的反向连接，防止目的基因和质粒的自身环化。酶c单酶切后形成平末端，宜选用T4 DNA连接酶连接。
3．(1)引物1和引物4　(2)①EcoRⅤ　T4 DNA　②启动子　终止子　XhoⅠ和PstⅠ　钙
解析　(1)密码子位于mRNA上，是决定氨基酸的三个相邻碱基，起始密码子和终止密码子分别控制翻译的开始和结束，故为保证基因的正常表达，一对引物应分别位于位点A和位点B的两侧，故选择引物1和引物4。(2)①MT基因的末端为平末端，故需要用EcoRⅤ或SmaⅠ切割载体P，但后续需进一步将重组载体P′和载体E连接，故需将MT基因插入XhoⅠ和PstⅠ两个酶切位点之间，故选EcoRⅤ将载体P切开；MT基因的末端为平末端，选用T4 DNA连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。②载体P′是重组质粒，故不含有表达MT基因的启动子和终止子；为避免自身环化和反向连接，可选用两种酶切割两种载体，据图可知，载体P′和载体E均含有XhoⅠ和PstⅠ酶切位点，故可选用XhoⅠ和PstⅠ酶组合进行酶切；将目的基因导入大肠杆菌的方法是钙离子处理法。
4．XbaⅠ、HindⅢ
解析　为了成功构建重组表达载体，不破坏载体关键结构和目的基因，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用XbaⅠ、HindⅢ酶切割S基因的cDNA和载体。
5．BamHⅠ、SmaⅠ(顺序不能调换)
解析　C1酶基因以B链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5′→3′，即转录是从DNA链的3′端开始，再结合HT质粒中启动子的方向可知，图中酶切位点1和2所对应的酶分别是BamHⅠ、SmaⅠ。
6．(1)5′→3′　(2)正向连接的重组DNA有这两种酶的酶切位点(限制酶的识别序列)；而反向连接的重组DNA会形成新的序列，没有这两种酶的酶切位点(没有限制酶的识别序列)
解析　(1)PCR扩增时，DNA聚合酶催化引物的3′－OH与加入的脱氧核苷酸的5′－P形成磷酸二酯键，因此新链合成的方向是5′→3′。(2)可进一步用限制酶XhoⅠ和SalⅠ对CD14的连接方向进行鉴定，是因为正向连接的重组DNA有这两种酶的酶切位点(限制酶的识别序列)；而反向连接的重组DNA会形成新的序列，没有这两种酶的酶切位点(没有限制酶的识别序列)。
模拟预测
1．(1)胰岛B　逆转录(反转录)　PCR　(2)BamHⅠ　Sau3AⅠ　不能　(3)甲、丙　能成功扩增出DNA片段
解析　(2)目的基因应位于启动子和终止子之间，破坏Y抗生素抗性基因更加有利于目的基因的检测与鉴定，图中的BamHⅠ、BclⅠ的识别序列均包含Sau3AⅠ的识别序列，因此应选用限制酶BamHⅠ切割质粒，选用Sau3AⅠ切割含目的基因的DNA片段。BamHⅠ、Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成的黏性末端相同，不能防止目的基因的自身环化或与质粒的反向连接。(3)选择同时包含质粒、目的基因的碱基序列设计引物，若能成功扩增出DNA片段，说明目的基因已成功插入，而选择“甲、乙”或“丙、丁”，无论是否插入，都能扩增出DNA片段。
2．(1)使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸　KpnⅠ、EcoRⅠ　(2)3′－TAAGTTGTCTCTTAAG－5′　(3)①白　不一定能　EcoRⅠ切割目的基因和质粒产生的黏性末端相同，构建的重组质粒可能是目的基因和质粒反向连接而成，目的基因无法正常表达　②白　重组质粒由于LacZ基因被切断，无法合成半乳糖苷酶，不能分解X gal，菌落呈白色　(4)大肠杆菌细胞内无内质网和高尔基体等细胞器，不能对肽链进行加工、折叠形成具有一定空间结构的蛋白质
解析　(1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。引物的作用：使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。若用PstⅠ或BglⅡ会破坏目的基因，若用BamHⅠ会破坏氨苄青霉素抗性基因。若用EcoRⅠ对目的基因和质粒进行切割，由于切割后目的基因和质粒两端的黏性末端相同，因此至少会产生4种连接产物，即目的基因自身环化、质粒自身环化、目的基因和质粒正向连接以及目的基因和质粒反向连接。用KpnⅠ和EcoRⅠ对目的基因和质粒进行切割，切割后目的基因和质粒两端的黏性末端不相同，因此不会出现自身环化和反向连接的情况。(2)获取目的基因时设计B端的引物，B端的引物是与B端的3′端互补配对，同时，要在引物的5′端添加EcoRⅠ的识别序列，因此B端的引物序列是3′－TAAGTTGTCTCTTAAG－5′。(3)若用EcoRⅠ对目的基因和质粒进行切割，由于切割后目的基因和质粒两端的黏性末端相同，因此至少会产生4种连接产物，即目的基因自身环化、质粒自身环化、目的基因和质粒正向连接以及目的基因和质粒反向连接，重组质粒由于LacZ基因被切断，无法合成半乳糖苷酶，不能分解X gal，菌落呈白色，但重组质粒可能是目的基因和质粒反向连接而成，目的基因无法正常表达，因此呈白色的菌落不一定能产生L 天冬酰胺酶。用EcoRⅠ和KpnⅠ对目的基因和质粒进行切割，切割后目的基因和质粒两端的黏性末端不相同，因此不会出现自身环化和反向连接的情况，但重组质粒由于LacZ基因被切断，无法合成半乳糖苷酶分解X gal，菌落呈白色，因此白色的菌落为成功导入重组质粒的宿主菌。(4)能够发挥作用的L 天冬酰胺酶是由4个亚基形成的，如果选择大肠杆菌作为受体菌，大肠杆菌是原核生物，细胞内只有核糖体，只能形成肽链，无内质网和高尔基体等细胞器，不能对肽链进行加工、折叠形成具有一定空间结构的蛋白质，因此，不能得到有活性的L 天冬酰胺酶。
3．(1)逆转录(反转录)　相同　(2)DNA连接　NcoⅠ和XhoⅠ　会破坏目的基因　(3)繁殖快、为单细胞、遗传物质相对较少、易培养　氨苄青霉素　(4)A组转基因大肠杆菌没有成功表达出具有正常生理功能的牛凝乳酶，B组转基因大肠杆菌成功表达了具有正常生理功能的牛凝乳酶
解析　(2)在构建基因表达载体过程中，需要用相同的限制酶切割质粒和目的基因，获得相同的黏性(平)末端，再用DNA连接酶将目的基因和质粒通过磷酸二酯键连接；据图分析，EcoRⅠ的识别序列位于目的基因中段，若使用该酶切割会破坏目的基因，因此只能选择目的基因和质粒上都有的且不破坏目的基因的NcoⅠ和XhoⅠ；据以上分析，不选用EcoRⅠ的原因是会破坏目的基因。(3)大肠杆菌作为原核细胞，具有繁殖周期短、易培养、是单细胞生物以及细胞中遗传物质相对较少的优点；根据题(2)选择的NcoⅠ和XhoⅠ会破坏抗四环素基因，但抗氨苄青霉素基因是完好的，因此以抗氨苄青霉素基因为抗性基因，在初步筛选重组质粒时，需要在培养基中添加氨苄青霉素。(4)将A组大肠杆菌表达产物加入牛奶，牛奶未凝结，说明A组大肠杆菌未表达出牛凝乳酶或表达出的牛凝乳酶不具有生理活性，即A组转基因大肠杆菌没有成功表达出具有正常生理功能的牛凝乳酶，A组转基因大肠杆菌培养失败；将B组大肠杆菌表达产物加入牛奶，牛奶凝结，说明B组大肠杆菌成功表达出了具有促使牛奶凝结功能的牛凝乳酶，即B组转基因大肠杆菌成功表达了具有正常生理功能的牛凝乳酶，B组转基因大肠杆菌培养成功。
4．(1)农杆菌转化　(2)作为标记基因，起筛选作用　Ⅲ和Ⅳ(3)RNA聚合酶　b链
解析　(2)基因表达载体应包括启动子、终止子、目的基因、标记基因、复制原点等，据图可知，图中的Bar基因属于标记基因，其作用是起筛选作用；据图可知，图中目的基因两侧都有Ⅱ的酶切位点，可能导致自身环化等问题，不能选择，且Ⅰ会破坏目的基因，也不能选择，又因为酶切位点应位于载体的启动子和终止子之间，则Ⅴ也不能选择，故最终选择Ⅲ和Ⅳ进行酶切。
5．(1)驱动基因的转录、翻译开始的信号　(2)含有叶绿体转移信号　(3)①GFP基因片段应插入基因X内启动子②的下游　②BamHⅠ、NotⅠ　(4)启动子①、启动子②　在光受体作用下A系植株选择启动子①表达出蛋白质X①，B系植株没有被激活
解析　(3)分析题图1可知，GFP基因片段应插入基因X内启动子②的下游，即字母C表示的特定位置，从而经过转录、翻译得到目的产物。限制酶能识别DNA分子中特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，分析题图2可知，序列中含有GGATCC序列和GCGGCCGC序列，故应选择表中的BamHⅠ和NotⅠ酶将GFP基因从染色体基因组中切割下来。(4)分析表中数据可知，与去除光受体基因后得到B系植株相比，A系植株能对红光刺激作出应答被激活，原因是在光受体作用下A系植株选择启动子①表达出蛋白质X①，B系植株无法被激活，应是启动子②。(共47张PPT)
专题八　
第3练
限制酶的选择
1.(2024·河北，22节选)新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。回答下列问题：
实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为________________________________启动子。Nos为终止子，其作用为__________。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶________和_________对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。
真题演练
PART ONE
水稻胚乳细胞中特异表达的基因的
终止转录
HindⅢ
EcoRⅠ
根据题意可知，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP(启动子)应为水稻胚乳中特异表达的基因的启动子。Nos为终止子，其作用为终止转录过程。GtP内部含有KpnⅠ的酶切位点，用KpnⅠ酶切会破坏启动子，Nos下游含有SacⅠ的酶切位点，用SacⅠ酶切会使重组基因表达载体缺失终止子，故构建基因表达载体时，可选择限制酶HindⅢ和EcoRⅠ对r2HN基因与载体进行酶切。
2.(2024·全国甲，38节选)某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。回答下列问题：
质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，与用酶a单酶切相比，用酶a和酶b双酶切的优点体现在____________________________________________________________
(答出两点即可)；使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是_______________。
避免目的基因和质粒的反向连接，防止目的基因和质粒的自身环化
T4 DNA连接酶
构建重组质粒时，与单酶切相比，采用双酶切法可以形成不同的黏性末端，双酶切可以避免目的基因和质粒的反向连接，防止目的基因和质粒的自身环化。酶c单酶切后形成平末端，宜选用T4 DNA连接酶连接。
3.(2021·福建，21节选)微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将枣树的MT基因导入大肠杆菌构建工程菌。回答下列问题：
(1)根据枣树的MT cDNA的核苷酸序列设计了相应的引物(图1甲)，通过PCR扩增MT基因。已知A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。选用的引物组合应为______________。
引物1和引物4
密码子位于mRNA上，是决定氨基酸的三个相邻碱基，起始密码子和终止密码子分别控制翻译的开始和结束，故为保证基因的正常表达，一对引物应分别位于位点A和位点B的两侧，故选择引物1和引物4。
(2)本实验中，PCR所用的DNA聚合酶扩增出的MT基因的末端为平末端。由于载体E只有能产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将MT基因接入载体E。载体P和载体E的酶切位点及相应的酶切序列如图1乙所示。
①选用________酶将载体P切开，再用
_________(填“T4 DNA”或“E.coliDNA”)连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。
EcoRⅤ
T4 DNA
MT基因的末端为平末端，故需要用EcoRⅤ或SmaⅠ切割载体P，但后续需进一步将重组载体P′和载体E连接，故需将MT基因插入XhoⅠ和PstⅠ两个酶切位点之间，故选EcoRⅤ将载体P切开；MT基因的末
端为平末端，选用T4 DNA连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。
②载体P′不具有表达MT基因的_______和________。选用______________酶组合对载体P′和载体E进行酶切，将切下的MT基因和载体E用DNA连接酶进行连接，将得到的混合物导入到用____离子处理的大肠杆菌，筛出MT工程菌。
启动子
终止子
XhoⅠ和PstⅠ
钙
载体P′是重组质粒，故不含有表达MT基因的启动子和终止子；为避免自身环化和反向连接，可选用两种酶切割两种载体，据图可知，载体P′和载体E均含有XhoⅠ和PstⅠ酶切位点，故可选用XhoⅠ和PstⅠ酶组合进行酶切；将目的基因导入大肠杆菌的方法是钙离子处理法。
4.(2022·湖北，24节选)如图是S基因的cDNA和载体的限制性内切核酸酶(限制性核酸内切酶)酶谱。为了成功构建重组表达载体，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用________________酶切割S基因的cDNA和载体。
XbaⅠ、HindⅢ
为了成功构建重组表达载体，不破坏载体关键结构和目的基因，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用XbaⅠ、HindⅢ酶切割S基因的cDNA和载体。
5.(2020·北京，17节选)枯草芽孢杆菌可分泌纤维素酶。研究者筛选到一株降解纤维素能力较强的枯草芽孢杆菌菌株(B菌)，从中扩增得到了一种纤维素酶(C1酶)基因。将获得的C1酶基因与高效表达载体(HT质粒)连接，再导入B菌，以期获得降解纤维素能力更强的工程菌。
C1酶基因以B链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5′→3′。为了使C1酶基因按照正确的方向与已被酶切的HT质粒连接，扩增C1酶基因时在其两端添加了SmaⅠ和BamHⅠ的酶切位点。该基因内部没有这两种酶切位点。图中酶切位点1和2所对应的酶分别是______________________________。
BamHⅠ、SmaⅠ(顺序不能调换)
C1酶基因以B链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5′→3′，即转录是从DNA链的3′端开始，再结合HT质粒中启动子的方向可知，图中酶
切位点1和2所对应的酶分别是BamHⅠ、SmaⅠ。
6.(2022·福建，13节选)美西螈具有很强的再生能力。研究表明，美西螈的巨噬细胞在断肢再生的早期起重要作用。为研究巨噬细胞的作用机制，科研人员制备了抗巨噬细胞表面标志蛋白CD14的单克隆抗体，具体方法如下。回答下列问题：
基因工程抗原的制备：
(1)根据美西螈CD14基因的核苷酸序列，合成引物，利用PCR扩增CD14片段。已知DNA聚合酶催化引物的3′—OH与加入的脱氧核苷酸的5′—P形成磷酸二酯键，则新合成链的延伸方向是________(填“ 5′→3′ ”或“ 3′→5′ ”)。
5′→3′
PCR扩增时，DNA聚合酶催化引物的3′－OH与加入的脱氧核苷酸的5′－P形成磷酸二酯键，因此新链合成的方向是5′→3′。
(2)载体和CD14片段的酶切位点及相应的酶切 抗性基因序列如图所示。用Xho Ⅰ和Sal Ⅰ分别酶切CD14和载体后连接，CD14接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA。可进一步用这两种限制酶对CD14的连接方向进行鉴定，理由是_____________________________________
__________________________________________________________________________________________________________。
正向连接的重组DNA有这两种酶的酶切位点(限制酶的识别序列)；而反向连接的重组DNA会形成新的序列，没有这两种酶的酶切位点(没有限制酶的识别序列)
可进一步用限制酶XhoⅠ和SalⅠ对CD14的连接方向进行鉴定，是因为正向连接的重组DNA有这两种酶的酶切位点(限制酶的识别序列)；而反向连接的重组DNA会形成新的序列，没有这两种酶的酶切位点(没有限制酶的识别序列)。
1.研究人员将人胰岛素基因转入大肠杆菌培育出能生产人胰岛素的工程菌，该过程所用的质粒与含人胰岛素基因的DNA上相关限制酶的酶切位点分别如图1、图2所示。BamHⅠ识别的碱基序列为G↓GATCC；BclⅠ识别的碱基序列为T↓GATCA；Sau3AⅠ识别的碱基序列为↓GATC；HindⅢ识别的碱基序列为A↓AGCTT。请回答下列问题：
模拟预测
PART TWO
(1)生产该大肠杆菌，需要获取目的基因，研究人员常从人_______细胞中获取mRNA，通过________________过程得到cDNA，然后用______技术对cDNA进行扩增。
(2)用图中质粒和目的基因构建基因表达载体时，应该选择限制酶_________切割质粒，选择限制酶________(只选择一种)切割目的基因，
胰岛B
逆转录(反转录)
PCR
BamHⅠ
用该方法切割目的基因、质粒后______(填“能”或“不能”)防止目的基因的自身环化或与质粒的反向连接。
Sau3AⅠ
不能
目的基因应位于启动子和终止子之间，破坏Y抗生素抗性基因更加有利于目的基因的检测与鉴定，图中的BamHⅠ、BclⅠ的识别序列均包含Sau3AⅠ的识别序列，因此应选用限制酶BamHⅠ切割质粒，选用Sau3AⅠ切割含目的基因的DNA片段。BamHⅠ、Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成
的黏性末端相同，不能防止目的基因的自身环化或与质粒的反向连接。
(3)构建基因表达载体时，若要通过PCR扩增的方法，检测目的基因是否插入质粒，应该选择图中的________(填“甲、乙”“甲、丙”或“丙、丁”)处碱基序列设计引物，若_______
________________，说明已成功将目的基因插入质粒。
甲、丙
能成功
扩增出DNA片段
选择同时包含质粒、目的基因的碱基序列设计引物，若能成功扩增出DNA片段，说明目的基因已成功插入，而选择“甲、乙”或“丙、丁”，无论是否插入，都能扩增出DNA片段。
2.L-天冬酰胺酶因其能水解L-天冬酰胺(丙烯酰胺的前体)，而有效降低油炸食品中潜在致癌物质丙烯酰胺的含量，在食品安全领域受到高度关注。某科研机构欲利用pET22b质粒将L-天冬酰胺酶基因导入对氨苄青霉素敏感的宿主菌中，以构建高效表达L-天冬酰胺酶的菌株。图1是L-天冬酰胺酶基因附近的限制酶切点以及基因两侧的部分碱基序列，图2是pET22b质粒的结构模式图及其涉及的限制酶切点，其中的LacZ基因编码产生的半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈蓝色，否则菌落为白色。回答下列问题：
(1)利用PCR从提取的DNA中扩增目的基因时需要引物，引物的作用是_______________________________________________。要将L-天冬酰胺酶基因导入到pET22b质粒中，需使用的两种限制酶是________________。
使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
KpnⅠ、EcoRⅠ
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。引物的作用：使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。若用PstⅠ或BglⅡ会破坏目的基因，若用BamHⅠ会破
坏氨苄青霉素抗性基因。若用EcoRⅠ对目的基因和质粒进行切割，由于切割后目的基因和质粒两端的黏性末端相同，因此至少会产生4种连接产物，即目的基因自身环化、质粒自身环化、目的基因和质粒正向连接以及目的基因和质粒反向连接。用KpnⅠ和EcoRⅠ对目的基因和质粒进行切割，切割后目的基因和质粒两端的黏性末端不相同，因此不会出现自身环化和反向连接的情况。
(2)若图1下方的序列为目的基因的部分碱基序列，则获取目的基因时设计B端的引物序列是_________________________________(只写出16个碱基即可)。
3′－TAAGTTGTCTCTTAAG－5′
获取目的基因时设计B端的引物，B端的引物是与B端的3′端互补配对，同时，要在引物的5′端添加EcoRⅠ的识别序列，因此B端的引物序列是3′－TAAGTTGTCTCTTAAG－5′。
或“不一定能”)产生L-天冬酰胺酶，理由是_____________________________
_________________________________________________________________________________________。
②若使用(1)中的限制酶处理，则菌落呈___色的为符合要求的宿主菌，理由是____________________________________________________________________________。
(3)利用感受态法的转化成功率并不是100%，科研人员将转化后的宿主菌接种在含氨苄青霉素和X-gal的固体培养基上，以此筛选出成功导入重组质粒的宿主菌。
①若只使用限制酶EcoRⅠ构建重组质粒，导入重组质粒的菌落呈现___色，这些菌落_________(填“能” “不能”
白
不一定能
EcoRⅠ切割目的基因和质粒产生的黏性末端相同，构建的重组质粒可能是目的基因和质粒反向连接而成，目的基因无法正常表达
白
重组质粒由于LacZ基因被切断，无法合成半乳糖苷酶，不能分解X-gal，菌落呈白色
若用EcoRⅠ对目的基因和质粒进行切割，由于切割后目的基因和质粒两端的黏性末端相同，因此至少会产生4种连接产物，即目的基因自身环化、质粒自身环化、目的基因和质粒正向连接以及目的基因和质粒反向连接，重组质粒由于LacZ基因被切断，
无法合成半乳糖苷酶，不能分解X-gal，菌落呈白色，但重组质粒可能是目的基因和质粒反向连接而成，目的基因无法正常表达，因此呈白色的菌落不一定能产生L-天冬酰胺酶。用EcoRⅠ和KpnⅠ对目的基因和质粒进行切割，切割后目的基因和质粒两端的黏性末端不相同，因此不会出现自身环化和反向连接的情况，但重组质粒由于LacZ基因被切断，无法合成半乳糖苷酶分解X-gal，菌落呈白色，因此白色的菌落为成功导入重组质粒的宿主菌。
(4)能够发挥作用的L-天冬酰胺酶是由4个亚基形成的，如果选择大肠杆菌作为受体菌，只能从大肠杆菌中提取到4条单链肽链，不能得到有活性的L-天冬酰胺酶，原因是____________________________________________
________________________________________________________。
大肠杆菌细胞内无内质网和高尔基体等细胞器，不能对肽链进行加工、折叠形成具有一定空间结构的蛋白质
能够发挥作用的L-天冬酰胺酶是由4个亚基形成的，如果选择大肠杆菌作为受体菌，大肠杆菌是原核生物，细胞内只有核糖体，只能形成肽链，无内质网和高尔基体等细胞器，不能对肽链进行加工、折叠形成具有一定空间结构的蛋白质，因此，不能得到有活性的L-天冬酰胺酶。
3.(2024·西安高三三模)牛凝乳酶是一种在未断奶的小牛胃中发现的蛋白酶，它能促使牛奶凝结来生产奶酪。然而，牛凝乳酶的供应量有限，科学家将编码牛凝乳酶的基因导入大肠杆菌中，以希望实现牛凝乳酶的批量生产，其中目的基因和质粒的示意图如图所示，NcoⅠ、EcoRⅠ、XhoⅠ表示限制酶。回答下列问题：
(1)科学家从牛胃黏膜细胞中提取mRNA，通过__________________形成cDNA，再利用PCR技术获得目的基因，上述两个过程所需要的原料是______(填“相同”或“不同”)的。
逆转录(反转录)
相同
(2)根据图中信息分析，为了将目的基因和质粒重组，需要使用限制酶和__________酶，其中应选择的两种限制酶是______________，不选择另外一种限制酶的原因是_______________。
DNA连接
NcoⅠ和XhoⅠ
会破坏目的基因
都有的且不破坏目的基因的NcoⅠ和XhoⅠ；据以上分析，不选用EcoRⅠ的原因是会破坏目的基因。
在构建基因表达载体过程中，需要用相同的限制酶切割质粒和目的基因，获得相同的黏性(平)末端，再用DNA连接酶将目的基因和质粒通过磷酸二酯键连接；据图分析，EcoRⅠ的识别序列位于目的基因中段，若使用该酶切割会破坏目的基因，因此只能选择目的基因和质粒上
(3)将目的基因和质粒连接形成重组质粒，然后导入大肠杆菌中。选择大肠杆菌作为受体细胞，是因为大肠杆菌具有_________________________
____________________(答出2点)等特点。为初步筛选重组质粒是否导入大肠杆菌细胞中，需要在培养基中添加____________(填“氨苄青霉素”或“四环素”)。
繁殖快、为单细胞、遗传物
质相对较少、易培养
氨苄青霉素
大肠杆菌作为原核细胞，具有繁殖周期短、易培养、是单细胞生物以及细胞中遗传物质相对较少的优点；根据题(2)选择的NcoⅠ和XhoⅠ会破坏抗四环素基因，但抗氨苄青霉素基因是完好的，因此以抗氨苄青霉素基因为抗性基因，在初步筛选重组质粒时，需要在培养基中添加氨苄青霉素。
(4)通过实验获取了A、B两组成功导入了重组质粒的大肠杆菌，将这两组大肠杆菌在适宜条件下培养一段时间，将两组大肠杆菌表达出的产物加入牛奶中，发现A组牛奶未凝结，B组牛奶出现凝结现象，该结果说明了_____________________________________________________________________________________________________________________。
A组转基因大肠杆菌没有成功表达出具有正常生理功能的牛凝乳酶，B组转基因大肠杆菌成功表达了具有正常生理功能的牛凝乳酶
的牛凝乳酶，即B组转基因大肠杆菌成功表达了具有正常生理功能的牛凝乳酶，B组转基因大肠杆菌培养成功。
将A组大肠杆菌表达产物加入牛奶，牛奶未凝结，说明A组大肠杆菌未表达出牛凝乳酶或表达出的牛凝乳酶不具有生理活性，即A组转基因大肠杆菌没有成功表达出具有正常生理功能的牛凝乳酶，A组转基因大肠杆菌培养失败；将B组大肠杆菌表达产物加入牛奶，牛奶凝结，说明B组大肠杆菌成功表达出了具有促使牛奶凝结功能
4.(2024·汕头高三模拟)研究发现，P5CS基因能促进脯氨酸的大量合成进而提高植物耐盐碱能力。某研究小组利用基因工程等技术将从野生茄子中获得的P5CS基因(简称StP5CS基因)导入到结球甘蓝细胞中，培育出了耐盐碱的结球甘蓝转基因新品种，实验流程如图所示。
(1)过程③通过____________法将StP5CS基因导入结球甘蓝细胞中，获得耐盐碱的结球甘蓝转基因新品种。
农杆菌转化
(2)根据图示可知，Bar基因的作用是__________________________；若Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ为5种限制酶及其酶切位点，为使StP5CS基因最终能正确表达，过程①应选用_______(填符号)进行酶切。
作为标记基因，起筛选作用
Ⅲ和Ⅳ
基因表达载体应包括启动子、终止子、目的基因、标记基因、复制原点等，据图可知，图中的Bar基因属于标记基因，其作用是起筛选作用；据图可知，
图中目的基因两侧都有Ⅱ的酶切位点，可能导致自身环化等问题，不能选择，且Ⅰ会破坏目的基因，也不能选择，又因为酶切位点应位于载体的启动子和终止子之间，则Ⅴ也不能选择，故最终选择Ⅲ和Ⅳ进行酶切。
(3)启动子位于基因的上游，是____________识别和结合的部位，耐盐碱的结球甘蓝转基因植株细胞是以StP5CS基因的_____(填“a链”或“b链”)为模板进行转录，并最终使植株表现出耐盐碱性状。
RNA聚合酶
b链
5.(2024·佛山高三三模)拟南芥体内的基因X具有多个启动子，通过一种光受体对不同光质刺激进行应答，选择不同的启动子并转录出长度不同的mRNA，从而表达出存在于细胞内不同位置的蛋白
质，使拟南芥呈现出不同的生长状态。其相关蛋白的合成过程如图1所示。
(1)启动子与起始密码子发挥的作用分别是___________________________
_____。
驱动基因的转录、翻译开始的
信号
(2)据图1分析，与蛋白质X②相比，蛋白质X①的a末端在结构上的特点是____
__________________。
(3)研究人员通过特定技术，将绿色荧光蛋白(GFP)基因的片段(GFP基因不含启
动子和终止子)插入基因X的特定位置，使表达出的蛋白质X①、X②能带有绿色荧光蛋白，以实现它们在细胞内的可视化，由此得到A系植株。
①根据图1，GFP基因片段不能插入基因X的B位置，原因是___________
_______________________________。
含
有叶绿体转移信号
GFP基因片
段应插入基因X内启动子②的下游
②根据图2中GFP基因两侧的碱基序列选择表格中的________________酶可以将其从染色体基因组中切割下来。
限制酶 识别序列 限制酶 识别序列
BamHⅠ G↓GATCC CCTAG↑G NotⅠ G↓CGGCCGC
CGCCGGC↑G
HindⅢ A↓AGCTT TTCGA↑A EcoRⅠ G↓AATTC
CTTAA↑G
BamHⅠ、NotⅠ
分析题图1可知，GFP基因片段应插入基因X内启动子②的下游，即字母C表示的特定位置，从而经过转录、翻译得到目的产物。限制酶能识别DNA分子中特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，分析题图2可
知，序列中含有GGATCC序列和GCGGCCGC序列，故应选择表中的BamHⅠ和NotⅠ酶将GFP基因从染色体基因组中切割下来。
(4)研究人员在A系植株的基础上，去除光受体基因后得到B系植株。随后，分别在黑暗条件和红光条件下培养A、B两系植株，培养条件及观测到荧光的部位如表所示。
植物类型 光照条件
黑暗条件 红光条件
A系植株 细胞质基质 叶绿体
B系植株 细胞质基质 细胞质基质
综合以上研究结果，红光条件下A系植株与B系植株基因X表达所使用的启动子分别是_____________________，判断依据是__________________
____________________________________________________。
启动子①、启动子②
植株选择启动子①表达出蛋白质X①，B系植株没有被激活
在光受体作用下A系
分析表中数据可知，与去除光受体基因后得到B系植株相比，A系植株能对红光刺激作出应答被激活，原因是在光受体作用下A系植株选择启动子①表达出蛋白质X①，B系植株无法被激活，应是启动子②。
植物类型 光照条件
黑暗条件 红光条件
A系植株 细胞质基质 叶绿体
B系植株 细胞质基质 细胞质基质第4练　PCR的综合应用 (重点突破)
1.(10分)(2019·全国Ⅰ，38节选)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题：
(1)(6分)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是____________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是________________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的________。
(2)(4分)目前在PCR反应中使用Taq DNA聚合酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
2．(每空2分，共12分)(2021·全国甲，38)PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题：
(1)若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是________(用数字序号表示)。
(2)操作③中使用的酶是______________，PCR 反应中的每次循环可分为变性、复性、______三步，其中复性的结果是______________________________________________。
(3)为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与____________特异性结合。
(4)PCR(聚合酶链式反应)技术是指_____________________________________________
________________________________________________________________________。
该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
3．(每空3分，共6分)(2024·全国甲，39节选)某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。该同学利用PCR扩增目的基因。PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中DNA双链打开成为单链的阶段是________，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是______。
4．(5分)(2024·安徽，20节选)丁二醇广泛应用于化妆品和食品等领域。兴趣小组在已改造的大肠杆菌中引入合成丁二醇的关键基因X，以提高丁二醇的产量。扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶，原因是____________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
5．(每空2分，共10分)(2021·天津，16节选)乳酸菌是乳酸的传统生产菌，但耐酸能力较差，影响产量。酿酒酵母耐酸能力较强，但不产生乳酸。研究者将乳酸菌的乳酸脱氢酶基因(LDH)导入酿酒酵母，获得能产生乳酸的工程菌株。如图1为乳酸和乙醇发酵途径示意图，图2为构建表达载体时所需的关键条件。
获得转基因酿酒酵母菌株的过程如下：
(1)设计引物扩增乳酸脱氢酶编码序列。
为使扩增出的序列中编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，且能通过双酶切以正确方向插入质粒，需设计引物1和2。其中引物1的5′端序列应考虑________________和________________。
(2)将上述PCR产物和质粒重组后，导入大肠杆菌，筛选、鉴定，扩增重组质粒。重组质粒上有________________，所以能在大肠杆菌中扩增。启动子存在物种特异性，易被本物种的转录系统识别并启动转录，因此重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列________(填“能”或“不能”)在大肠杆菌中高效表达。
(3)提取重组质粒并转入不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株，在________________的固体培养基上筛选出转基因酿酒酵母，并进行鉴定。
6．(每空1分，共7分)(2022·天津，15)研究者拟构建高效筛选系统，将改进的苯丙氨酸合成关键酶基因P1导入谷氨酸棒状杆菌，以提高苯丙氨酸产量。
(1)如图是该高效筛选系统载体的构建过程。载体1中含有KanR(卡那霉素抗性基因)和SacB两个标记基因，为去除筛选效率较低的SacB，应选择引物________和________，并在引物的________(填“5′”或“3′”)端引入XhoⅠ酶识别序列，进行PCR扩增，产物经酶切、连接后环化成载体2。
(2)PCR扩增载体3中筛选效率较高的标记基因RpsL(链霉素敏感基因)时，引物应包含__________(填“EcoRⅠ”“HindⅢ”或“XhoⅠ”)酶识别序列，产物经单酶切后连接到载体2构建高效筛选载体4。
(3)将改进的P1基因整合到载体4构建载体5。将载体5导入链霉素不敏感(由RpsL突变造成)、卡那霉素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5的菌株，应采用含有____________的平板进行初步筛选。
(4)用一定的方法筛选出如下菌株：P1基因脱离载体5并整合到受体菌拟核DNA，且载体5上其他DNA片段全部丢失。该菌的表型为______________。
A．卡那霉素不敏感、链霉素敏感
B．卡那霉素敏感、链霉素不敏感
C．卡那霉素和链霉素都敏感
D．卡那霉素和链霉素都不敏感
(5)可采用________技术鉴定成功整合P1基因的菌株。之后以发酵法检测苯丙氨酸产量。
7．(每空2分，共8分)(2020·海南，25节选)某课题组用生物技术制备转基因小鼠的过程，如图所示。回答下列问题：
(1)通常把目的基因转入雄原核而不是雌原核，从两者形态差异上分析，原因是________________________________。
(2)把桑葚胚植入假孕母鼠子宫前，需要对胚胎进行性别鉴定，目前最有效的方法是SRY－PCR法。操作的基本程序是先从被测胚胎中取出几个细胞，提取DNA，然后用位于Y染色体的性别决定基因，即SRY基因的一段碱基设计__________，以胚胎细胞中的DNA作为模板，进行PCR扩增，最后用SRY特异性探针检测扩增产物。出现阳性反应者，胚胎为________；出现阴性反应者，胚胎为________。
1．(每空1分，共6分)(2024·池州高三二模)据相关流感监测报告显示，目前流感以甲流为主，甲流病毒核酸检测方便快捷，可以为临床诊断提供可靠依据。病毒核酸检测的方法为实时荧光定量PCR(qPCR)检测法，在PCR扩增时加入能与目的基因(甲流病毒的N基因)结合的荧光探针，技术流程及相关步骤如图所示。回答下列问题：
(1)图中步骤1提取RNA过程中加入蛋白酶K和RNA酶抑制剂的作用是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)qPCR过程中，需先以RNA为模板，经过________过程合成cDNA，设计一对引物。为确保甲流病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据甲流病毒cDNA两条链中的______(填“3′”或“5′”)端来进行。
(3)在配制PCR扩增缓冲液时，加入的荧光探针序列为5′－ACCGA……AATGC－3′，如果模板中存在N基因序列，与探针结合的序列应该是5′－________________________－3′。在扩增过程中，若探针完整时，不产生荧光，当探针被酶X(Taq DNA聚合酶)水解时，R与Q分离，即可检测出R发出荧光。由此可推测，探针的水解发生在PCR________阶段。
(4)在qPCR中ct值含义是“每个反应管内荧光强度达到设定阈值时所经历的循环数”，根据某试剂盒说明书显示ct≤40则为阳性，若每分子探针水解释放的荧光强度为a，加入模板RNA数为b，则设定的荧光强度阈值应为________。
2．(每空1分，共7分)(2024·淄博高三一模)重叠延伸PCR技术是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术，可通过定点诱变在体外改造DNA分子，并将改造后的目的基因导入质粒构建目的基因表达载体。
(1)图示的重叠延伸PCR技术中，PCR1的引物是________。PCR4可获得大量定点诱变目的基因，此时的引物为__________。PCR3时模板DNA不能选择DNA分子③的原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)为使重叠延伸PCR技术改造后的目的基因(该基因序列不含图中限制酶的识别序列)能与载体正确连接，PCR4时，应在基因上、下游引物的__________端分别添加限制酶____________的识别序列。
(3)将目的基因、质粒及大肠杆菌混合，温育一段时间后涂在含四环素的平板上培养，一段时间后平板上长出菌落。这些菌落的菌体内________(填“一定”或“不一定”)含有目的基因，理由是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
3．(每空1分，共9分)(2024·白银高三模拟)DNA测序技术是一项基础性的生命科学技术，它的出现和发展推动了生命科学的快速发展。桑格－库森法以DNA合成反应为基础，利用双脱氧法测序，需要用到32P标记的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)与脱氧核苷三磷酸(dNTP)。ddNTP与dNTP的结构如图所示，当ddNTP按碱基互补配对的方式加到正在复制的DNA子链中后，因其3′端无—OH不能连接下一个核苷酸而使DNA子链的延伸立即终止，于是得到长短不一、以某种碱基为末端且被32P标记的DNA子链片段，电泳分离这些子链片段并进行放射自显影，得到图谱后就可以读取核苷酸的排列顺序。回答下列问题：
(1)PCR反应的基本步骤包括______________、延伸，其中需要的酶是____________________。除上述应用外，PCR技术在基因工程中的应用还有____________________(答出1点)。
(2)要利用双脱氧法测定单链DNA片段“5′—GCCTAAGATCGCA—3′”的核苷酸排列顺序，需设置四个反应体系。
①除单链模板、酶、dNTP外，每个反应体系还都需要加入____种引物、含Mg2＋的______等；四个反应体系的差别在于加入的____________不同；dNTP是DNA复制时的原料，在与模板链结合时，需水解__________个磷酸基团。
②要得到以碱基G为末端且被32P标记的DNA子链片段，反应体系中需加入的特有原料是________(填“α”“β”或“γ”)位被32P标记的ddGTP，所得到的被32P标记的DNA子链片段长度有__________种。
4．(每空1分，共12分)(2024·南通高三一模)蒂蛀虫是荔枝的主要害虫。科研人员培育转基因抗虫荔枝的过程如图1所示。图2是SalⅠ、HindⅢ和BamHⅠ三种限制酶的识别序列和切割位点。请回答下列问题：
(1)与RNA相比，质粒特有的化学成分是______________________；抗氨苄青霉素基因的作用是________________________________________________________________________。
(2)研究人员采用了如图3巢式PCR技术获取抗虫基因，巢式PCR是一种变异的聚合酶链式反应，使用两对PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物(也称外引物)扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物(因为他们在第一次PCR扩增片段的内部，也称内引物)结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。
①PCR扩增时加入引物的原因是__________________________________________________，在最后一个循环结束后通常还需要维持72 ℃ 5 min的目的是______________，PCR产物常采用______________________来鉴定。
②相比于常规PCR，巢式PCR获得错误目标产物的概率________(填“高”或“低”)，这是因为________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
③为了使抗虫基因定向插入质粒中，第二次PCR扩增时需要在两个引物的5′端分别添加的序列是__________________，不添加在引物3′端的原因是_____________________________
________________________________________________________________________。
(3)科研人员采用农杆菌转化法将抗虫基因导入荔枝细胞，由于农杆菌中的________________________，能携带目的基因进入受体细胞，并将目的基因整合到受体细胞______________上。
(4)培育出的荔枝是否具有抗虫性状，可采用的鉴定方法是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
5．(每空1分，共8分)(2024·聊城高三一模)易错PCR是利用低保真的Taq DNA聚合酶和改变PCR的反应条件，降低DNA复制的准确性，在新DNA链的合成过程中增加碱基错配，从而使扩增产物出现较多点突变的一种体外诱导DNA序列变异的方法。从自然界中的生物体内分离得到的天然酶，在工业生产环境中催化效率往往较低。图示是研究人员利用易错PCR技术对某种天然酶进行改造，获得高催化效率的酶的流程示意图。回答下列问题：
(1)在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是__________。PCR反应体系中需添加引物，引物的作用是________________________________________________________________________。
(2)图中步骤①为易错PCR过程，其扩增过程中需要加入Taq DNA聚合酶，这是因为Taq DNA聚合酶具有__________的特点。图中步骤②是将构建的重组质粒溶于缓冲液中与用________处理的受体菌混合，在一定温度下完成转化。转化是指________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)Taq DNA聚合酶的某一区域负责将碱基与模板链正确地互补配对，Mn2＋可以降低这一功能；非互补的碱基对由于氢键不易形成，稳定性差，Mg2＋可以提高该错配区的稳定性。因此，与普通PCR相比，易错PCR的反应体系中应适当________(填“提高”或“降低”)Mn2＋浓度、________(填“提高”或“降低”)Mg2＋浓度。
(4)阐述通过易错PCR技术改造天然酶与通过蛋白质工程改造天然酶原理的本质区别：________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案精析
真题演练
1．(1)解旋酶　温度超过90 ℃　氢键　(2)Taq DNA聚合酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
解析　(1)生物体细胞内DNA复制开始时是利用解旋酶进行解旋的，而在体外利用PCR技术扩增目的基因时，则是通过加热使温度超过90 ℃进行解旋的，二者都破坏了碱基对之间的氢键。(2)在PCR过程中，要加热至90 ℃以上，所以使用热稳定性高的Taq DNA聚合酶，而不使用在高温下会失活的大肠杆菌DNA聚合酶。
2．(1)④②③①　(2)Taq DNA聚合酶　延伸　引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合　(3)病原菌DNA　(4)一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术
解析　(1)PCR技术可用于临床的病原菌检测，若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是④采集病人组织样本→②从病人组织样本中提取DNA→③利用PCR扩增DNA片段→①分析PCR扩增结果。(3)DNA复制需要引物，为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与两条单链DNA特异性结合。
3．变性　氢键
解析　PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中DNA双链打开成为单链的阶段是变性，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是氢键。
4．在 PCR 反应中，需要利用高温使 DNA 双链解旋，普通的 DNA聚合酶在高温下会变性失活，而 Taq DNA 聚合酶能够耐高温，在高温条件下依然具有活性
5．(1)包含BamHⅠ的识别序列　将GTG改为ATG　(2)原核生物复制原点　不能　(3)缺失尿嘧啶
解析　(1)设计引物1的5′端序列，应考虑将编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，以便目的基因在酵母细胞中更好地表达；同时能通过双酶切以正确方向插入质粒，需要包含BamHⅠ的识别序列。(2)将重组质粒导入大肠杆菌，重组质粒上有原核生物复制原点，所以能在大肠杆菌中扩增。由于启动子存在物种特异性，重组质粒上带有真核酿酒酵母基因的启动子，故重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列在大肠杆菌中不能高效表达。(3)在缺乏尿嘧啶的选择培养基上，不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株不能生存，导入重组质粒的酿酒酵母菌株因为获得了尿嘧啶合成酶基因能合成尿嘧啶，可以正常生存，从而起到筛选作用。
6．(1)1　4　5′　(2)XhoⅠ　(3)卡那霉素　(4)B　(5)PCR
解析　(1)据图中引物箭头方向可知，要想复制KanR(卡那霉素抗性基因)，需要引物1和4，因此为去除筛选效率较低的SacB，应选择引物1和4。PCR时，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3′端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5′端向3′端延伸的，因此在引物的5′端引入XhoⅠ酶识别序列。(2)据图可知，载体4中RpsL(链霉素敏感基因)的两侧具有XhoⅠ酶识别序列，载体3中不含XhoⅠ酶识别序列，如果将载体2和载体3连接形成高效筛选载体4时，需要的引物应该含有XhoⅠ酶识别序列。(3)基因表达载体中的标记基因，有利于目的基因的初步检测，据题意可知，载体5中含有RpsL和KanR，将载体5导入链霉素不敏感(由RpsL突变造成)、卡那霉素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5的菌株，应采用含有卡那霉素的平板进行初步筛选。(4)据题意可知，载体5导入的是链霉素不敏感、卡那霉素敏感的受体菌，受体菌中P1基因脱离载体5并整合到受体菌拟核DNA，且载体5上其他DNA片段全部丢失，因此该菌的表型为卡那霉素敏感、链霉素不敏感，B正确。(5)通过PCR技术可以检测目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA中或目的基因是否转录出了mRNA，因此可采用PCR技术鉴定成功整合P1基因的菌株。
7．(1)雄原核较大，更容易容纳外源DNA　(2)引物　雄性　雌性
解析　(1)通常来自精子的雄原核较大，更容易容纳外源DNA，因此外源基因容易整合到精子的染色体上，这是提高转化率的关键。(2)目前，对胚胎性别进行鉴定的最有效最准确的方法是SRY－PCR法，操作的基本程序是从被测的囊胚中取出几个滋养层细胞，提取DNA，然后用位于Y染色体上的性别决定基因(即SRY基因)的一段碱基设计引物，在热稳定DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)催化作用下，以胚胎细胞中的DNA作为模板，进行PCR扩增，再用SRY特异性探针检测扩增产物，与SRY特异性探针出现阳性反应者，说明其含有Y染色体，胚胎为雄性；出现阴性反应者，说明其不含Y染色体，胚胎为雌性。
模拟预测
1．(1)催化病毒蛋白质水解，抑制RNA的降解　(2)逆转录　3′　(3)GCATT……TCGGT　　延伸　(4)ab(240－1)
解析　(3)根据碱基互补配对原则可确定探针序列是5′－GCATT……TCGGT－3′。根据图中探针的发光原理可推测探针的水解发生在PCR延伸阶段。(4)根据图中信息得知，以F为引物合成子链时会发出荧光，即引物F数＝探针数，荧光强度阈值为ab(2ct－1)，由于ct≤40为阳性，故阈值为ab(240－1)。
2．(1)引物A、引物C　引物C、引物D　子链的延伸方向只能从5′端→3′端，以DNA分子③作模板时子链不能延伸(2)5′　KpnⅠ、EcoRⅠ　(3)不一定　含有空白质粒的大肠杆菌也能在该培养基上生长
解析　(1)DNA合成的方向是从子链的5′端到3′端，根据PCR1的产物，可知PCR1的引物是引物A、引物C。根据PCR2的产物可知，PCR2的引物为引物B、引物D，将DNA分子②④混合后复性可得到③⑤，PCR3获得DNA⑥，DNA⑥分子的3′端与引物D互补配对，5′端与引物C互补配对，所以PCR4的引物为引物C、引物D。PCR3是为了获得重叠链，模板DNA不能选择DNA分子③的原因是子链的延伸方向只能从5′端→3′端，以DNA分子③作模板时子链不能延伸。(2)为使重叠延伸PCR技术改造后的目的基因能与载体正确连接，PCR4时，应在基因上、下游引物的5′端分别添加限制酶的识别序列，因为子链的延伸是从3′端开始的。目的基因应插在启动子和终止子之间，由于PstⅠ靠近终止子，所以应在基因上、下游引物的5′端分别添加限制酶KpnⅠ、EcoRⅠ的识别序列。(3)目的基因、质粒及大肠杆菌混合，可能有一些质粒与目的基因成功连接，可能也有些质粒没有与目的基因连接，这些质粒若成功导入大肠杆菌，由于质粒上有四环素抗性基因，所以都能在含四环素的平板上长出菌落，但这些菌落不一定含有目的基因。
3．(1)变性、复性　Taq DNA聚合酶　目的基因的获取与扩增、目的基因的检测　(2)①1　缓冲液　ddNTP的种类　2　②α　4
解析　(2)要利用双脱氧法测定该单链DNA片段的核苷酸排列顺序，需设置四个反应体系。因为是单链模板，所以每个反应体系需要加入1种引物；还需要加入含Mg2＋的缓冲液，四个反应体系的差别在于加入的ddNTP的种类不同。dNTP含3个磷酸基团，脱去2个磷酸基团后即为DNA复制的原料。据图可知，要得到以碱基G为末端且被32P标记的DNA子链片段，反应体系中需加入的特有原料是α位被32P标记的ddGTP；ddGTP与模板链上的碱基C配对，而在模板链上碱基C的位置有四处，因此所得到的被32P标记的DNA子链片段长度有4种。
4．(1)脱氧核糖和胸腺嘧啶　便于筛选含重组DNA分子的受体细胞　(2)①Taq DNA聚合酶只能催化单个脱氧核苷酸连接到已有的核苷酸链3′端上　充分延伸子链　琼脂糖凝胶电泳　②低　如果利用外引物扩增产生了错误片段，则巢式(内)引物能在错误片段上进行配对的概率低③AAGCTT和GTCGAC　子链的延伸方向为5′端→3′端，使引物的3′端与模板链严格互补配对，保证子链的延伸　(3)Ti质粒含有一段T－DNA　染色体DNA　(4)采摘转基因抗虫荔枝叶片饲喂蒂蛀虫，观察蒂蛀虫的存活情况
解析　(1)质粒的本质为小型环状的DNA片段，与RNA相比，质粒特有的化学成分是脱氧核糖和胸腺嘧啶。抗氨苄青霉素基因可作为标记基因，标记基因的作用是便于筛选含重组DNA分子的受体细胞。(2)①由于Taq DNA聚合酶只能催化单个脱氧核苷酸连接到已有的核苷酸链3′端上，故PCR扩增时加入引物。延伸过程的温度一般为72 ℃，最后一个循环结束后通常还需要维持72 ℃ 5 min的目的是充分延伸子链。琼脂糖凝胶电泳能将不同分子量的DNA分开，PCR产物常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。②如果利用外引物扩增产生了错误片段，则巢式(内)引物能在错误片段上进行配对的概率低，故巢式PCR获得错误目标产物的概率低。③由图1可知，限制酶BamHⅠ会破坏目的基因，故用SalⅠ、HindⅢ两种限制酶切割目的基因的两端及质粒，可防止目的基因和质粒的自身环化或反向连接，所以第二次PCR扩增时需要在两个引物的5′端分别添加的序列是AAGCTT和GTCGAC。子链延伸的方向为5′端→3′端，为了使引物的3′端与模板链严格互补配对，保证子链的延伸，故限制酶识别序列不添加在引物3′端。(3)农杆菌含有Ti质粒，Ti质粒含有一段T－DNA，T－DNA能携带目的基因进入受体细胞，并将目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上。(4)培育出的荔枝是否具有抗虫性状，可从个体水平做抗性实验鉴定，鉴定方法是采摘转基因抗虫荔枝叶片饲喂蒂蛀虫，观察蒂蛀虫的存活情况。
5．(1)温度超过90 ℃　使Taq DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸　(2)耐高温　Ca2＋　目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程　(3)提高　提高　(4)易错PCR技术是利用基因突变的原理来改造天然酶，是不定向的；而蛋白质工程是利用基因重组的原理来改造天然酶，是定向的
解析　(1)在体外利用PCR技术扩增目的基因时，利用DNA高温变性的特点加热至温度超过90 ℃，破坏双链之间的氢键，使DNA解链为单链。用PCR技术扩增目的基因时，需要在PCR扩增仪中加入2种引物，其作用是使Taq DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。(2)PCR技术需要高温加热使DNA双链解旋，而Taq DNA聚合酶热稳定性高，在高温条件下不会失活，因此在降温时仍可发挥作用。步骤②是将重组质粒导入不同受体菌，由于受体菌用Ca2＋处理后更容易吸收周围环境中的DNA，因此步骤②是将构建的重组质粒溶于缓冲液中与用Ca2＋处理的受体菌混合，在一定温度下完成转化。转化是指目的基因进入受体细胞，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。(3)PCR技术通过DNA的双链复制，在Taq DNA聚合酶的催化下，遵循碱基互补配对原则，扩增DNA片段。Taq DNA聚合酶与一般的DNA聚合酶相比最大的特点是高温下保持酶的活性(或耐高温或热稳定)，其某一区域负责将碱基与模板链正确地互补配对，Mn2＋可以降低这一功能，提高碱基的错配，而Mg2＋可以提高稳定性，故易错PCR时应适当提高Mn2＋和Mg2＋浓度。(共49张PPT)
专题八　
第4练
PCR的综合应用
1.(2019·全国Ⅰ，38节选)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题：
(1)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是______________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的______。
真题演练
PART ONE
解旋酶
温度超过90 ℃
氢键
生物体细胞内DNA复制开始时是利用解旋酶进行解旋的，而在体外利用PCR技术扩增目的基因时，则是通过加热使温度超过90 ℃进行解旋的，二者都破坏了碱基对之间的氢键。
(2)目前在PCR反应中使用Taq DNA聚合酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是___________________________________________________
______________。
Taq DNA聚合酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
在PCR过程中，要加热至90 ℃以上，所以使用热稳定性高的Taq DNA聚合酶，而不使用在高温下会失活的大肠杆菌DNA聚合酶。
2.(2021·全国甲，38)PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题：
(1)若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是__________(用数字序号表示)。
④②③①
PCR技术可用于临床的病原菌检测，若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是④采集病人组织样本→②从病人组织样本中提取DNA→③利用PCR扩增DNA片段→①分析PCR扩增结果。
(2)操作③中使用的酶是________________，PCR 反应中的每次循环可分为变性、复性、______三步，其中复性的结果是__________________
________________________。
(3)为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与____________特异性结合。
Taq DNA聚合酶
延伸
引物通过碱基互补
配对与两条单链DNA结合
病原菌DNA
DNA复制需要引物，为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与两条单链DNA特异性结合。
3.(2024·全国甲，39节选)某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。该同学利用PCR扩增目的基因。PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中DNA双链打开成为单链的阶段是______，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是______。
变性
氢键
PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中DNA双链打开成为单链的阶段是变性，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是氢键。
4.(2024·安徽，20节选)丁二醇广泛应用于化妆品和食品等领域。兴趣小组在已改造的大肠杆菌中引入合成丁二醇的关键基因X，以提高丁二醇的产量。扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶，原因是_________________________________________________________________________________________________________________________________________。
在PCR反应中，需要利用高温使DNA双链解旋，普通的DNA聚合酶在高温下会变性失活，而Taq DNA聚合酶能够耐高温，在高温条件下依然具有活性
5.(2021·天津，16节选)乳酸菌是乳酸的传统生产菌，但耐酸能力较差，影响产量。酿酒酵母耐酸能力较强，但不产生乳酸。研究者将乳酸菌的乳酸脱氢酶基因(LDH)导入酿酒酵母，获得能产生乳酸的工程菌株。如图1为乳酸和乙醇发酵途径示意图，图2为构建表达载体时所需的关键条件。
获得转基因酿酒酵母菌株的过程如下：
(1)设计引物扩增乳酸脱氢酶编码序列。
为使扩增出的序列中编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，且能通过双酶切以正确方向插入质粒，需设计引物1和2。其中引物1的5′端序列应考虑_______________________和_______________。
包含BamHⅠ的识别序列
将GTG改为ATG
设计引物1的5′端序列，应考虑将编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，以便目的基因在酵母细胞中更好地表达；同时能通过双酶切以正确方向插入质粒，需要包含BamHⅠ的识别序列。
(2)将上述PCR产物和质粒重组后，导入大肠杆菌，筛选、鉴定，扩增重组质粒。重组质粒上有______
_____________，所以能在大肠杆菌中扩增。启动子存在物种特异性，易被本物种的转录系统识别并启动转录，因此重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列_____(填“能”或“不能”)在大肠杆菌中高效表达。
生物复制原点
不能
在缺乏尿嘧啶的选择培养基上，不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株不能生存，导入重组质粒的酿酒酵母菌株因为获得了尿嘧啶合成酶基因能合成尿嘧啶，可以正常生存，从而起到筛选作用。
原核
6.(2022·天津，15)研究者拟构建高效筛选系统，将改进的苯丙氨酸合成关键酶基因P1导入谷氨酸棒状杆菌，以提高苯丙氨酸产量。
(1)如图是该高效筛选系统载体的构建过程。载体1中含有KanR(卡那霉素抗性基因)和SacB两个标记基因，为去除筛选效率较低的SacB，应选择引物___和____，并在引物的_____(填“5′”或“3′”)端引入XhoⅠ
4
5′
酶识别序列，进行PCR扩增，产物经酶切、连接后环化成载体2。
1
据图中引物箭头方向可知，要想复制KanR(卡那霉素抗性基因)，需要引物1和4，因此为去除筛选效率较低的SacB，应选择引物1和4。PCR时，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3′端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5′端向3′端延伸的，因此在引物的5′端引入XhoⅠ酶识别序列。
(2)PCR扩增载体3中筛选效率较高的标记基因RpsL
(链霉素敏感基因)时，引物应包含________(填“EcoRⅠ”“HindⅢ”或“XhoⅠ”)酶识别序列，产物经单酶切后连接到载体2构建高效筛选载体4。
XhoⅠ
据图可知，载体4中RpsL(链霉素敏感基因)的两侧具有XhoⅠ酶识别序列，载体3中不含XhoⅠ酶识别序列，如果将载体2和载体3连接形成高效筛选载体4时，需要的引物应该含有XhoⅠ酶识别序列。
(3)将改进的P1基因整合到载体4构建载体5。将载体5导入链霉素不敏感(由RpsL突变造成)、卡那霉素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5的菌株，应采用含有__________的平板进行初步筛选。
卡那霉素
基因表达载体中的标记基因，有利于目的基因的初步检测，据题意可知，载体5中含有RpsL和KanR，将载体5导入链霉素不敏感(由RpsL突变造成)、卡那霉素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5的菌株，应采用含有卡那霉素的平板进行初步筛选。
(4)用一定的方法筛选出如下菌株：P1基因脱离载体5并整合到受体菌拟核DNA，且载体5上其他DNA片段全部丢失。该菌的表型为____。
A.卡那霉素不敏感、链霉素敏感
B.卡那霉素敏感、链霉素不敏感
C.卡那霉素和链霉素都敏感
D.卡那霉素和链霉素都不敏感
B
据题意可知，载体5导入的是链霉素不敏感、卡那霉素敏感的受体菌，受体菌中P1基因脱离载体5并整合到受体菌拟核DNA，且载体5上其他DNA片段全部丢失，因此该菌的表型为卡那霉素敏感、链霉素不敏感，B正确。
(5)可采用______技术鉴定成功整合P1基因的菌株。之后以发酵法检测苯丙氨酸产量。
PCR
通过PCR技术可以检测目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA中或目的基因是否转录出了mRNA，因此可采用PCR技术鉴定成功整合P1基因的菌株。
7.(2020·海南，25节选)某课题组用生物技术制备转基因小鼠的过程，如图所示。回答下列问题：
(1)通常把目的基因转入雄原核而不
是雌原核，从两者形态差异上分析，
原因是________________________
__________。
雄原核较大，更容易容纳
外源DNA
通常来自精子的雄原核较大，更容易容纳外源DNA，因此外源基因容易整合到精子的染色体上，这是提高转化率的关键。
(2)把桑葚胚植入假孕母鼠子宫前，需要对胚胎进行性别鉴定，目前最有效的方法是SRY－PCR法。操作的基本程序是先从被测胚胎中取出几个细胞，提取DNA，然后用位于Y染色体的性别决定基因，即SRY基因的一段碱基设计______，以胚胎细胞中的DNA作为模板，进行PCR扩增，最后用SRY特异性探针检测扩增产物。出现阳性反应者，胚胎为_____；出现阴性反应者，胚胎为______。
引物
雄性
雌性
目前，对胚胎性别进行鉴定的最有效最准确的方法是SRY－PCR法，操作的基本程序是从被测的
囊胚中取出几个滋养层细胞，提取DNA，然后用位于Y染色体上的性别决定基因(即SRY基因)的一段碱基设计引物，在热稳定DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)催化作用下，以胚胎细胞中的DNA作为模板，进行PCR扩增，再用SRY特异性探针检测扩增产物，与SRY特异性探针出现阳性反应者，说明其含有Y染色体，胚胎为雄性；出现阴性反应者，说明其不含Y染色体，胚胎为雌性。
1.(2024·池州高三二模)据相关流感监测报告显示，目前流感以甲流为主，甲流病毒核酸检测方便快捷，可以为临床诊断提供可靠依据。病毒核酸检测的方法为实时荧光定量PCR(qPCR)检测法，在PCR扩增时加入能与目的基因(甲流病毒的N基因)结合的荧光探针，技术流程及相关步骤如图所示。回答下列问题：
模拟预测
PART TWO
(1)图中步骤1提取RNA过程中加入蛋白酶K和RNA酶抑制剂的作用是________
______________________________。
催化病毒蛋白质水解，抑制RNA的降解
(3)在配制PCR扩增缓冲液时，加入的荧光探针序列为5′－ACCGA……AATGC－3′，如果模板中存在N基因序列，与探针结合的序列应该是5′－__________
_____________－3′。在扩增过程中，若探针完整时，不产生荧光，当探针被酶X(Taq DNA聚合酶)水解时，R与Q分离，即可检测出R发出荧光。由此可推测，探针的水解发生在PCR______阶段。
(2)qPCR过程中，需先以RNA为模板，经过________过程合成cDNA，设计一对引物。为确保甲流病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据甲流病毒cDNA两条链中的____(填“3′”或“5′”)端来进行。
逆转录
3′
GCATT
……TCGGT
延伸
根据碱基互补配对原则可确定探针序列是5′－GCATT……TCGGT－3′。根据图中探针的发光原理可推测探针的水解发生在PCR延伸阶段。
(4)在qPCR中ct值含义是“每个反应管内荧光强度达到设定阈值时所经历的循环数”，根据某试剂盒说明书显示ct≤40则为阳性，若每分子探针水解释放的荧光强度为a，加入模板RNA数为b，则设定的荧光强度阈值应为__________。
ab(240－1)
根据图中信息得知，以F为引物合成子链时会发出荧光，即引物F数＝探针数，荧光强度阈值为ab(2ct－1)，由于ct≤40为阳性，故阈值为ab(240－1)。
2.(2024·淄博高三一模)重叠延伸PCR技术是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术，可通过定点诱变在体外改造DNA分子，并将改造后的目的基因导入质粒构建目的基因表达载体。
(1)图示的重叠延伸PCR技术中，PCR1的引物是______________。PCR4可获得大量定点诱变目的基因，此时的引物为______________。PCR3时模板DNA不能选择DNA分子③的原因是_____
__________________________________________________________________。
引物A、引物C
引物C、引物D
子链的延伸方向只能从5′端→3′端，以DNA分子③作模板时子链不能延伸
DNA合成的方向是从子链的5′端到3′端，根据PCR1的产物，可知PCR1的引物是引物A、引物C。根据PCR2的产物可知，PCR2的引物为引物B、引物D，将DNA分子②④混合后复性可得到③⑤，PCR3获得DNA⑥，DNA⑥分子的3′端与引物D互补配对，5′端与引物C互补配对，所以PCR4的引物为引物C、引物D。PCR3是为了获得重叠链，模板DNA不能选择DNA分子③的原因是子链的延伸方向只能从5′端→3′端，以DNA分子③作模板时子链不能延伸。
(2)为使重叠延伸PCR技术改造后的目的基因(该基因序列不含图中限制酶的识别序列)能与载体正确连接，PCR4时，应在基因上、下游引物的____端分别添加限制酶________________的识别序列。
5′
KpnⅠ、EcoRⅠ
为使重叠延伸PCR技术改造后的目的基因能与载体正确连接，PCR4时，应在基因上、下游引物的5′端分别添加限制酶的识别序列，因为子链的延伸是从3′端开始的。目的基因应插在启动子和终止子之间，由于PstⅠ靠近终止子，所以应在基因上、下游引物的5′端分别添加限制酶KpnⅠ、EcoRⅠ的识别序列。
(3)将目的基因、质粒及大肠杆菌混合，温育一段时间后涂在含四环素的平板上培养，一段时间后平板上长出菌落。这些菌落的菌体内________(填“一定”或“不一定”)含有目的基因，理由是________________
_____________________________。
不一定
含有空白质粒的大肠杆菌也能在该培养基上生长
目的基因、质粒及大肠杆菌混合，可能有一些质粒与目的基因成功连接，可能也有些质粒没有与目的基因连接，这些质粒若成功导入大肠杆菌，由于质粒上有四环素抗性基因，所以都能在含四环素的平板上长出菌落，但这些菌落不一定含有目的基因。
3.(2024·白银高三模拟)DNA测序技术是一项基础性的生命科学技术，它的出现和发展推动了生命科学的快速发展。桑格－库森法以DNA合成反应为基础，利用双脱氧法测序，需要用到32P标记
的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)与脱氧核苷三磷酸(dNTP)。ddNTP与dNTP的结构如图所示，当ddNTP按碱基互补配对的方式加到正在复制的DNA子链中后，因其3′端无—OH不能连接下一个核苷酸而使DNA子链的延伸立即终止，于是得到长短不一、以某种碱基为末端且被32P标记的DNA子链片段，电泳分离这些子链片段并进行放射自显影，得到图谱后就可以读取核苷酸的排列顺序。回答下列问题：
(1)PCR反应的基本步骤包括____________、延伸，其中需要的酶是_____
_____________。除上述应用外，PCR技术在基因工程中的应用还有_____
__________________________________(答出1点)。
变性、复性
Taq
基因的获取与扩增、目的基因的检测
DNA聚合酶
目的
(2)要利用双脱氧法测定单链DNA片段“5′—GCCTAAGATCGCA—3′”的核苷酸排列顺序，需设置四个反应体系。
①除单链模板、酶、dNTP外，每个
反应体系还都需要加入____种引物、含Mg2＋的________等；四个反应体系的差别在于加入的______________不同；dNTP是DNA复制时的原料，在与模板链结合时，需水解___个磷酸基团。
②要得到以碱基G为末端且被32P标记的DNA子链片段，反应体系中需加入的特有原料是___(填“α”“β”或“γ”)位被32P标记的ddGTP，所得到的被32P标记的DNA子链片段长度有___种。
1
缓冲液
ddNTP的种类
2
α
4
应体系的差别在于加入的ddNTP的种类不同。dNTP含3个磷酸基团，脱去2个磷酸基团后即为DNA复制的原料。据图可知，要得到以碱基G为末端且被32P标记的DNA子链片段，反应体系中需加入的特有原料是α位被32P标记的ddGTP；ddGTP与模板链上的碱基C配对，而在模板链上碱基C的位置有四处，因此所得到的被32P标记的DNA子链片段长度有4种。
要利用双脱氧法测定该单链DNA片段的核苷酸排列顺序，需设置四个反应体系。因为是单链模板，所以每个反应体系需要加入1种引物；还需要加入含Mg2＋的缓冲液，四个反
(1)与RNA相比，质粒特有的化学成分是_______________
_____；抗氨苄青霉素基因的作用是________________________________。
4.(2024·南通高三一模)蒂蛀虫是荔枝的主要害虫。科研人员培育转基因抗虫荔枝的过程如图1所示。图2是SalⅠ、HindⅢ和BamHⅠ三种限制酶的识别序列和切割位点。请回答下列问题：
脱氧核糖和胸腺
嘧啶
便于筛选含重组DNA分子的受体细胞
质粒的本质为小型环状的DNA片段，与RNA相比，质粒特有的化学成分是脱氧核糖和胸腺嘧啶。抗氨苄青霉素基因可作为标记基因，标记基因的作用是便于筛选含重组DNA分子的受体细胞。
(2)研究人员采用了如图3巢式PCR技术获取抗虫基因，巢式PCR是一种变异的聚合酶链式反应，使用两对PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物(也称外引物)扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物(因为他们在第一次PCR扩增片段的内部，也称内引物)结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。
①PCR扩增时加入引物的原因是_______________
___________________________________________________，在最后一个循环结束后通常还需要维持72 ℃ 5 min的目的是______________，PCR产物常采用________________来鉴定。
Taq DNA聚合酶只能催化单个脱氧核苷酸连接到已有的核苷酸链3′端上
充分延伸子链
琼脂糖凝胶电泳
链。琼脂糖凝胶电泳能将不同分子量的DNA分开，PCR产物常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
由于Taq DNA聚合酶只能催化单个脱氧核苷酸连接到已有的核苷酸链3′端上，故PCR扩增时加入引物。延伸过程的温度一般为72 ℃，最后一个循环结束后通常还需要维持72 ℃ 5 min的目的是充分延伸子
②相比于常规PCR，巢式PCR获得错误目标产物的概率____(填“高”或“低”)，这是因为_____________________________
______________________________________________________。
低
如果利用外引物扩增产生了错误片段，则巢式(内)引物能在错误片段上进行配对的概率低
如果利用外引物扩增产生了错误片段，则巢式(内)引物能在错误片段上进行配对的概率低，故巢式PCR获得错误目标产物的概率低。
③为了使抗虫基因定向插入质粒中，第二次PCR扩增时需要在两个引物的5′端分别添加的序列是____________________，不添加在引物3′端的原因是______________
_____________________________________
__________________________________。
AAGCTT和GTCGAC
子链的延伸方
向为5′端→3′端，使引物的3′端与模
板链严格互补配对，保证子链的延伸
时需要在两个引物的5′端分别添加的序列是AAGCTT和GTCGAC。子链延伸的方向为5′端→3′端，为了使引物的3′端与模板链严格互补配对，保证子链的延伸，故限制酶识别序列不添加在引物3′端。
由图1可知，限制酶BamHⅠ会破坏目的基因，故用SalⅠ、HindⅢ两种限制酶切割目的基因的两端及质粒，可防止目的基因和质粒的自身环化或反向连接，所以第二次PCR扩增
(3)科研人员采用农杆菌转化法将抗虫基因导入荔枝细胞，由于农杆菌中的________
_________________，能携带目的基因进入受体细胞，并将目的基因整合到受体细胞_____________上。
Ti质粒含有一段T－DNA
染色体DNA
农杆菌含有Ti质粒，Ti质粒含有一段T－DNA，T－DNA能携带目的基因进入受体细胞，并将目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上。
(4)培育出的荔枝是否具有抗虫性状，可采用的鉴定方法是______________________
____________________________________。
采摘转基因抗虫荔枝叶片饲喂蒂蛀虫，观察蒂蛀虫的存活情况
培育出的荔枝是否具有抗虫性状，可从个体水平做抗性实验鉴定，鉴定方法是采摘转基因抗虫荔枝叶片饲喂蒂蛀虫，观察蒂蛀虫的存活情况。
5.(2024·聊城高三一模)易错PCR是利用低保真的Taq DNA聚合酶和改变PCR的反应条件，降低DNA复制的准确性，在新DNA链的合成过程中增加碱基错配，从而使扩增产物出现较多点突变的一种体外诱导DNA序列变异的方法。从自然界中的生物体内分离
得到的天然酶，在工业生产环境中催化效率往往较低。图示是研究人员利用易错PCR技术对某种天然酶进行改造，获得高催化效率的酶的流程示意图。回答下列问题：
(1)在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是______________。PCR反应体系中需添加引物，引物的作用是_______________
___________________________________________。
温度超过90 ℃
使Taq DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
在体外利用PCR技术扩增目的基因时，利用DNA高温变性的特点加热至温度超过90 ℃，破坏双链之间的氢键，使DNA解链为单链。用PCR技术扩增目的基因时，需要在PCR扩增仪中加入2种引物，其作用是使Taq DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。
(2)图中步骤①为易错PCR过程，其扩增过程中需要加入Taq DNA聚合酶，这是因为Taq DNA聚合酶具有________的特点。图中步骤②是将构建的重组质粒溶于缓冲液中与用______处理的受体菌混合，在一定温度下完成转化。转化是指_____
_________________________________________________________。
耐高温
Ca2＋
基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程
目的
PCR技术需要高温加热使DNA双链解旋，而Taq DNA聚合酶热稳定性高，在高温条件下不会失活，因此在降温时仍可发挥作用。步骤②是将重组质粒导入不同受体菌，由于受体菌用Ca2＋处理后更容易吸收周围环境中的DNA，因
此步骤②是将构建的重组质粒溶于缓冲液中与用Ca2＋处理的受体菌混合，在一定温度下完成转化。转化是指目的基因进入受体细胞，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
(3)Taq DNA聚合酶的某一区域负责将碱基与模板链正确地互补配对，Mn2＋可以降低这一功能；非互补的碱基对由于氢键不易形成，稳定性差，Mg2＋可以提高该错配区的稳定性。因此，与普通PCR相比，易错PCR的反应体系中应适
当______(填“提高”或“降低”)Mn2＋浓度、______(填“提高”或“降低”)Mg2＋浓度。
提高
提高
PCR技术通过DNA的双链复制，在Taq DNA聚合酶的催化下，遵循碱基互补配对原则，扩增DNA片段。Taq DNA聚合酶与一般的DNA聚合酶相比最大的特点是高温下保持酶的活性(或耐高温或热稳定)，其某一区域负责将碱基
与模板链正确地互补配对，Mn2＋可以降低这一功能，提高碱基的错配，而Mg2＋可以提高稳定性，故易错PCR时应适当提高Mn2＋和Mg2＋浓度。
(4)阐述通过易错PCR技术改造天然酶与通过蛋白质工程改造天然酶原理的本质区别：_____________________________
_______________________________________________________________________________________。
易错PCR技术是利用基因突变的
原理来改造天然酶，是不定向的；而蛋
白质工程是利用基因重组的原理来改造
天然酶，是定向的第5练　基因工程与遗传定律 (重点突破)
1．(每空4分，共8分)(2024·河北，22节选)新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合子植株的占比为____________。选择纯合子进行后续研究的原因是_________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
2．(12分)(2021·北京，20)玉米是我国重要的农作物，研究种子发育的机理对培育高产优质的玉米新品种具有重要作用。
(1)(4分)玉米果穗上的每一个籽粒都是受精后发育而来。我国科学家发现了甲品系玉米，其自交后的果穗上出现严重干瘪且无发芽能力的籽粒，这种异常籽粒约占1/4。籽粒正常和干瘪这一对相对性状的遗传遵循孟德尔的______________定律。上述果穗上的正常籽粒均发育为植株，自交后，有些植株果穗上有约1/4干瘪籽粒，这些植株所占比例约为______________。
(2)(2分)为阐明籽粒干瘪性状的遗传基础，研究者克隆出候选基因A/a。将A基因导入到甲品系中，获得了转入单个A基因的转基因玉米。假定转入的A基因已插入a基因所在染色体的非同源染色体上，请从下表中选择一种实验方案及对应的预期结果以证实“A基因突变是导致籽粒干瘪的原因”。________。
实验方案 预期结果
Ⅰ.转基因玉米×野生型玉米 Ⅱ.转基因玉米×甲品系 Ⅲ.转基因玉米自交 Ⅳ.野生型玉米×甲品系 ①正常籽粒∶干瘪籽粒≈1∶1 ②正常籽粒∶干瘪籽粒≈3∶1 ③正常籽粒∶干瘪籽粒≈7∶1 ④正常籽粒∶干瘪籽粒≈15∶1
(3)(2分)现已确认A基因突变是导致籽粒干瘪的原因，序列分析发现a基因是A基因中插入了一段DNA(见图1)，使A基因功能丧失。甲品系果穗上的正常籽粒发芽后，取其植株叶片，用图1中的引物1、2进行PCR扩增，若出现目标扩增条带则可知相应植株的基因型为________________________________________________________________________。
(4)(4分)为确定A基因在玉米染色体上的位置，借助位置已知的M/m基因进行分析。用基因型为mm且籽粒正常的纯合子P与基因型为MM的甲品系杂交得F1，F1自交得F2。用M、m基因的特异性引物，对F1植株果穗上干瘪籽粒(F2)胚组织的DNA进行PCR扩增，扩增结果有1、2、3三种类型，如图2所示。
统计干瘪籽粒(F2)的数量，发现类型1最多、类型2较少、类型3极少。请解释类型3数量极少的原因。_________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
3．(每空1分，共9分)(2022·福建，12)7S球蛋白是大豆最主要的过敏原蛋白，三种大豆脂氧酶Lox-1,2,3是大豆产生腥臭味的原因。大豆食品深加工过程中需要去除7S球蛋白和三种脂氧酶。科研人员为获得7S球蛋白与三种脂氧酶同时缺失的大豆新品种，将7S球蛋白缺失的大豆植株与脂氧酶完全缺失的植株杂交，获得F1种子。F1植株自交得到F2种子。对F1种子和F2种子的7S球蛋白和脂氧酶进行蛋白质电泳检测，不同表型的电泳条带示意如图。
注：图中黑色条带为抗原－抗体杂交带，表示相应蛋白质的存在。M泳道条带为相应标准蛋白所在位置，F1种子泳道的条带待填写。
根据电泳检测的结果，对F2种子表型进行分类统计如表。
F2种子表型 粒数
7S球蛋白 野生型 124
7S球蛋白缺失型 377
脂氧酶 Lox-1,2,3 野生型 282
① 94
② 94
Lox-1,2,3全缺失型 31
回答下列问题：
(1)7S球蛋白缺失型属于________(填“显性”或“隐性”)性状。
(2)表中①②的表型分别是________________、________________。脂氧酶 Lox-1,2,3分别由三对等位基因控制，在脂氧酶是否缺失的性状上，F2种子表型只有四种，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)在图中画出F1种子表型的电泳条带。
(4)已知Lox基因和7S球蛋白基因独立遗传。图中第________泳道的种子表型为7S球蛋白与三种脂氧酶同时缺失型，这些种子在F2中的比例是________。利用这些种子选择并获得稳定遗传种子的方法是______________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(5)为提高大豆品质，利用基因工程方法提出一个消除野生型大豆7S球蛋白过敏原的设想。
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
4．(每空1分，共8分)(2021·山东，22)番茄是雌雄同花植物，可自花传粉也可异花受粉。M、m基因位于2号染色体上，基因型为mm的植株只产生可育雌配子，表现为小花、雄性不育。基因型为MM、Mm的植株表现为大花、可育。R、r基因位于5号染色体上，基因型为RR、Rr、rr的植株表现型分别为：正常成熟红果、晚熟红果、晚熟黄果。细菌中的H基因控制某种酶的合成，导入H基因的转基因番茄植株中，H基因只在雄配子中表达，喷施萘乙酰胺(NAM)后含H基因的雄配子死亡。不考虑基因突变和染色体互换。请回答下列问题：
(1)基因型为Mm的植株连续自交两代，F2中雄性不育植株所占的比例为______。雄性不育植株与野生型植株杂交所得可育晚熟红果杂交种的基因型为______，以该杂交种为亲本连续种植，若每代均随机受粉，则F2中可育晚熟红果植株所占比例为__________。
(2)已知H基因在每条染色体上最多插入1个且不影响其他基因。将H基因导入基因型为Mm的细胞并获得转基因植株甲和乙，植株甲和乙分别与雄性不育植株杂交，在形成配子时喷施NAM，F1均表现为雄性不育。若植株甲和乙的体细胞中含1个或多个H基因，则以上所得F1的体细胞中含有____个H基因。若植株甲的体细胞中仅含1个H基因，则H基因插入了________所在的染色体上。若植株乙的体细胞中含n个H基因，则H基因在染色体上的分布必须满足的条件是____________________________________，植株乙与雄性不育植株杂交，若不喷施NAM，则子一代中不含H基因的雄性不育植株所占比例为____。
(3)若植株甲的体细胞中仅含一个H基因，在不喷施NAM的情况下，利用植株甲及非转基因植株通过一次杂交即可选育出与植株甲基因型相同的植株。请写出选育方案：________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
5．(每空4分，共8分)(2023·北京，19节选)二十大报告提出“种业振兴行动”。油菜是重要的油料作物，筛选具有优良性状的育种材料并探究相应遗传机制，对创制高产优质新品种意义重大。请回答下列问题：
科学家克隆出导致新生叶黄化的基因，与野生型相比，它在DNA序列上有一个碱基对改变，导致突变基因上出现了一个限制酶B的酶切位点(如图)。据此，检测F2基因型的实验步骤为：提取基因组DNA→PCR→回收扩增产物→________________→电泳。F2中杂合子电泳条带数目应为________条。
1．(每空2分，共10分)(2024·天津高三模拟)水稻是世界上最重要的粮食作物。为提高水稻产量，科研人员通过突变育种的方式筛选出了单基因纯合突变体1～4四种品种。通过测序发现，突变体1为Os基因功能缺失突变体，该基因位于12号染色体上。请回答下列问题：
(1)科研人员观察发现突变体1和突变体2水稻穗子显著大于野生型。分别将其与野生型水稻杂交，获得的F1的穗子________(填“大于”“等于”或“小于”)野生型，说明大穗为隐性性状。将突变体1与突变体2杂交，若____________，没有出现新的表型，说明两种突变体突变基因为同一位点的基因。
(2)研究表明，位于水稻6号染色体上的APO1基因与水稻穗子大小有关，突变体3为APO1基因功能缺失型隐性纯合突变体、穗子显著小于野生型；突变体4为APO1基因功能增强型显性纯合突变体，穗子显著大于野生型。研究人员将等量的APO1基因分别导入野生型和突变体1的植株中，测定细胞中APO1 mRNA的含量和APO1蛋白含量，结果如图。上述实验结果说明Os基因对APO1基因的________过程无影响，可能是通过促进________________，降低细胞中APO1含量。
注：Actin即“肌动蛋白”，在不同种类细胞中的表达量相对稳定，在该实验中作为参照指标。
(3)为了进一步确定Os基因与APO1基因是否相互作用，共同调控水稻穗子的大小，研究人员将突变体1和突变体3杂交后代F1自交，若子代性状及比例为野生型∶大穗∶小穗＝________，说明(2)中结论成立，Os基因与APO1基因共同影响穗子的大小。
2．(9分)某植物抗旱与否由基因A(a)、B(b)控制，只有A、B同时存在时才表现为抗旱。不抗旱的两纯合植株杂交，F1均表现为抗旱，取F1某一植株进行两组测交实验，正交、反交后代抗旱植株分别占1/7、1/4。据此推测这种植物雌配子或雄配子存在某种基因型的部分致死现象(不考虑染色体互换、基因突变和染色体变异)。请回答下列问题：
(1)(3分)F1的基因型为________。A(a)、B(b)的遗传遵循自由组合定律，判定依据是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)(3分)F1植株的_______基因型的雌或雄配子存在致死现象，致死率为________。若致死现象出现在雄配子中，可以用________进行验证，该育种方法的优点是可以明显缩短育种年限。
(3)(3分)若通过基因工程将耐寒基因D导入F1植株中，将转基因植株自交，若后代抗旱耐寒∶不抗旱耐寒∶抗旱不耐寒∶不抗旱不耐寒＝3∶3∶1∶1，则抗旱基因和抗寒基因在染色体上的位置关系为____________________。
若后代抗旱耐寒∶不抗旱耐寒∶抗旱不耐寒∶不抗旱不耐寒＝7∶3∶0∶4，则D基因与________基因位于同一条染色体上。
若后代抗旱耐寒∶不抗旱耐寒∶抗旱不耐寒∶不抗旱不耐寒＝5∶6∶2∶1，则D基因与________基因位于同一条染色体上。
3．(每空1分，共7分)“杂交水稻之父”袁隆平利用雄性不育野生稻改写了世界水稻育种史，杂交水稻研究团队不断刷新我国水稻产量和品质，举世瞩目。请分析回答下列问题：
(1)水稻(2n＝24)是禾本科植物，在我国有野生种、引进种、杂交种等水稻品种用于农业生产和科学研究，这主要体现了生物多样性的______价值。在育种研究中，对水稻进行基因组测序要测____________条染色体中DNA的碱基序列。
(2)安农S－1是我国发现的第一个籼稻(水稻的一个品种)光温敏雄性不育系。该光温敏雄性不育系与9种常规雄性可育系进行正反交，得到的F1均为雄性可育。据此可推出有关该雄性不育基因的两个结论是：_____________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)另有一个水稻品系，其雄性的育性由一对等位基因M、m控制，基因型为mm的个体表现为雄性不育，能产生正常的雌配子，M基因可使雄性不育个体恢复育性产生可育雄配子。通过转基因技术将M基因与雄配子致死基因A、蓝色素生成基因D一起导入基因型为mm的个体中，并使其插入一条不含m基因的染色体上(D基因的表达产物可使种子呈现蓝色，无D基因的种子呈现白色)。如图：
①图中基因型为mmADM的个体自交时(不考虑突变和互换)，子代种子的表型及比例为______________________，这种转基因改良品系的显著优点是__________________________。
②要成功得到转基因个体(mmADM)，先要构建基因表达载体。研究人员准备在已插入M基因的载体(如图)中再插入A、D融合基因。他们分析发现A、D融合基因拼接处存在XbaⅠ的识别序列，为使基因表达载体中A、D融合基因和M基因都正确表达，应在A、D融合基因两端添加__________两种限制酶的识别序列，并用____________两种限制酶对载体进行酶切。
4．(每空1分，共9分)(2024·天津高三一模)为构建肝特异性CD36基因敲除小鼠模型。研究人员利用Cre－loxP系统开展实验。Cre可识别DNA分子中特定的loxP序列，并将两个loxP序列之间的DNA序列剪除，切口连接形成的环化产物被降解，从而达到敲除特定基因的目的，如图1所示。请回答下列问题：
(1)Cre的作用类似于基因工程中的________，DNA切口环化连接的过程需要________________________________________________________________________。
(2)图2显示两类工具鼠，其中A鼠成对的CD36基因两侧分别引入一个同向loxP序列(基因型表示为L＋L＋，野生型为L－L－)，B鼠中含一个外源导入的Cre编码序列(基因型表示为C＋C－，野生型为C－C－)，Alb表示肝脏组织特异性启动子。利用A、B两类工具鼠作为亲本，选用合适的杂交策略，即可获得肝特异性CD36基因敲除目标小鼠。
①目标小鼠的基因型应为________。
A．L＋L＋C＋C－ B．L＋L＋C－C－
C．L－L－C＋C＋ D．L＋L－C＋C－
②选择合适的杂交策略，目标小鼠最早可出现在子________代。
(3)取鼠尾细胞通过琼脂糖凝胶电泳鉴定子代1～8号小鼠的基因型，结果如图3。已知A鼠、B鼠的基因型检测结果分别与图3中子代6号、1号小鼠相同，则图3中代表目标小鼠的是______号。
(4)对目标小鼠不同组织细胞基因检测，请将预期结果填在下面的表格中(＋表示存在，－表示缺失)。
细胞类型 Cre编码序列 CD36基因
肝脏细胞 ①________ ②________
心肌细胞 ③________ ④________
答案精析
真题演练
1．1/4　纯合子自交后代不发生性状分离
解析　选择单一位点插入目的基因的植株(用RO表示)进行自交一代，根据分离定律，r2HN纯合子植株(RR)占1/4，无r2HN基因的纯合子植株(OO)占1/4，杂合子植株(RO)占1/2。由于纯合子植株遗传性状稳定，故选择r2HN纯合子植株进行后续研究。
2．(1)分离　2/3　(2)Ⅲ④(或Ⅱ③)　(3)Aa　(4)基因A、a与M、m在一对同源染色体上(且距离近)，其中a和M在同一条染色体上；在减数分裂过程中四分体(同源染色体)的非姐妹染色单体发生了互换，导致产生同时含有a和m的重组型配子数量很少；类型3干瘪籽粒是由雌雄配子均为am的重组型配子受精而成。因此，类型3干瘪籽粒数量极少
解析　(1)分析题干信息：“甲品系玉米，其自交后的果穗上出现严重干瘪且无发芽能力的籽粒，这种异常籽粒约占1/4”，即甲品系籽粒正常，其自交后代出现性状分离，且籽粒正常∶干瘪＝3∶1，可知籽粒正常和干瘪这一对相对性状的遗传遵循孟德尔的分离定律。假设籽粒正常和干瘪这一对相对性状由基因A、a控制，则甲品系基因型为Aa。上述果穗上的正常籽粒基因型为1/3AA、2/3Aa，均发育为植株，自交后，有些植株果穗上有约1/4干瘪籽粒，这些植株基因型为Aa，所占比例约为2/3。(2)分析题意可知，假定A基因突变是导致籽粒干瘪的原因，由于转入的单个A基因已插入a基因所在染色体的非同源染色体上，则甲品系玉米基因型为OOAa，野生型玉米的基因型为OOAA(O表示没有相关基因)，转基因甲品系玉米的基因型为AOAa，且导入的A基因与细胞内原有的A/a基因之间遗传遵循自由组合定律，要证实该假设正确，可选择方案Ⅲ转基因玉米自交，依据自由组合定律可知，子代为④正常籽粒(9A_A_、3A_aa、3OOA_)∶干瘪籽粒(1OOaa)≈15∶1；或选择方案Ⅱ转基因玉米AOAa×甲品系(OOAa)杂交，子代为③正常籽粒(3AOA_、1AOaa、3OOA_)∶干瘪籽粒(OOaa)≈7∶1。(3)已知A基因突变是导致籽粒干瘪的原因，序列分析发现a基因是A基因中插入了一段DNA，使A基因功能丧失，甲品系(Aa)果穗上的正常籽粒(AA和Aa)发芽后，取其植株叶片，用图1中的引物1、2进行PCR扩增，若出现目标扩增条带，则可知相应植株中含有a基因，即其基因型为Aa。(4)用基因型为mm且籽粒正常的纯合子P(基因型为AAmm)与基因型为MM的甲品系(基因型为AaMM)杂交得F1，基因型为1/2AAMm、1/2AaMm，F1自交得F2。用M、m基因的特异性引物，对F1植株果穗上干瘪籽粒(F2)胚组织的DNA进行PCR扩增，扩增结果有1、2、3三种类型，基因型分别为aaMM、aaMm、aamm。若两对等位基因位于两对同源染色体上，则类型3的数量应该与类型1的数量同样多，而实际上类型3数量极少，原因可能是：由于基因A/a与M/m在一对同源染色体上(且距离近)，其中a和M在同一条染色体上；在减数分裂过程中四分体(同源染色体)的非姐妹染色单体发生了互换，导致产生同时含有a和m的重组型配子数量很少；类型3干瘪籽粒是由雌雄配子均为am的重组型配子受精而成。因此，类型3干瘪籽粒数量极少。
3．(1)显性　(2)Lox 1,2缺失型　Lox 3缺失型　控制Lox 1,2的基因位于一对同源染色体上并且不发生互换，控制Lox 3的基因位于另一对同源染色体上　(3)如图所示
(4)4　3/64　将这些种子长成的植株自交，对单株所得的所有种子进行蛋白质电泳检测，若某植株所有种子均不出现7S球蛋白条带，则该植株的种子能稳定遗传　(5)敲除7S球蛋白基因或导入7S球蛋白的反义基因，使7S球蛋白不能合成
解析　(1)由题意可知，将7S球蛋白缺失的大豆植株与脂氧酶完全缺失的植株杂交，获得F1种子，F1植株自交得到F2种子，由表中数据可知，F2种子中7S球蛋白缺失型与野生型的比例为3∶1，可知7S球蛋白缺失型为显性性状。(2)表中①②的表型需结合杂交过程、表格中性状分离比及电泳条带分析，据电泳条带示意图可知，一共有四种类型：F2种子中泳道3和6表现为野生型，泳道4和5表现为Lox 1,2,3全缺失型，泳道1和8表现为Lox 1,2缺失型，泳道2和7表现为Lox 3缺失型，Lox 1,2始终表现在一起，说明控制脂氧酶Lox 1,2的基因位于一条染色体上，故表中①的表型应为Lox 1,2缺失型，②的表型应为Lox 3缺失型；脂氧酶由三对等位基因控制，F2种子在脂氧酶的性状上表型只有四种，结合表中四种表型比例为9∶3∶3∶1，说明控制Lox 1,2的两对等位基因位于一对同源染色体上并且不发生同源染色体的非姐妹染色单体间的互换，控制Lox 3的一对等位基因位于另一对同源染色体上。(3)根据题中的杂交育种过程分析，F1应为杂合子，表现出显性性状7S球蛋白缺失型及脂氧酶Lox 1,2,3野生型，电泳检测结果应为仅有Lox 1,2,3三条电泳条带，绘制电泳图见答案。(4)由电泳图可知，第4泳道没有电泳条带，说明其种子表型为7S球蛋白缺失型与Lox 1,2,3全缺失型；由表格数据可知，7S球蛋白缺失型占3/4，Lox 1,2,3全缺失型占1/16，结合(1)的结论，这些种子在F2中的比例是3/4×1/16＝3/64。(5)利用基因工程方法，消除野生型大豆7S球蛋白条带过敏原，以提高大豆品质，可从7S球蛋白基因不存在或不表达方向思考，如敲除7S球蛋白基因或导入7S球蛋白基因的反义基因。
4．(1)1/6　MmRr　5/12　(2)0　M基因　必须有1个H基因位于M所在染色体上，且2条同源染色体上不能同时存在H基因　1/2n　(3)以雄性不育植株为母本、植株甲为父本进行杂交，子代中大花植株即为所需植株(或利用雄性不育植株与植株甲杂交，子代中大花植株即为所需植株)
解析　(1)基因型为 Mm 的植株自交，F1中 MM∶Mm∶mm＝1∶2∶1 ，其中 MM、Mm 的植株表现为大花、可育， mm 的植株只产生可育雌配子，故只有1/3MM和2/3Mm能够自交，则F2 中雄性不育植株mm所占的比例为2/3×1/4＝1/6。雄性不育植株mm与野生型植株杂交所得可育(Mm)晚熟红果(Rr)杂交种的基因型为MmRr，以该杂交种为亲本连续种植，若每代均随机受粉，即自由交配，两对等位基因自由组合，产生的配子有MR、Mr、mR、mr，比例为1∶1∶1∶1，则F1中有9种基因型，分别为：1MMRR、2MMRr、1MMrr、2MmRR、4MmRr、2Mmrr、1mmRR、2mmRr、1mmrr，雌配子种类及比例为：MR∶Mr∶mR∶mr＝1∶1∶1∶1，雄配子种类及比例为：MR∶Mr∶mR∶mr＝2∶2∶1∶1，则 F2 中可育晚熟红果植株(基因型为M－Rr )所占比例为 1/4×3/6＋1/4×3/6＋1/4×2/6＋1/4×2/6＝10/24，即5/12。(2)已知细菌中的 H 基因控制某种酶的合成，导入 H 基因的转基因番茄植株中，H 基因只在雄配子中表达，喷施萘乙酰胺(NAM)后含 H 基因的雄配子死亡。H 基因在每条染色体上最多插入 1 个且不影响其他基因。将 H 基因导入基因型为 Mm 的细胞，并获得转基因植株甲和乙，则 H 基因的可能位置有：插入了M基因所在的染色体上、插入了m基因所在的染色体上、插入了2号染色体以外的染色体上，植株甲和乙分别与雄性不育植株mm杂交，在形成配子时喷施 NAM，则含 H 基因的雄配子死亡，F1 均表现为雄性不育mm，说明含有M基因的雄配子死亡，即有H 基因插入了M基因所在的染色体上。若植株甲和乙的体细胞中含 1 个或多个 H 基因，以上所得F1 均表现为雄性不育，说明F1 的体细胞中含有0个 H 基因。若植株甲的体细胞中仅含 1个 H 基因，则 H 基因插入了M基因所在的染色体上，即H与M基因连锁。若植株乙的体细胞中含 n 个 H 基因，则 H 基因在染色体上的分布必须满足的条件是必须有1个H基因位于M所在染色体上，且2条同源染色体上不能同时存在H基因，植株乙与雄性不育植株杂交，若不喷施NAM，则子一代中不含 H 基因的雄性不育植株所占比例为1/2n。(3)若植株甲的体细胞中仅含一个 H 基因，且H 基因插入了M基因所在的染色体上，在不喷施 NAM 的情况下，以雄性不育植株mm为母本、植体甲HMm为父本进行杂交，雌配子种类为m，雄配子为HM、m，则子代中大花植株(基因型为HMm)即为与植株甲基因型相同的植株(或利用雄性不育株与植株甲杂交，子代中大花植株即为所需植株)。
5．用限制酶B处理　3
解析　突变基因上有一个限制酶B的酶切位点，故检测F2基因型的实验步骤为：提取基因组DNA→PCR→回收扩增产物→用限制酶B处理→电泳。野生型的基因电泳结果有1条带，黄化叶的基因电泳结果有2条带，则F2中杂合子电泳条带数目应为3条。
模拟预测
1．(1)等于　子代穗子大于野生型　(2)转录　APO1蛋白的降解　(3)9∶3∶4
解析　(1)将穗子显著大于野生型的突变体与野生型杂交，若F1穗子与野生型相等，说明野生型是显性性状，大穗为隐性性状；突变体1和2都是纯合子，且都为隐性性状，若将突变体1与突变体2杂交，子代穗子大于野生型，没有出现新的表型，说明两种突变体突变基因为同一位点的基因(等位基因)。(2)对比图中结果，野生型与突变体1的mRNA(和Actin)含量差不多，但是APO1蛋白含量只有突变体1的一半，可知Os基因对APO1基因的转录无影响，其可能是通过促进APO1蛋白的降解(或抑制翻译过程)，从而降低细胞中APO1含量。(3)结合题干信息可知，突变体1为Os基因功能缺失型隐性纯合突变体，突变体3为APO1基因功能缺失型隐性纯合突变体，故突变体1的基因型可表示为APO1APO1_ _，突变体3的基因型可表示为_ _OsOs，将突变体1和突变体3杂交，F1基因型为APO1_ Os_ ，让F1自交，子代性状分离比为野生型(9APO1_Os_)∶大穗(3APO1_ _ _)∶小穗(3_ _OsOs、1_ _ _ _)＝9∶3∶4，则说明Os基因与APO1基因在同一通路发挥作用，共同影响穗子的大小。
2．(1)AaBb　一种测交后代抗旱植株占1/4，符合测交后代1∶1∶1∶1的变式　(2)AB　1/2　单倍体育种　(3)位于三对同源染色体上　A或B　a或b
解析　(1)分析题意，A、B同时存在时才表现为抗旱(A_B_)，不抗旱纯合植株基因型为AAbb、aaBB、aabb，其中两纯合植株杂交，F1均表现为抗旱，可知亲本基因型为AAbb、aaBB，F1基因型为AaBb；取F1某一植株进行两组测交实验，其中一种测交后代抗旱植株(AaBb)占1/4，符合1∶1∶1∶1，所以两对基因的遗传遵循自由组合定律。(2)分析题意，另一种测交后代抗旱植株(AaBb)比例占1/7，可知AaBb的配子AB∶Ab∶aB∶ab比例为1∶2∶2∶2，说明F1的雌配子或雄配子中AB基因型有一半致死。若致死现象出现在雄配子中，可以用花药进行单倍体育种进行验证，该育种方法的优点是明显缩短育种年限。(3)转基因植株自交，若后代抗旱耐寒∶不抗旱耐寒∶抗旱不耐寒∶不抗旱不耐寒＝3∶3∶1∶1，其中抗旱∶不抗旱＝1∶1，耐寒∶不耐寒＝3∶1，两对性状遗传遵循自由组合定律，而抗旱的遗传也遵循自由组合定律，所以三对基因位于三对同源染色体上。若后代抗旱耐寒∶不抗旱耐寒∶抗旱不耐寒∶不抗旱不耐寒＝7∶3∶0∶4，从比例上来看是9∶3∶3∶1的变式，而且后代抗旱的都耐寒，不抗旱的有3份(A_bb或aaB_)耐寒，有3(aaB_或A_bb)＋1(aabb)份不耐寒，可以推测出D基因与A或B基因位于同一条染色体上。若D基因与a基因位于同一条染色体上，1/2AB致死的一方配子AB∶Ab∶aDB∶aDb比例为1∶2∶2∶2；另一方配子AB∶Ab∶aDB∶aDb比例为1∶1∶1∶1，通过配子彼此结合，后代抗旱耐寒(3AaDBB,7AaDBb)∶不抗旱耐寒(2aaDDBB,4aaDDBb,4AaDbb,2aaDDbb)∶抗旱不耐寒(1AABB,3AABb)∶不抗旱不耐寒(2AAbb)＝5∶6∶2∶1，同理若D基因与b基因位于同一条染色体上也是这样的比例。
3．(1)直接　12　(2)雄性不育基因位于细胞核中；雄性不育基因是隐性基因　(3)①蓝色∶白色≈1∶1　根据种子的颜色即可判断育性(或蓝色用于留种制备新的品系，白色用于制备杂交种时作母本)　②SpeⅠ、EcoRⅠ　XbaⅠ、EcoRⅠ
解析　(1)杂交种等水稻品种用于农业生产和科学研究，体现了生物多样性的直接价值，水稻属于二倍体生物，不含性染色体，所以基因组测序要测定其一个染色体组即12条染色体上的DNA分子上的碱基序列。(2)依据题干信息，光温敏雄性不育系与9种常规雄性可育系进行正反交，所得的F1均为雄性可育，说明了雄性不育基因位于细胞核中；雄性不育基因是隐性基因，雄性可育基因是显性基因。(3)①依据题干信息可知，A基因为雄配子致死基因，所以当基因型为mmADM的个体自交时，可以产生基因型为mADM、m的雌配子，而只能产生基因型为m的雄配子，雌雄配子随机结合，子代的基因型为mmADM和mm，对应的育性表现为雄性可育、雄性不育。由于D基因的表达产物可使种子呈现蓝色，无D基因的种子呈现白色，所以，子代种子的表型及比例为蓝色∶白色≈1∶1，这种改良品系的优点是可以根据种子的颜色来判断育性。②依据题干信息，需在已插入M基因的载体中再插入A、D融合基因，而且使基因表达载体中A、D融合基因和M基因都正确表达。由图可知，M基因内部存在SpeⅠ和BamHⅠ两种限制酶酶切位点，因此对载体酶切时不能选择这两种酶，且不能选择限制酶SmaⅠ(酶切后产生平末端)，否则会导致基因不能正确表达，所以在切割载体时，应用限制酶XbaⅠ、EcoRⅠ进行酶切。由于A、D融合基因拼接处存在XbaⅠ的识别序列，故不能选择XbaⅠ对目的基因进行酶切，但需要目的基因有与载体相同的黏性末端，且限制酶XbaⅠ和SpeⅠ所产生的黏性末端相同，因此可在A、D融合基因两端应添加SpeⅠ、EcoRⅠ两种限制酶的识别序列，确保其正向连接。
4．(1)限制酶　DNA连接酶　(2)①A　②二　(3)8
(4)①＋　②－　③＋　④＋
解析　(1)结合图示可知，Cre能将双链DNA在特定部位切割开，因此其类似于基因工程中的限制酶；经过Cre切割后，形成的DNA片段两端含有相同的黏性末端，因而该DNA片段能发生环化，在DNA切口环化连接的过程中需要DNA连接酶的作用。(2)基因型为L＋L＋C＋C－的目标鼠，其中含有的CD36基因无法表达，相当于获得了肝特异性CD36基因敲除目标小鼠，A正确；基因型为L＋L＋C－C－的目标鼠中不含有肝组织特异性，不符合要求，B错误；基因型为L－L－C＋C＋的目标鼠中CD36基因会表达，不符合要求，C错误；基因型为L＋L－C＋C－的目标鼠中CD36基因会表达，不符合要求，D错误。图中A鼠的基因型可表示为L＋L＋C－C－，B鼠的基因可表示为L－L－C＋C－，二者杂交获得的子一代的基因型可表示为L＋L－C＋C－和L＋L－C－C－，然后让子一代中基因型为L＋L－C＋C－的小鼠与A鼠进行杂交即可获得基因型为L＋L＋C＋C－的目标鼠，即最早可出现在子二代。(3)已知A鼠的基因型为L＋L＋C－C－，对应6号，B鼠的基因型为L－L－C＋C－，对应1号，而目标鼠的基因型为L＋L＋C＋C－，则经过比对可以发现图3中代表目标小鼠的是8号。(4)目标小鼠的肝脏细胞中有Cre编码序列，且有相应的在肝脏细胞中表达的特定的启动子，进而表达出Cre，而Cre可将肝脏细胞中的CD36基因切除，而心肌细胞存在Cre编码序列但不能表达出Cre，因此有相应的CD36基因。(共53张PPT)
专题八　
第5练
基因工程与遗传定律
1.(2024·河北，22节选)新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合子植株的占比为____。选择纯合子进行后续研究的原因是______________________________。
真题演练
PART ONE
1/4
纯合子自交后代不发生性状分离
选择单一位点插入目的基因的植株(用RO表示)进行自交一代，根据分离定律，r2HN纯合子植株(RR)占1/4，无r2HN基因的纯合子植株(OO)占1/4，杂合子植株(RO)占1/2。由于纯合子植株遗传性状稳定，故选择r2HN纯合子植株进行后续研究。
2.(2021·北京，20)玉米是我国重要的农作物，研究种子发育的机理对培育高产优质的玉米新品种具有重要作用。
(1)玉米果穗上的每一个籽粒都是受精后发育而来。我国科学家发现了甲品系玉米，其自交后的果穗上出现严重干瘪且无发芽能力的籽粒，这种异常籽粒约占1/4。籽粒正常和干瘪这一对相对性状的遗传遵循孟德尔的__________定律。上述果穗上的正常籽粒均发育为植株，自交后，有些植株果穗上有约1/4干瘪籽粒，这些植株所占比例约为_____。
分离
2/3
分析题干信息：“甲品系玉米，其自交后的果穗上出现严重干瘪且无发芽能力的籽粒，这种异常籽粒约占1/4”，即甲品系籽粒正常，其自交后代出现性状分离，且籽粒正常∶干瘪＝3∶1，可知籽粒正常和干瘪这一对相对性状的遗传遵循孟德尔的分离定律。假设籽粒正常和干瘪这一对相对性状由基因A、a控制，则甲品系基因型为Aa。上述果穗上的正常籽粒基因型为1/3AA、2/3Aa，均发育为植株，自交后，有些植株果穗上有约1/4干瘪籽粒，这些植株基因型为Aa，所占比例约为2/3。
(2)为阐明籽粒干瘪性状的遗传基础，研究者克隆出候选基因A/a。将A基因导入到甲品系中，获得了转入单个A基因的转基因玉米。假定转入的A基因已插入a基因所在染色体的非同源染色体上，请从下表中选择一种实验方案及对应的预期结果以证实“A基因突变是导致籽粒干瘪的原因”。______________。
实验方案 预期结果
Ⅰ.转基因玉米×野生型玉米 Ⅱ.转基因玉米×甲品系 Ⅲ.转基因玉米自交 Ⅳ.野生型玉米×甲品系 ①正常籽粒∶干瘪籽粒≈1∶1
②正常籽粒∶干瘪籽粒≈3∶1
③正常籽粒∶干瘪籽粒≈7∶1
④正常籽粒∶干瘪籽粒≈15∶1
Ⅲ④(或Ⅱ③)
分析题意可知，假定A基因突变是导致籽粒干瘪的原因，由于转入的单个A基因已插入a基因所在染色体的非同源染色体上，则甲品系玉米基因型为OOAa，野生型玉米的基因型为OOAA(O表示没有相关基因)，转基因甲品系玉米的基因型为AOAa，且导入的A基因与细胞内原有的A/a基因之间遗传遵循自由组合定律，要证实该假设正确，可选择方案Ⅲ转基因玉米自交，依据自由组合定律可知，子代为④正常籽粒(9A_A_、3A_aa、3OOA_)∶干瘪籽粒(1OOaa)≈15∶1；或选择方案Ⅱ转基因玉米AOAa×甲品系(OOAa)杂交，子代为③正常籽粒(3AOA_、1AOaa、3OOA_)∶干瘪籽粒(OOaa)≈7∶1。
(3)现已确认A基因突变是导致籽粒干瘪的原因，序列分析发现a基因是A基因中插入了一段DNA(见图1)，使A基因功能丧失。甲品系果穗上的正常籽粒发芽后，取其植株叶片，用图1中的引物1、2进行PCR扩增，若出现目标扩增条带则可知相应植株的基因型为_____。
Aa
已知A基因突变是导致籽粒干瘪的原因，序列分析发现a基因是A基因中插入了一段DNA，使A基因功能丧失，甲品系(Aa)果穗上的正常籽粒(AA和Aa)发芽后，取其植株叶片，用图1中的引物1、2进行PCR扩增，若出现目标扩增条带，则可知相应植株中含有a基因，即其基因型为Aa。
(4)为确定A基因在玉米染色体上的位置，借助位置已知的M/m基因进行分析。用基因型为mm且籽粒正常的纯合子P与基因型为MM的甲品系杂交得F1，F1自交得F2。用M、m基因的特异性引物，对F1植株果穗上干瘪籽粒
(F2)胚组织的DNA进行PCR扩增，扩增结果有1、 2、3三种类型，如图2所示。
统计干瘪籽粒(F2)的数量，发现类型1最多、类型2较少、类型3极少。请解释类型3数量极少的原因。_______________________________________________
_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
基因A、a与M、m在一对同源染色体上(且距离近)，其中a和M在同一条染色体上；在减数分裂过程中四分体(同源染色体)的非姐妹染色单体发生了互换，导致产生同时含有a和m的重组型配子数量很少；类型3干瘪籽粒是由雌雄配子均为am的重组型配子受精而成。因此，类型3干瘪籽粒数量极少
用基因型为mm且籽粒正常的纯合子P(基因型为AAmm)与基因型为MM的甲品系(基因型为AaMM)杂交得F1，基因型为1/2AAMm、1/2AaMm，F1自交得F2。用M、m基因的特异性引物，对F1植株果穗上干瘪籽粒(F2)胚
组织的DNA进行PCR扩增，扩增结果有1、2、3三种类型，基因型分别为aaMM、aaMm、aamm。若两对等位基因位于两对同源染色体上，则类型3的数量应该与类型1的数量同样多，而实际上类型3数量极少，原因可能是：由于基因A/a与M/m在一对同源染色体上(且距离近)，其中a和M在同一条染色体上；在减数分裂过程中四分体(同源染色体)的非姐妹染色单体发生了互换，导致产生同时含有a和m的重组型配子数量很少；类型3干瘪籽粒是由雌雄配子均为am的重组型配子受精而成。因此，类型3干瘪籽粒数量极少。
3.(2022·福建，12)7S球蛋白是大豆最主要的过敏原蛋白，三种大豆脂氧酶Lox-1,2,3是大豆产生腥臭味的原因。大豆食品深加工过程中需要去除7S球蛋白和三种脂氧酶。科研人员为获得7S球蛋白与三种脂氧酶同时缺失的大豆新品种，将7S球蛋白缺失的大豆植株与脂氧酶完全缺失的植株杂交，获得F1种子。F1植株自交得到F2种子。对F1种子和F2种子的7S球蛋白和脂氧酶进行蛋白质电泳检测，不同表型的电泳条带示意如图。
注：图中黑色条带为抗原－抗体杂交带，表示相应蛋白质的存在。M泳道条带为相应标准蛋白所在位置，F1种子泳道的条带待填写。
根据电泳检测的结果，对F2种子表型进行分类统计如表。
F2种子表型 粒数
7S球蛋白 野生型 124
7S球蛋白缺失型 377
脂氧酶 Lox-1,2,3 野生型 282
① 94
② 94
Lox-1,2,3全缺失型 31
回答下列问题：
(1)7S球蛋白缺失型属于______(填“显性”或“隐性”)性状。
显性
由题意可知，将7S球蛋白缺失的大豆植株与脂氧酶完全缺失的植株杂交，获得F1种子，F1植株自交得到F2种子，由表中数据可知，F2种子中7S球蛋白缺失型与野生型的比例为3∶1，可知7S球蛋白缺失型为显性性状。
(2)表中①②的表型分别是______________、_____________。脂氧酶 Lox-1,2,3分别由三对等位基因控制，在脂氧酶是否缺失的性状上，F2种子表型只有四种，原因是_________________________________________
_____________________________________________________。
Lox-1,2缺失型
Lox-3缺失型
控制Lox-1,2的基因位于一对同源染色体上并且不发生互换，控制Lox-3的基因位于另一对同源染色体上
表中①②的表型需结合杂交过程、表格中性状分离比及电泳条带分析，据电泳条带示意图
可知，一共有四种类型：F2种子中泳道3和6表现为野生型，泳道4和5表现为Lox-1,2,3全缺失型，泳道1和8表现为Lox-1,2缺失型，泳道2和7表现为Lox-3缺失型，Lox-1,2始终表现在一起，说明控制脂氧酶Lox-1,2的基因位于一条染色体上，故表中①的表型应为Lox-1,2缺失型，②的表型应为Lox-3缺失型；脂氧酶由三对等位基因控制，F2种
子在脂氧酶的性状上表型只有四种，结合表中四种表型比例为9∶3∶3∶1，说明控制Lox-1,2的两对等位基因位于一对同源染色体上并且不发生同源染色体的非姐妹染色单体间的互换，控制Lox-3的一对等位基因位于另一对同源染色体上。
(3)在图中画出F1种子表型的电泳条带。
答案　如图所示
根据题中的杂交育种过程分析，F1应为杂合子，表现出显性性状7S球蛋白缺失型及脂氧酶Lox-1,2,3野生型，电泳检测结果应为仅有Lox-1,2,3三条电泳条带，绘制电泳图见答案。
(4)已知Lox基因和7S球蛋白基因独立遗传。图中第____泳道的种子表型为7S球蛋白与三种脂氧酶同时缺失型，这些种子在F2中的比例是______。利用这些种子选择并获得稳定遗传种子的方法是_____________________
______________________________________________________________________________________________________________。
4
3/64
将这些种子长成的植株自交，对单株所得的所有种子进行蛋白质电泳检测，若某植株所有种子均不出现7S球蛋白条带，则该植株的种子能稳定遗传
由电泳图可知，第4泳道没有电泳条带，说明其种子表型为7S球蛋白缺失型与Lox-1,2,3全缺失型；由表格数据可知，7S球蛋白缺失型占3/4，Lox-1,2,3全缺失型占1/16，结合(1)的结论，这些种子在F2中的比例是3/4×1/16＝3/64。
(5)为提高大豆品质，利用基因工程方法提出一个消除野生型大豆7S球蛋白过敏原的设想。
______________________________________________________________。
敲除7S球蛋白基因或导入7S球蛋白的反义基因，使7S球蛋白不能合成
利用基因工程方法，消除野生型大豆7S球蛋白条带过敏原，以提高大豆品质，可从7S球蛋白基因不存在或不表达方向思考，如敲除7S球蛋白基因或导入7S球蛋白基因的反义基因。
4.(2021·山东，22)番茄是雌雄同花植物，可自花传粉也可异花受粉。M、m基因位于2号染色体上，基因型为mm的植株只产生可育雌配子，表现为小花、雄性不育。基因型为MM、Mm的植株表现为大花、可育。R、r基因位于5号染色体上，基因型为RR、Rr、rr的植株表现型分别为：正常成熟红果、晚熟红果、晚熟黄果。细菌中的H基因控制某种酶的合成，导入H基因的转基因番茄植株中，H基因只在雄配子中表达，喷施萘乙酰胺(NAM)后含H基因的雄配子死亡。不考虑基因突变和染色体互换。请回答下列问题：
(1)基因型为Mm的植株连续自交两代，F2中雄性不育植株所占的比例为____。雄性不育植株与野生型植株杂交所得可育晚熟红果杂交种的基因型为_______，以该杂交种为亲本连续种植，若每代均随机受粉，则F2中可育晚熟红果植株所占比例为_____。
1/6
MmRr
5/12
基因型为Mm的植株自交，F1中 MM∶Mm∶mm＝1∶2∶1，其中MM、Mm的植株表现为大花、可育，mm的植株只产生可育雌配子，故只有1/3MM和2/3Mm能够自交，则F2 中雄性不育植株mm所占的比例为2/3×1/4＝1/6。雄性不育植株mm与野生型植株杂交所得可育(Mm)晚熟红果(Rr)杂交种的基因型为MmRr，以该杂交种为亲本连续种植，若每代均随机受粉，即自由交配，两对等位基因自由组合，产生的配子有MR、Mr、mR、mr，比例为1∶1∶1∶1，则F1中有9种基因型，分别为：1MMRR、2MMRr、1MMrr、2MmRR、4MmRr、2Mmrr、1mmRR、2mmRr、1mmrr，雌配子种类及比例为：MR∶Mr∶mR∶mr＝1∶1∶1∶1，雄配子种类及比例为：MR∶Mr∶mR∶mr＝2∶2∶1∶1，则F2 中可育晚熟红果植株(基因型为M－Rr )所占比例为 1/4×3/6＋1/4×3/6＋1/4×2/6＋1/4×2/6＝10/24，即5/12。
(2)已知H基因在每条染色体上最多插入1个且不影响其他基因。将H基因导入基因型为Mm的细胞并获得转基因植株甲和乙，植株甲和乙分别与雄性不育植株杂交，在形成配子时喷施NAM，F1均表现为雄性不育。若植株甲和乙的体细胞中含1个或多个H基因，则以上所得F1的体细胞中含有____个H基因。若植株甲的体细胞中仅含1个H基因，则H基因插入了________所在的染色体上。若植株乙的体细胞中含n个H基因，则H基因在染色体上的分布必须满足的条件是_______________________________
________________________________________，植株乙与雄性不育植株杂交，若不喷施NAM，则子一代中不含H基因的雄性不育植株所占比例为____。
0
M基因
必须有1个H基因位于M所在染色体上，且2条同源染色体上不能同时存在H基因
1/2n
已知细菌中的H基因控制某种酶的合成，导入H基因的转基因番茄植株中，H基因只在雄配子中表达，喷施萘乙酰胺(NAM)后含H基因的雄配子死亡。H基因在每条染色体上最多插入1个且不影响其他基因。将H基因导入基因型为Mm的细胞，并获得转基因植株甲和乙，则H基因的可能位置有：插入了M基因所在的染色体上、插入了m基因所在的染色体上、插入了2号染色体以外的染色体上，植株甲和乙分别与雄性不育植株mm杂交，在形成配子时喷施NAM，则含H基因的雄配子死亡，F1均表现为雄性不育mm，说明含有M基因的雄配子死亡，
即有H基因插入了M基因所在的染色体上。若植株甲和乙的体细胞中含 1 个或多个 H 基因，以上所得F1 均表现为雄性不育，说明F1 的体细胞中含有0个 H 基因。若植株甲的体细胞中仅含1个H基因，则H基因插入了M基因所在的染色体上，即H与M基因连锁。若植株乙的体细胞中含 n 个H基因，则H基因在染色体上的分布必须满足的条件是必须有1个H基因位于M所在染色体上，且2条同源染色体上不能同时存在H基因，植株乙与雄性不育植株杂交，若不喷施NAM，则子一代中不含H基因的雄性不育植株所占比例为1/2n。
(3)若植株甲的体细胞中仅含一个H基因，在不喷施NAM的情况下，利用植株甲及非转基因植株通过一次杂交即可选育出与植株甲基因型相同的植株。请写出选育方案：________________________________________________________
_________________________________________________________________________________。
以雄性不育植株为母本、植株甲为父本进行杂交，子代中大花植株即为所需植株(或利用雄性不育植株与植株甲杂交，子代中大花植株即为所需植株)
若植株甲的体细胞中仅含一个H基因，且H 基因插入了M基因所在的染色体上，在不喷施NAM的情况下，以雄性不育植株mm为母本、植体甲HMm为父本进行杂交，雌配子种类为m，雄配子为HM、m，则子代中大花植株(基因型为HMm)即为与植株甲基因型相同的植株(或利用雄性不育株与植株甲杂交，子代中大花植株即为所需植株)。
5.(2023·北京，19节选)二十大报告提出“种业振兴行动”。油菜是重要的油料作物，筛选具有优良性状的育种材料并探究相应遗传机制，对创制高产优质新品种意义重大。请回答下列问题：
科学家克隆出导致新生叶黄化的基因，与野生型相比，它在DNA序列上有一个碱基对改变，导致突变基因上出现了一个限制酶B的酶切位点(如图)。据此，检测F2基因型的实验步骤为：提取基因组DNA→PCR→回收扩增产物→________________→电泳。F2中杂合子电泳条带数目应为____条。
用限制酶B处理
3
突变基因上有一个限制酶B的酶切位点，故检测F2基因型的实验步骤为：提取基因组DNA→PCR→回收扩增产物→用限制酶B处理→电泳。野生型的基因电泳结果有1条带，黄化叶的基因电泳结果有2条带，则F2中杂合子电泳条带数目应为3条。
1.(2024·天津高三模拟)水稻是世界上最重要的粮食作物。为提高水稻产量，科研人员通过突变育种的方式筛选出了单基因纯合突变体1～4四种品种。通过测序发现，突变体1为Os基因功能缺失突变体，该基因位于12号染色体上。请回答下列问题：
(1)科研人员观察发现突变体1和突变体2水稻穗子显著大于野生型。分别将其与野生型水稻杂交，获得的F1的穗子______(填“大于”“等于”或“小于”)野生型，说明大穗为隐性性状。将突变体1与突变体2杂交，若_____
_______________，没有出现新的表型，说明两种突变体突变基因为同一位点的基因。
模拟预测
PART TWO
等于
子代
穗子大于野生型
将穗子显著大于野生型的突变体与野生型杂交，若F1穗子与野生型相等，说明野生型是显性性状，大穗为隐性性状；突变体1和2都是纯合子，且都为隐性性状，若将突变体1与突变体2杂交，子代穗子大于野生型，没有出现新的表型，说明两种突变体突变基因为同一位点的基因(等位基因)。
(2)研究表明，位于水稻6号染色体上的APO1基因与水稻穗子大小有关，突变体3为APO1基因功能缺失型隐性纯合突变体、穗子显著小于野生型；突变体4为APO1基因功能增强型显性纯合突变体，穗子显著大于野生型。研究人员将等量的APO1基因分别导入野生型和突变体1的植株中，测定细胞中APO1 mRNA的含量和APO1蛋白含
注：Actin即“肌动蛋白”，在不同种类细胞中的表达量相对稳定，在该实验中作为参照指标。
量，结果如图。上述实验结果说明Os基因对APO1基因的______过程无影响，可能是通过促进__________________，降低细胞中APO1含量。
转录
APO1蛋白的降解
对比图中结果，野生型与突变体1的mRNA(和Actin)含量差不多，但是APO1蛋白含量只有突变体1的一半，可知Os基因对APO1基因的转录无影响，其可能是通过促进APO1蛋白的降解
(或抑制翻译过程)，从而降低细胞中APO1含量。
(3)为了进一步确定Os基因与APO1基因是否相互作用，共同调控水稻穗子的大小，研究人员将突变体1和突变体3杂交后代F1自交，若子代性状及比例为野生型∶大穗∶小穗＝________，说明(2)中结论成立，Os基因与APO1基因共同影响穗子的大小。
9∶3∶4
示为_ _OsOs，将突变体1和突变体3杂交，F1基因型为APO1_ Os_ ，让F1自交，子代性状分离比为野生型(9APO1_Os_)∶大穗(3APO1_ _ _)∶小穗(3_ _OsOs、1_ _ _ _)＝9∶3∶4，则说明Os基因与APO1基因在同一通路发挥作用，共同影响穗子的大小。
结合题干信息可知，突变体1为Os基因功能缺失型隐性纯合突变体，突变体3为APO1基因功能缺失型隐性纯合突变体，故突变体1的基因型可表示为APO1APO1_ _，突变体3的基因型可表
2.某植物抗旱与否由基因A(a)、B(b)控制，只有A、B同时存在时才表现为抗旱。不抗旱的两纯合植株杂交，F1均表现为抗旱，取F1某一植株进行两组测交实验，正交、反交后代抗旱植株分别占1/7、1/4。据此推测这种植物雌配子或雄配子存在某种基因型的部分致死现象(不考虑染色体互换、基因突变和染色体变异)。请回答下列问题：
(1)F1的基因型为_______。A(a)、B(b)的遗传遵循自由组合定律，判定依据是________________________________________________________。
AaBb
一种测交后代抗旱植株占1/4，符合测交后代1∶1∶1∶1的变式
分析题意，A、B同时存在时才表现为抗旱(A_B_)，不抗旱纯合植株基因型为AAbb、aaBB、aabb，其中两纯合植株杂交，F1均表现为抗旱，可知亲本基因型为AAbb、aaBB，F1基因型为AaBb；取F1某一植株进行两组测交实验，其中一种测交后代抗旱植株(AaBb)占1/4，符合1∶1∶1∶1，所以两对基因的遗传遵循自由组合定律。
(2)F1植株的_____基因型的雌或雄配子存在致死现象，致死率为_____。若致死现象出现在雄配子中，可以用___________进行验证，该育种方法的优点是可以明显缩短育种年限。
AB
1/2
单倍体育种
分析题意，另一种测交后代抗旱植株(AaBb)比例占1/7，可知AaBb的配子AB∶Ab∶aB∶ab比例为1∶2∶2∶2，说明F1的雌配子或雄配子中AB基因型有一半致死。若致死现象出现在雄配子中，可以用花药进行单倍体育种进行验证，该育种方法的优点是明显缩短育种年限。
(3)若通过基因工程将耐寒基因D导入F1植株中，将转基因植株自交，若后代抗旱耐寒∶不抗旱耐寒∶抗旱不耐寒∶不抗旱不耐寒＝3∶3∶1∶1，则抗旱基因和抗寒基因在染色体上的位置关系为_____________________。
若后代抗旱耐寒∶不抗旱耐寒∶抗旱不耐寒∶不抗旱不耐寒＝7∶3∶0∶
4，则D基因与_______基因位于同一条染色体上。
若后代抗旱耐寒∶不抗旱耐寒∶抗旱不耐寒∶不抗旱不耐寒＝5∶6∶2∶
1，则D基因与______基因位于同一条染色体上。
位于三对同源染色体上
A或B
a或b
转基因植株自交，若后代抗旱耐寒∶不抗旱耐寒∶抗旱不耐寒∶不抗旱不耐寒＝3∶3∶1∶1，其中抗旱∶不抗旱＝1∶1，耐寒∶不耐寒＝3∶1，两对性状遗传遵循自由组合定律，而抗旱的遗传也遵循自由组合定律，所以三对基因位于三对同源染色体上。若后代抗旱耐寒∶不抗旱耐寒∶抗旱不耐寒∶不抗旱不耐寒＝7∶3∶0∶4，从比例上来看是9∶3∶3∶1的变式，而且后代抗旱的都耐寒，不抗旱的有3份(A_bb或aaB_)耐寒，有3(aaB_或A_bb)＋1(aabb)份不耐寒，可以推测出D基因与A或B基因位于同一条染色体上。若D基因与a基因位于同一条染色体上，1/2AB致死的一方配子AB∶Ab∶aDB∶aDb比例为
1∶2∶2∶2；另一方配子AB∶Ab∶aDB∶aDb比例为1∶1∶1∶1，通过配子彼此结合，后代抗旱耐寒(3AaDBB，7AaDBb)∶不抗旱耐寒(2aaDDBB，4aaDDBb，4AaDbb，2aaDDbb)∶抗旱不耐寒(1AABB，3AABb)∶不抗旱不耐寒(2AAbb)＝5∶6∶2∶1，同理若D基因与b基因位于同一条染色体上也是这样的比例。
3.“杂交水稻之父”袁隆平利用雄性不育野生稻改写了世界水稻育种史，杂交水稻研究团队不断刷新我国水稻产量和品质，举世瞩目。请分析回答下列问题：
(1)水稻(2n＝24)是禾本科植物，在我国有野生种、引进种、杂交种等水稻品种用于农业生产和科学研究，这主要体现了生物多样性的______价值。在育种研究中，对水稻进行基因组测序要测_____条染色体中DNA的碱基序列。
直接
12
杂交种等水稻品种用于农业生产和科学研究，体现了生物多样性的直接价值，水稻属于二倍体生物，不含性染色体，所以基因组测序要测定其一个染色体组即12条染色体上的DNA分子上的碱基序列。
(2)安农S－1是我国发现的第一个籼稻(水稻的一个品种)光温敏雄性不育系。该光温敏雄性不育系与9种常规雄性可育系进行正反交，得到的F1均为雄性可育。据此可推出有关该雄性不育基因的两个结论是：_________
_________________________________________。
雄性不育基因位于细胞核中；雄性不育基因是隐性基因
依据题干信息，光温敏雄性不育系与9种常规雄性可育系进行正反交，所得的F1均为雄性可育，说明了雄性不育基因位于细胞核中；雄性不育基因是隐性基因，雄性可育基因是显性基因。
①图中基因型为mmADM的个体自交时(不考虑突变和互换)，子代种子的表型及比例为__________________，这种转基因改良品系的显著优点是______________________________________________________________________________________。
蓝色∶白色≈1∶1
根据种子的颜色即可判断育性(或蓝色用于留种制备新的品系，白色用于制备杂交种时作母本)
依据题干信息可知，A基因为雄配子致死基因，所以当基因型为mmADM的个体自交时，可以产生基因型为mADM、m
的雌配子，而只能产生基因型为m的雄配子，雌雄配子随机结合，子代的基因型为mmADM和mm，对应的育性表现为雄性可育、雄性不育。由于D基因的表达产物可使种子呈现蓝色，无D基因的种子呈现白色，所以，子代种子的表型及比例为蓝色∶白色≈1∶1，这种改良品系的优点是可以根据种子的颜色来判断育性。
②要成功得到转基因个体(mmADM)，先要构建基因表达载体。研究人员准备在已插入M基因的载体(如图)中再插入A、D融合基因。他们分析发现A、D融合基因拼接处存在XbaⅠ的识别序列，为使基因表达载体中A、D融合基因和M基因都正确表达，应在A、D融合基因两端添加
_______________两种限制酶的识别序列，并用________________两种限制酶对载体进行酶切。
SpeⅠ、EcoRⅠ
XbaⅠ、EcoRⅠ
依据题干信息，需在已插入M基因的载体中再插入A、D融合基因，而且使基因表达载体中A、D融合基因和M基因都正确表达。由图可知，M基因内部存在SpeⅠ和BamHⅠ两种限制酶酶切位点，因此对载体酶切时不能选择这两种酶，且不能选择限制酶SmaⅠ(酶切后产生平末端)，否则会导致基因不能正确表达，所以在切割载体时，
应用限制酶XbaⅠ、EcoRⅠ进行酶切。由于A、D融合基因拼接处存在XbaⅠ的识别序列，故不能选择XbaⅠ对目的基因进行酶切，但需要目的基因有与载体相同的黏性末端，且限制酶XbaⅠ和SpeⅠ所产生的黏性末端相同，因此可在A、D融合基因两端应添加SpeⅠ、EcoRⅠ两种限制酶的识别序列，确保其正向连接。
4.(2024·天津高三一模)为构建肝特异性CD36基因敲除小鼠模型。研究人员利用Cre－loxP系统开展实验。Cre可识别DNA分子中特定的loxP序列，并将两个loxP序列之间的DNA序列剪除，切口连接形成的环化产物被降解，从而达到敲除特定基因的目的，如图1所示。请回答下列问题：
(1)Cre的作用类似于基因工程中的________，DNA切口环化连接的过程需要___________。
限制酶
DNA连接酶
结合图示可知，Cre能将双链DNA在特定部位切割开，因此其类似于基因工程中的限制酶；经过Cre切割后，形成的DNA片段两端含有相同的黏性末端，因而该DNA片段能发生环化，在DNA切口环化连接的过程中需要DNA连接酶的作用。
(2)图2显示两类工具鼠，其中A鼠成对的CD36基因两侧分别引入一个同向loxP序列(基因型表示为L＋L＋，野生型为L－L－)，B鼠中含一个外源导入的Cre编码序列(基因型表示为C＋C－，野生型为C－C－)，Alb表示肝脏组织特异性启动子。利用A、B两类工具鼠作为亲本，选用合适的杂交策略，即可获得肝特异性CD36基因敲除目标小鼠。
①目标小鼠的基因型应为___。
A.L＋L＋C＋C－ B.L＋L＋C－C－
C.L－L－C＋C＋ D.L＋L－C＋C－
②选择合适的杂交策略，目标小鼠最早可出现在子____代。
A
二
基因型为L＋L＋C＋C－的目标鼠，其中含有的CD36基因无法表达，相当于获得了肝特异性CD36基因敲除目标小鼠，A正确；
基因型为L＋L＋C－C－的目标鼠中不含有肝组织特异性，不符合要求，B错误；
基因型为L－L－C＋C＋的目标鼠中CD36基因会表达，不符合要求，C错误；
基因型为L＋L－C＋C－的目标鼠中CD36基因会表达，不符合要求，D错误。
图中A鼠的基因型可表示为L＋L＋C－C－，B鼠的基因可表示为L－L－C＋C－，二者杂交获得的子一代的基因型可表示为L＋L－C＋C－和L＋L－C－C－，然后让子一代中基因型为L＋L－C＋C－的小鼠与A鼠进行杂交即可获得基因型为L＋L＋C＋C－的目标鼠，即最早可出现在子二代。
(3)取鼠尾细胞通过琼脂糖凝胶电泳鉴定子代1～8号小鼠的基因型，结果如图3。已知A鼠、B鼠的基因型检测结果分别与图3中子代6号、1号小鼠相同，则图3中代表目标小鼠的是____号。
8
已知A鼠的基因型为L＋L＋C－C－，对应6号，B鼠的基因型为L－L－C＋C－，对应1号，而目标鼠的基因型为L＋L＋C＋C－，则经过比对可以发现图3中代表目标小鼠的是8号。
(4)对目标小鼠不同组织细胞基因检测，请将预期结果填在下面的表格中(＋表示存在，－表示缺失)。
细胞类型 Cre编码序列 CD36基因
肝脏细胞 ①________ ②________
心肌细胞 ③________ ④________
＋
－
＋
＋
目标小鼠的肝脏细胞中有Cre编码序列，且有相应的在肝脏细胞中表达的特定的启动子，进而表达出Cre，而Cre可将肝脏细胞中的CD36基因切除，而心肌细胞存在Cre编码序列但不能表达出Cre，因此有相应的CD36基因。第6练　融合基因、融合蛋白、蛋白质相互作用 (重点突破)
1．(每空1分，共9分)(2022·江苏，24节选)纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题：
(1)纤毛结构如图Ⅰ所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由________________组成。基体由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能是__________________________________。
(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，溶液中添加NaCl至2.0 mol/L的目的是___________________。
PCR扩增时，需在____________催化下，在引物__________端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。
(3)为研究蛋白质X在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，可示其在细胞内位置。将X－GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y，构建Y－M重组质粒(在EcoR V位点插入片段)。请完成下表。
分步实验目标 简易操作、结果、分析
PCR鉴定正向重组质粒Y－M(图Ⅱ中融合片段M中有白色的箭头，代表方向) ①选择图Ⅱ引物__________； ②PCR目的产物约为__________bp
确保M及连接处序列正确，Y－M的连接处上游含有Hind Ⅲ＋EcoR V的识别序列，下游含有EcoR V＋BamH Ⅰ的识别序列 ③质粒测序，图Ⅲ中正确的是__________(选填序列编号)
检测融合蛋白定位 ④对照质粒Y－GFP(仅表达GFP)与实验质粒Y－M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明________________________________________________________________________
2．(11分)(2023·江苏，22)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：
(1)(3分)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有______________，扩增程序中最主要的不同是____________。
(2)(2分)有关基因序列如图2。引物F2－F、F1－R应在下列选项中选用________。
EGFP基因序列：5′ATGGTGAGCAAGGGC——GACGAGCTGTACAAG3′ AnB1基因序列：5′CATGTCCAGCTGCAG——CCAAAACCACAACCA3′
图2
A．ATGGTG——CAACCA
B．TGGTTG——CACCAT
C．GACGAG——CTGCAG
D．CTGCAG——CTCGTC
(3)(2分)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，不需要使用的酶主要有________________________________________________________________________。
(4)(1分)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有________。
A．稀释涂布平板需控制每个平板30～300个菌落
B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D．抗性平板上长出的单菌落不需要进一步划线纯化
(5)(1分)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板、用引物F1－F和F2－R进行了PCR扩增，质粒P1～P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有________。
(6)(2分)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
3．(每空2分，共14分)(2022·山东，25)某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG－P和FLAG－PΔ。PΔ是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或PΔ的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或PΔ的功能。
(1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是_______________________________________________________。
为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的__________(填“3′端”或“5′端”)。
(2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)融合蛋白表达成功后，将FLAG－P、FLAG－PΔ、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG－P和FLAG－PΔ不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是______________________________________；由②④组或③⑤组的差异推测，PΔ中缺失的特定序列的作用是_______________________________。
(4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是________________________________________________________________________。
1．(每空1分，共11分)(2024·南通高三二模)磷脂酸(PA)是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA的动态变化，研究人员用无缝克隆技术将高度专一的PA结合蛋白(PABD)基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量。无缝克隆技术连接DNA片段的机理和构建荧光探针表达载体过程如图所示，请回答下列问题：
(1)无缝克隆时，T5核酸外切酶沿________的方向水解DNA，其目的是形成________。T5核酸外切酶催化的最适温度为37 ℃，而过程①选择的温度为50 ℃，目的是降低酶活性，__________________。
(2)过程②两个片段复性后存在“缺口”的原因是________________________，过程③所需的酶有________________________________________________________________________。
(3)(多选)与传统的酶切再连法相比，无缝克隆技术构建重组质粒的优点有__________。
A．不受限制酶酶切位点的限制
B．不会引入多余碱基
C．操作时间短，成功率高
D．有利于多个小片段(小于50 bp)连接
(4)PCR扩增PABD基因时需依据_______________________________________________
________________________________________________________________________
设计引物R1。据图分析扩增目的片段的引物F1和R2对应于下表中的__________。
1 5′－TCCGGACTCAGATCTCGAGC－3′
2 5′－AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTAACTAGTCTTAGTGGCGTC－3′
3 5′－TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATGGTGAGCAAGGGCGA－3′
4 5′－GCTCGAGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCA－3′
(5)利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子(T1)进行表面消毒，均匀铺在含有__________的MS培养基上进行筛选和鉴定。T1代自交获得的T2代幼苗的抗性表现和比例为__________，说明T1为单位点插入的转基因株系。
(6)通过观测转基因拟南芥根尖细胞中______________，了解PA的动态变化。
2．(13分)研究发现，实体肿瘤内部通常是缺氧的环境，蓖麻毒素蛋白(RTA)可作用于核糖体，使蛋白合成受阻，从而引起细胞死亡。TAT是一种短肽，可转导蛋白进入细胞，含有氧依赖性降解区域ODD(多肽)的融合蛋白可以适应低氧条件稳定存在，但在常氧条件下会被蛋白酶降解。科研人员以RTA作为抑制肿瘤细胞增殖的活性分子，利用TAT的作用将融合蛋白转运进入肿瘤细胞，并利用ODD的作用减轻RTA对正常细胞的毒性，分别构建了含TAT－RTA(660 bp)和TAT－RTA－ODD(870 bp)融合基因的表达载体，并成功得到相关融合蛋白。回答下列问题：
(1)(5分)可采用PCR的方法获取融合基因TAT－RTA，需要根据TAT和RTA基因设计引物，引物的作用是______________________________________________________________
________________________________________________________________________。
已知RTA基因和欲得到的TAT－RTA融合基因的结构如图1所示，TAT基因编码链序列为5′ATGAGCTACGGCCGTAAAAAGAGACGCCAACGTAGA3′，为顺利构建表达载体，需要在引物1的5′端加入__________酶切位点，引物2的5′端加入__________酶切位点，利用TAT和RTA核酸序列设计引物时，要求在RTA蛋白的前端引入TAT短肽，请根据要求写出引物1的部分碱基序列__________(写出引物5′→3′端的12个碱基即可)。
(2)(5分)载体的部分结构如图2所示。His标签由连续的6个组氨酸构成，可用于对重组融合蛋白进行分离纯化，将PCR得到的TAT－RTA融合基因和载体双酶切后，再用__________酶连接，但是在研究时，发现融合蛋白中没有His标签蛋白，据图分析，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________，
结合图1和图2可对引物2序列5′CTCGAGGAACTG……3′进行________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
的设计可使His标签正常表达。
(3)(3分)科研人员将得到的重组融合蛋白经腹腔给药荷瘤小鼠(患实体肿瘤的小鼠称为荷瘤小鼠)，研究荷瘤小鼠肿瘤体积变化，结果如图3所示。TAT－RTA和TAT－RTA－ODD融合蛋白都可以抑制荷瘤小鼠肿瘤体积的增长，____________________的抑制效果更好，产生该实验结果的原因是______________________________________________________________
________________________________________________________________________。
3．(每空2分，共12分)酵母菌的转录因子蛋白由BD和AD两部分组成且结合在一起。BD负责与启动子上游序列结合，AD负责激活启动子转录。只有AD和BD同时存在且结合在一起时才能保证基因M的转录(如图所示)。基因M能表达时，酵母菌才能在缺乏组氨酸的培养基上生长。回答下列问题：
(1)酵母菌培养基一般都含有水、碳源、______和无机盐等营养物质，在酵母菌的纯培养过程中，采用____________________法能将单个微生物分散在固体培养基上。
(2)将BD与AD分开，BD基因与X基因共连一个载体，可表达出BD－X融合蛋白；AD基因与Y基因共连一个载体，可表达出AD－Y融合蛋白。将两个载体同时导入一个酵母细胞中，可以检测X蛋白与Y蛋白是否存在相互作用(即是否可以结合)，这种检测方法称为酵母双杂交。
①从酵母细胞中提取蛋白质，进行____________杂交，以检测是否产生M蛋白。若将酵母菌培养在____________培养基中，酵母菌仍然可以生长，则说明_______________________
________________________________________________________________________。
②在酵母双杂交的检测中可能出现假阳性的结果，原因是________________________________________________________________________。
答案精析
真题演练
1．(1)磷脂、蛋白质　发出星射线，形成纺锤体　(2)溶解DNA　耐高温DNA聚合酶(Taq酶)　3′　(3)①a、b　②1 100　③Q4　④X蛋白参与中心体的形成
解析　(2)从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，DNA在2.0 mol/L的NaCl溶液中的溶解度最大，高于或低于这一浓度，DNA的溶解度均会下降，因此实验过程中添加NaCl至2.0 mol/L的目的是溶解DNA。PCR扩增时，需在DNA聚合酶(即Taq酶)的催化下，在引物的3′端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。(3)PCR扩增目的DNA片段时，在引物的3′端进行DNA链的延伸，据图可知，应选择图Ⅱ中的引物a和引物b，PCR目的产物约为300＋800＝1 100(bp)。为确保M及连接处序列正确，Y－M的连接处上游含有Hind Ⅲ＋EcoR Ⅴ的识别序列，下游含有EcoR Ⅴ＋BamH Ⅰ的识别序列，根据题干信息构建Y－M重组质粒(在EcoR Ⅴ位点插入片段)，Y－M的连接处测序后部分序列可含有EcoR Ⅴ＋BamH Ⅰ的识别位点，根据各限制酶识别位点，应选择序列Q4。对照质粒Y－GFP(仅表达GFP)与实验质粒Y－M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明蛋白质X参与中心体的组成。
2．(1)模板、引物　引物的设计　(2)CD　(3)限制酶、DNA连接酶　(4)ABC　(5)P3、P4　(6)电泳只能测大小(长度)，不知道具体序列
解析　(1)PCR反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液(其中需要Mg2＋)。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时， 配制的两个反应体系中不同的有模板(片段F1、片段F2)、引物。PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3′端通过碱基互补配对结合。引物设计是决定PCR反应成败的最重要因素，因此扩增程序中最主要的不同是引物的设计。(2)引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始延伸DNA链，因此引物与模板链3′端互补，与5′端的碱基序列相同。由图1可知，引物F2－F的部分序列既能与F1片段(EGFP)的后部分5′端序列相同，又能与F2片段(Anb1)的前部分5′端序列相同，C选项中5′—GACGAG—3′在EGFP基因中存在，5′—CTGCAG—3′在AnB1基因中存在，因此引物F2－F选用C。由图1可知，引物F1－R与引物F2－F碱基是互补的，应选用D。(3)传统重组质粒构建需要使用限制性内切核酸酶(限制酶)切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶的作用下可形成环化质粒，不需要使用限制性内切核酸酶(限制酶)和DNA连接酶。(4)用稀释涂布平板法培养计数时，为了使结果更准确，一般选择菌落数为30～300的平板，A错误；涂布平板时，培养基已凝固，不会烫死细菌，抗性平板上未长出菌落，最常见的原因是未能有效实现重组质粒构建，或未能进行有效转化，B错误；转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落，故不会出现大量杂菌形成的菌落，C错误；稀释涂布平板法和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，用稀释涂布平板法在抗性平板上长出的单菌落不需要进一步划线纯化，D正确。(5)EGFP为720 bp，AnB1为390 bp，二者的总长度为720 bp＋390 bp＝1 100 bp，用引物F1－F和F2－R进行了PCR扩增，其长度接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。(6)琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列，因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。
3．(1)能与P基因母链的一段碱基序列配对、短单链核酸　5′端　(2)P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取　在引物中的EcoRⅠ识别序列3′端添加1个碱基　(3)增强FLAG－P与UBC的结合　参与P与UBC的结合　(4)药物A通过增强P与UBC结合促进P降解
解析　(1)DNA聚合酶延伸时，是将脱氧核苷酸加到引物的3′端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5′端。(2)融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同，说明P基因翻译时出错。由图可看出，在转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变，可通过在EcoRⅠ识别序列前后增加碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数，这样能保证P基因转录出的mRNA上的读码框不改变，能够正常翻译。(3)①组仅添加UBC，处理后，用UBC抗体检测，不出现杂交带；②组添加UBC和FLAG－P，出现杂交带；③组添加UBC、药物A和FLAG－P，杂交带更加明显，说明药物A的作用是促进UBC与FLAG－P的结合。②④组或③⑤组的差异在于②③组使用FLAG－P，出现杂交带，④⑤组使用FLAG－PΔ，不出现杂交带，据此推测PΔ中缺失的特定序列是与UBC结合的关键序列。(4)根据(3)的分析推测，药物A促进UBC与FLAG－P的结合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到治疗的目的。
模拟预测
1．(1)5′→3′　黏性末端　防止过度水解DNA　(2)过程①形成的黏性末端长度不同　DNA聚合酶和DNA连接酶
(3)ABC　(4)PABD基因一端的核苷酸序列和载体一端的核苷酸序列　1、4　(5)草胺膦　抗草胺膦∶不抗草胺膦＝3∶1　(6)绿色荧光点的分布
解析　(1)由图可知，无缝克隆时，过程①中T5核酸外切酶沿5′→3′的方向水解DNA，以形成黏性末端。温度能影响酶活性，T5核酸外切酶催化的最适温度为37 ℃，而过程①选择的温度为50 ℃，其目的是降低酶活性，防止过度水解DNA。(2)过程②在复性的过程中，两个片段的黏性末端可根据互补序列进行配对结合，但由于过程①形成的黏性末端长度不同，因此在过程②复性后存在“缺口”。过程③缺口处DNA链的补齐可以看作DNA分子的复制过程，所需的酶有DNA聚合酶(DNA聚合酶将单个脱氧核苷酸加到子链3′端)和DNA连接酶(将两个DNA片段进行连接)。(3)传统的酶切再连法需要用特定的限制酶将目的基因和质粒先进行切割，再用DNA连接酶对目的基因和质粒进行连接，在该过程会形成多个小片段，操作复杂，而无缝克隆技术构建重组质粒不受限制酶酶切位点的限制；不会引入多余碱基；操作时间短，成功率高，但不利于多个小片段(小于50 bp)连接，A、B、C正确。(4)用于PCR扩增的引物是根据一段已知目的基因(PABD基因)的核苷酸序列来设计的，由图可知，PABD基因需要用载体进行连接，因此PCR扩增PABD基因时需依据PABD基因一端的核苷酸序列和载体一端的核苷酸序列设计引物R1。由重组DNA图可知，GFP基因和PABD基因进行连接，PCR扩增GFP基因时需根据GFP基因一端的核苷酸序列和PABD基因一端的核苷酸序列设计引物R2，而设计引物F1仅需根据PABD基因一端的核苷酸序列，因此引物F1的碱基序列比引物R2的碱基序列短，因此扩增目的片段的引物F1对应于表中的1。PCR扩增GFP基因时需根据GFP基因一端的核苷酸序列和PABD基因一端的核苷酸序列设计引物R2，即引物R2的一部分能与引物F1进行碱基互补配对，综上所述，R2对应于表中的4。(5)由图可知，bar(草胺膦抗性基因)为标记基因，位于T－DNA上，农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，因此利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子(T1)进行表面消毒，均匀铺在含有草胺膦的MS培养基上进行筛选和鉴定。若T1为单位点插入的转基因株系，假设抗性基因用A表示，非抗性基因为a，则T1的基因型为Aa，T1自交获得的T2幼苗的基因型及比例为A_∶aa＝3∶1，因此抗草胺膦∶不抗草胺膦＝3∶1。(6)由题意“将高度专一的PA结合蛋白(PABD)基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量”可知，通过观测转基因拟南芥根尖细胞中绿色荧光点的分布，了解PA的动态变化。
2．(1)与模板DNA单链互补配对，并且使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸　BamHⅠ　XboⅠ　5′GGATCCATGAGC3′　(2)DNA连接　限制酶2识别序列后面的一个碱基A与His标签基因编码链的前两个碱基CA编码一个氨基酸，导致His标签基因对应的mRNA的密码子被错位读取　在5′CTCGAG3′和5′GAACTG3′之间任意增加2个碱基　(3)TAT－RTA－ODD　含有氧依赖性降解区域ODD(多肽)的融合蛋白可以适应肿瘤内部低氧条件稳定存在，从而更好地抑制肿瘤体积增长
解析　(1)PCR中，引物与模板DNA单链互补配对实现连接，并且使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。据图1可知，TAT－RTA融合基因TAT靠近启动子一侧有BamH Ⅰ的识别位点，RTA靠近终止子一侧有Xbo Ⅰ的识别位点，则引物1的5′端加入BamH Ⅰ的酶切位点，引物2的5′端加入XboⅠ的酶切位点。TAT基因编码链序列为5′ATGAGCTACGGCCGTAAAAAGAGACGCCAACGTAGA3′，由于其5′端需要插入BamHⅠ的识别位点，根据碱基互补配对原则可知，其对应的引物的5′端应包含BamHⅠ的识别序列，故设计为5′GGATCCATGAGC3′，以便BamHⅠ切出相应的黏性末端。(2)切割后的DNA片段需要用DNA连接酶连接成完整DNA分子。由图2可知，限制酶2识别序列与His标签序列之间多出一个碱基A，这一个碱基A与His标签基因编码链的前两个碱基CA编码一个氨基酸，导致His标签基因对应的mRNA的密码子被错位读取，导致不能正确编码出His标签蛋白，所以可在引物2 5′CTCGAG3′和5′GAACTG3′之间任意添加两个碱基。(3)由图3可知，较对照组而言，TAT－RTA和TAT－RTA－ODD组的荷瘤小鼠肿瘤体积较小，且TAT－RTA－ODD组的荷瘤小鼠肿瘤体积最小，说明TAT－RTA和TAT－RTA－ODD均能抑制肿瘤体积增大，其中后者抑制效果更显著。产生该实验结果的原因是TAT将融合蛋白转运进入肿瘤细胞，RTA可作用于核糖体，使蛋白合成受阻，从而引起细胞死亡，而ODD可以适应低氧条件稳定存在，实体肿瘤内部通常是缺氧的环境，所以ODD可以在肿瘤细胞中正常发挥作用，更好地抑制肿瘤体积增长，使抗肿瘤效果更加显著。
3．(1)氮源　平板划线法或稀释涂布平板　(2)①抗原－抗体　缺乏组氨酸　X蛋白与Y蛋白存在相互作用　②X蛋白具有激活启动子转录的活性(或X蛋白具有激活启动子转录的功能或X蛋白具有AD蛋白的功能)
解析　(1)根据微生物对营养物质的需求可知用于培养酵母菌的培养基一般需要添加水、碳源、氮源和无机盐等营养物质。最常用的微生物分离纯化方法包括平板划线法与稀释涂布平板法，用平板划线法和稀释涂布平板法能将单个微生物分散在固体培养基上，之后经培养得到的单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。(2)为了检测酵母细胞是否产生了M蛋白，可以采用抗原－抗体杂交的方法，大致思路为先利用M蛋白制备相应的抗体，再从酵母细胞中提取蛋白质，然后进行抗原－抗体杂交，若出现杂交现象，则说明酵母细胞产生了M蛋白。酵母菌只有在AD和BD同时存在且结合在一起时才能保证基因M的转录，才能在缺乏组氨酸的培养基上生长，故若含有两个载体的酵母细胞能在缺乏组氨酸的培养基上生长，则可说明酵母细胞同时存在AD和BD，且X蛋白与Y蛋白结合在一起。酵母双杂交可以检测X蛋白与Y蛋白是否存在相互作用，通过X蛋白与Y蛋白的相互作用使BD与AD可以结合在一起，但若X蛋白本身具有激活启动子转录的活性(或X蛋白具有激活启动子转录的功能或X蛋白具有AD蛋白的功能等)，则即使X蛋白与Y蛋白没有相互作用也可能出现假阳性的结果。(共46张PPT)
专题八　
第6练
融合基因、融合蛋白、蛋白质相互作用
1.(2022·江苏，24节选)纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题：
(1)纤毛结构如图Ⅰ所示，由细胞膜延伸形成的纤
真题演练
PART ONE
毛膜主要由______________组成。基体由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能是________________________。
磷脂、蛋白质
发出星射线，形成纺锤体
(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，
溶液中添加NaCl至2.0 mol/L的目的是__________。
PCR扩增时，需在________________________催化下，在引物_____端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。
溶解DNA
耐高温DNA聚合酶(Taq酶)
3′
实验过程中添加NaCl至2.0 mol/L的目的是溶解DNA。PCR扩增时，需在DNA聚合酶(即Taq酶)的催化下，在引物的3′端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。
从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，DNA在2.0 mol/L的NaCl溶液中的溶解度最大，高于或低于这一浓度，DNA的溶解度均会下降，因此
(3)为研究蛋白质X在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，可示其在细胞内位置。将X－GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y，构建Y－M重组质粒(在EcoR V位点插入片段)。请完成下表。
分步实验目标 简易操作、结果、分析
PCR鉴定正向重组质粒Y－M(图Ⅱ中融合片段M中有白色的箭头，代表方向) ①选择图Ⅱ引物_______；
②PCR目的产物约为______bp
确保M及连接处序列正确，Y－M的连接处上游含有Hind Ⅲ＋EcoR V的识别序列，下游含有EcoR V＋BamH Ⅰ的识别序列 ③质粒测序，图Ⅲ中正确的是_____
(选填序列编号)
a、b
1 100
Q4
分步实验目标 简易操作、结果、分析
检测融合蛋白定位 ④对照质粒Y－GFP(仅表达GFP)与实验质粒Y－M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明_________________________
X蛋白参与中心体的形成
列，下游含有EcoR V＋BamH Ⅰ的识别序列，根据题干信息构建Y－M重组质粒(在EcoR V位点插入片段)，Y－M的连接处测序后部分序列可含有EcoR V＋BamH Ⅰ的识别位点，根据各限制酶识别位点，应选择序列Q4。对照质粒Y－GFP(仅表达GFP)与实验质粒Y－M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明蛋白质X参与中心体的组成。
PCR扩增目的DNA片段时，在引物的3′端进行DNA链的延伸，据图可知，应选择图Ⅱ中的引物a和引物b，PCR目的产物约为300＋800＝1 100(bp)。为确保M及连接处序列正确，Y－M的连接处上游含有Hind Ⅲ＋EcoR V的识别序
2.(2023·江苏，22)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：
(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有____________，扩增程序中最主要的不同是____________。
模板、引物
引物的设计
PCR反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液(其中需要Mg2＋)。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时， 配制的两个反应体系中不同的有模板(片段F1、片段F2)、引物。PCR过程需
要两种引物，能分别与目的基因两条链的3′端通过碱基互补配对结合。引物设计是决定PCR反应成败的最重要因素，因此扩增程序中最主要的不同是引物的设计。
(2)有关基因序列如图2。引物F2－F、F1－R应在下列选项中选用_____。
A.ATGGTG——CAACCA B.TGGTTG——CACCAT
C.GACGAG——CTGCAG D.CTGCAG——CTCGTC
EGFP基因序列：5′ATGGTGAGCAAGGGC——GACGAGCTGTACAAG3′
AnB1基因序列：5′CATGTCCAGCTGCAG——CCAAAACCACAACCA3′
图2
CD
引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始延伸DNA链，因此引物与模板链3′端互补，与5′端的碱基序列相同。由图1可知，引物F2－F的部分序列既能与F1片段(EGFP)的后部
分5′端序列相同，又能与F2片段(Anb1)的前部分5′端序列相同，C选项中5′—GACGAG—3′在EGFP基因中存在，5′—CTGCAG—3′在AnB1基因中存在，因此引物F2－F选用C。由图1可知，引物F1－R与引物F2－F碱基是互补的，应选用D。
(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，不需要使用的酶主要有____________________。
限制酶、DNA连接酶
传统重组质粒构建需要使用限制性内切核酸酶(限制酶)切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶的作用下可形成环化质粒，不需要使用限制性内切核酸酶(限制酶)和DNA连接酶。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_______。
A.稀释涂布平板需控制每个平板30～300个菌落
B.抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C.抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D.抗性平板上长出的单菌落不需要进一步划线纯化
ABC
用稀释涂布平板法培养计数时，为了使结果更准确，一般选择菌落数为30～300的平板，A错误；
涂布平板时，培养基已凝固，不会烫死细菌，抗性平板上未长出菌落，最常见的原因是未能有效实现重组质粒构建，或未能进行有效转化，B错误；
转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落，故不会出现大量杂菌形成的菌落，C错误；
稀释涂布平板法和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，用稀释涂布平板法在抗性平板上长出的单菌落不需要进一步划线纯化，D正确。
(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板、用引物F1－F和F2－R进行了PCR扩增，质粒P1～P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有________。
P3、P4
EGFP为720 bp，AnB1为390 bp，二者的总长度为720 bp＋390 bp＝
1 100 bp，用引物F1－F和F2－R进行了PCR扩增，其长度接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。
(6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是______________________________________。
电泳只能测大小(长度)，不知道具体序列
琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列，因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。
3.(2022·山东，25)某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG－P和FLAG－PΔ。PΔ是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或PΔ的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或PΔ的功能。
(1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是_____________________________________________。
为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的_______(填“3′端”或“5′端”)。
能与P基因母链的一段碱基序列配对、短单链核酸
5′端
DNA聚合酶延伸时，是将脱氧核苷酸加到引物的3′端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5′端。
(2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。
据图甲分析，出现该问题的原因是______________________________________________________________________________________________________________。
修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是___________________________________________。
P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取
在引物中的EcoRⅠ识别序列3′端添加1个碱基
融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同，说明P基因翻译时出错。由图可看出，在
转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变，可通过在EcoRⅠ识别序列前后增加碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数，这样能保证P基因转录出的mRNA上的读码框不改变，能够正常翻译。
(3)融合蛋白表达成功后，将FLAG－P、FLAG－PΔ、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG－P和FLAG－PΔ不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是__________________________；由②④组或③⑤组的差异推测，PΔ中缺失的特定序列的作用是___________________。
增强FLAG－P与UBC的结合
参与P与UBC的结合
①组仅添加UBC，处理后，用UBC抗体检测，不出现杂交带；②组添加UBC和FLAG－P，出现杂交带；③组添加UBC、药物A和FLAG－P，杂交带更加明显，说明药物A的作用是促进UBC与FLAG－P的结合。②④组或③⑤组的差异在于②③组使用FLAG－P，出现杂交带，④⑤组使用FLAG－PΔ，不出现杂交带，据此推测PΔ中缺失的特定序列是与UBC结合的关键序列。
(4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是____________________
___________________。
药物A通过增强P与
根据(3)的分析推测，药物A促进UBC与FLAG－P的结合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到治疗的目的。
UBC结合促进P降解
1.(2024·南通高三二模)磷脂酸(PA)是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA的动态变化，研究人员用无缝克隆技术将高度专一的PA结合蛋白(PABD)基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量。无缝克隆技术连接DNA片段的机理和构建荧光探针表达载体过程如图所示，请回答下列问题：
模拟预测
PART TWO
(1)无缝克隆时，T5核酸外切酶沿________的方向水解DNA，其目的是形成_________。T5核酸外切酶催化的最适温度为37 ℃，而过程①选择的温度为50 ℃，目的是降低酶活性，______
______________。
5′→3′
黏性末端
防止
由图可知，无缝克隆时，过程①中T5核酸外切酶沿5′→3′的方向水解DNA，以形成黏性末端。温度能影响酶活性，T5核酸外切酶催化的最适温度为37 ℃，而过程①选择的温度为50 ℃，其目的是降低酶活性，防止过度水解DNA。
过度水解DNA
(2)过程②两个片段复性后存在“缺口”的原因是______________________________，过程③所需的酶有______________________
______。
过程①形成的黏性末端长度不同
DNA聚合酶和DNA连接酶　
过程②在复性的过程中，两个片段的黏性末端可根据互补序列进行配对结合，但由于过程①形成的黏性末端长度不同，因此在过程②复性后存在“缺口”。过程③缺口处DNA链的补齐可以看作DNA分子的复制过程，所需的酶有DNA聚合酶(DNA聚合酶将单个脱氧核苷酸加到子链3′端)和DNA连接酶(将两个DNA片段进行连接)。
(3)(多选)与传统的酶切再连法相比，无缝克隆技术构建重组质粒的优点有_______。
A.不受限制酶酶切位点的限制
B.不会引入多余碱基
C.操作时间短，成功率高
D.有利于多个小片段(小于50 bp)连接
ABC
传统的酶切再连法需要用特定的限制酶将目的基因和质粒先进行切割，再用DNA连接酶对目的基因和质粒进行连接，在该过程会形成多个小片段，操作复杂，而无缝克隆技术构建重组质粒不受限制酶酶切位点的限制；不会引入多余碱基；操作时间短，成功率高，但不利于多个小片段(小于50 bp)连接，A、B、C正确。
(4)PCR扩增PABD基因时需依据____________________________________
_______________设计引物R1。据图分析扩增目的片段的引物F1和R2对应于下表中的_______。
1 5′－TCCGGACTCAGATCTCGAGC－3′
2 5′－AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTAACTAGTCTTAGTGGCGTC－3′
3 5′－TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATGGTGAGCAAGGGCGA－3′
4 5′－GCTCGAGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCA－3′
PABD基因一端的核苷酸序列和载体一端的核苷酸序列
1、4
用于PCR扩增的引物是根据一段已知目的基因(PABD基因)的核苷酸序列来设计的，由图可知，PABD基因需要用载体进行连接，因此PCR扩增PABD基因时需依据PABD基因一端的核苷酸序列和载体一端的核苷酸序列设计引物R1。由重组DNA图可知，GFP基因和PABD基因进行连接，PCR扩增GFP基因时需根据GFP基因一端的核苷酸序列和PABD基因一端的核苷酸序列设计引物R2，而设计引物F1仅需根据PABD基因一端的核苷酸序列，因此引物F1的碱基序列比引物R2的碱基序列短，因此扩增目的片段的引物F1对应于表中的1。PCR扩增GFP基因时需根据GFP基因一端的核苷酸序列和PABD基因一端的核苷酸序列设计引物R2，即引物R2的一部分能与引物F1进行碱基互补配对，综上所述，R2对应于表中的4。
(5)利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子(T1)进行表面消毒，均匀铺在含有________的MS培养基上进行筛选和鉴定。T1代自交获得的T2代幼苗的抗性表现和比例为____________________________，说明T1为单位点插入的转基因株系。
草胺膦
抗草胺膦∶不抗草胺膦＝3∶1
由图可知，bar(草胺膦抗性基因)为标记基因，位于T－DNA上，农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，因此利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子(T1)进行表面消毒，均匀铺在含有草胺膦的MS培养基上进行筛选和鉴定。若T1为单位点插入的转基因株系，假设抗性基因用A表示，非抗性基因为a，则T1的基因型为Aa，T1自交获得的T2幼苗的基因型及比例为A_∶aa＝3∶1，因此抗草胺膦∶不抗草胺膦＝3∶1。
(6)通过观测转基因拟南芥根尖细胞中__________________，了解PA的动态变化。
绿色荧光点的分布
由题意“将高度专一的PA结合蛋白(PABD)基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量”可知，通过观测转基因拟南芥根尖细胞中绿色荧光点的分布，了解PA的动态变化。
2.研究发现，实体肿瘤内部通常是缺氧的环境，蓖麻毒素蛋白(RTA)可作用于核糖体，使蛋白合成受阻，从而引起细胞死亡。TAT是一种短肽，可转导蛋白进入细胞，含有氧依赖性降解区域ODD(多肽)的融合蛋白可以适应低氧条件稳定存在，但在常氧条件下会被蛋白酶降解。科研人员以RTA作为抑制肿瘤细胞增殖的活性分子，利用TAT的作用将融合蛋白转运进入肿瘤细胞，并利用ODD的作用减轻RTA对正常细胞的毒性，分别构建了含TAT－RTA(660 bp)和TAT－RTA－ODD(870 bp)融合基因的表达载体，并成功得到相关融合蛋白。回答下列问题：
(1)可采用PCR的方法获取融合基因TAT－RTA，需要根据TAT和RTA基因设计引物，引物的作用是_________________________________________
_______________________________________。
与模板DNA单链互补配对，并且使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
已知RTA基因和欲得到的TAT－RTA融合基因的结构如图1所示，TAT基因编码链序列为5′ATGAGCTACGGCCGTAAAAAGAGACGCCAACGTAGA3′，为顺利构建表达载体，需要在引物1的5′端加入__________酶切
位点，引物2的5′端加入________酶切位点，利用TAT和RTA核酸序列设计引物时，要求在RTA蛋白的前端引入TAT短肽，请根据要求写出引物1的部分碱基序列_______________________(写出引物5′→3′端的12个碱基即可)。
BamHⅠ
XboⅠ
5′GGATCCATGAGC3′
终止子一侧有Xbo Ⅰ的识别位点，则引物1的5′端加入BamH Ⅰ的酶切位点，引物2的5′端加入XboⅠ的酶切位点。TAT基因编码链序列为5′ATGAGCTACGGCCGTAAAAAGAGACGCCAACGTAGA3′，由于其5′端需要插入BamHⅠ的识别位点，根据碱基互补配对原则可知，其对应的引物的5′端应包含BamHⅠ的识别序列，故设计为5′GGATCCATGAGC3′，以便BamHⅠ切出相应的黏性末端。
PCR中，引物与模板DNA单链互补配对实现连接，并且使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。据图1可知，TAT－RTA融合基因TAT靠近启动子一侧有BamH Ⅰ的识别位点，RTA靠近
(2)载体的部分结构如图2所示。His标签由连续的6个组氨酸构成，可用于对重组融合蛋白进行分离纯化，将PCR得到的TAT－RTA融合基因和载体双酶切后，再用
__________酶连接，但是在研究时，发现融合蛋白中没有His标签蛋白，据图分析，原因是________________________________________________________
_________________________________________________________________________，结合图1和图2可对引物2序列5′CTCGAGGAACTG……3′进行_____________________________________________________的设计可使His标签正常表达。
DNA连接
限制酶2识别序列后面的一个碱基A与His标签基因编码链的前两个碱基CA编码一个氨基酸，导致His标签基因对应的mRNA的密码子被错位读取
在5′CTCGAG3′和5′GAACTG3′之间任意增加2个碱基
碱基A与His标签基因编码链的前两个碱基CA编码一个氨基酸，导致His标签基因对应的mRNA的密码子被错位读取，导致不能正确编码出His标签蛋白，所以可在引物2 5′CTCGAG3′和5′GAACTG3′之间任意添加两个碱基。
切割后的DNA片段需要用DNA连接酶连接成完整DNA分子。由图2可知，限制酶2识别序列与His标签序列之间多出一个碱基A，这一个
(3)科研人员将得到的重组融合蛋白经腹腔给药荷瘤小鼠(患实体肿瘤的小鼠称为荷瘤小鼠)，研究荷瘤小鼠肿瘤体积变化，结果如图3所示。TAT－RTA和TAT－RTA－ODD融合蛋白都可以抑制荷瘤小鼠肿瘤体积的增长，____________________的抑制效果更好，产生该实验结果的原因是_______________________________________________________________
__________________________________________。
TAT－RTA－ODD
含有氧依赖性降解区域ODD(多肽)的融合蛋白可以适应肿瘤内部低氧条件稳定存在，从而更好地抑制肿瘤体积增长
制效果更显著。产生该实验结果的原因是TAT将融合蛋白转运进入肿瘤细胞，RTA可作用于核糖体，使蛋白合成受阻，从而引起细胞死亡，而ODD可以适应低氧条件稳定存在，实体肿瘤内部通常是缺氧的环境，所以ODD可以在肿瘤细胞中正常发挥作用，更好地抑制肿瘤体积增长，使抗肿瘤效果更加显著。
由图3可知，较对照组而言，TAT－RTA和TAT－RTA－ODD组的荷瘤小鼠肿瘤体积较小，且TAT－RTA－ODD组的荷瘤小鼠肿瘤体积最小，说明TAT－RTA和TAT－RTA－ODD均能抑制肿瘤体积增大，其中后者抑
3.酵母菌的转录因子蛋白由BD和AD两部分组成且结合在一起。BD负责与启动子上游序列结合，AD负责激活启动子转录。只有AD和BD同时存在且结合在一起时才能保证基因M的转录(如图所示)。基因M能表达时，酵母菌才能在缺乏组氨酸的培养基上生长。回答下列问题：
(1)酵母菌培养基一般都含有水、碳源、______和无机盐等营养物质，在酵母菌的纯培养过程中，采用__________________________法能将单个微生物分散在固体培养基上。
氮源
平板划线法或稀释涂布平板
根据微生物对营养物质的需求可知用于培养酵母菌的培养基一般需要添加水、碳源、氮源和无机盐等营养物质。最常用的微生物分离纯化方法包括平板划线法与稀释涂布平板法，用平板划线法和稀释涂布平板法能将单个微生物分散在固体培养基上，之后经培养得到的单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。
(2)将BD与AD分开，BD基因与X基因共连一个载体，可表达出BD－X融合蛋白；AD
基因与Y基因共连一个载体，可表达出AD－Y融合蛋白。将两个载体同时导入一个酵母细胞中，可以检测X蛋白与Y蛋白是否存在相互作用(即是否可以结合)，这种检测方法称为酵母双杂交。
①从酵母细胞中提取蛋白质，进行____________杂交，以检测是否产生M蛋白。若将酵母菌培养在___________培养基中，酵母菌仍然可以生长，则说明_____
_______________________。
②在酵母双杂交的检测中可能出现假阳性的结果，原因是__________________
__________________________________________________________________________。
抗原－抗体
缺乏组氨酸
X蛋
X蛋白具有激活启动子转录的活性(或X蛋白具有激活启动子转录的功能或X蛋白具有AD蛋白的功能)
白与Y蛋白存在相互作用
细胞中提取蛋白质，然后进行抗原－抗体杂交，若出现杂交现象，则说明酵母细胞产生了M蛋白。酵母菌只有在AD和BD同时存在且结合在一起时才能保证基因M的转录，才能在缺乏组氨酸的培养基上生长，故若含有两个载体的酵母细胞能在缺乏组氨酸的培养基上生长，则可说明酵母细胞同时存在AD和BD，且X蛋白与Y蛋白结合在一起。酵母双杂交可以检测X蛋白与Y蛋白是否存在相互作用，通过X蛋白与Y蛋白的相互作用使BD与AD可以结合在一起，但若X蛋白本身具有激活启动子转录的活性(或X蛋白具有激活启动子转录的功能或X蛋白具有AD蛋白的功能等)，则即使X蛋白与Y蛋白没有相互作用也可能出现假阳性的结果。
为了检测酵母细胞是否产生了M蛋白，可以采用抗原－抗体杂交的方法，大致思路为先利用M蛋白制备相应的抗体，再从酵母第7练　基因编辑原理、过程及应用 (重点突破)
1．(9分)(2024·新课标，35节选)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5′→3′方向。回答下列问题：
(1)(5分)限制酶切割的化学键是________________。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)(2分)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G－C和____________________。
(3)(2分)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是____________________。
2．(10分)(2021·海南，25节选)CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA(SgRNA)引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。回答下列问题：
(1)(1分)过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定SgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是____________。
(2)(2分)过程③～⑤中，SgRNA与Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是__________。随后，Cas9蛋白可切割__________序列。
(3)(3分)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1 200 bp的基因，在DNA水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是________________，基因敲除成功的判断依据是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)(4分)某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒，随后将其导入到大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入到基因组DNA的编辑过程：________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
3．(每空2分，共12分)(2022·重庆，24节选)科学家用基因编辑技术由野生型番茄(HH)获得突变体番茄(hh)，发现突变体中DML2基因的表达发生改变，进而影响乙烯合成相关基因ACS2等的表达及果实中乙烯含量(如图Ⅰ、Ⅱ)，导致番茄果实成熟期改变。请回答以下问题：
(1)图Ⅰ中，基因h是由基因H编码区第146位碱基后插入一个C(虚线框所示)后突变产生，致使h蛋白比H蛋白少93个氨基酸，其原因是__________________________。基因h转录形成的mRNA上第49个密码子为____________。另有研究发现，基因H发生另一突变后，其转录形成的mRNA上有一密码子发生改变，但翻译的多肽链氨基酸序列和数量不变，原因是________________________________________________________________________。
(2)图Ⅱ中，t1～t2时段，突变体番茄中DML2基因转录的mRNA相对量低于野生型，推测在该时间段，H蛋白对DML2基因的作用是________________________。突变体番茄果实成熟期改变的可能机制为：H突变为h后，由于DML2基因的作用，果实中ACS2基因____________，导致果实成熟期____________(填“提前”或“延迟”)。
4．(每空1分，共3分)(2019·江苏，29节选)利用基因编辑技术将病毒外壳蛋白基因导入猪细胞中，然后通过核移植技术培育基因编辑猪，可用于生产基因工程疫苗。如图为基因编辑猪培育流程，请回答下列问题：
(1)为获得更多基因编辑猪，可在胚胎移植前对胚胎进行________。产出的基因编辑猪的性染色体来自______号猪。
(2)为检测病毒外壳蛋白基因是否被导入4号猪并正常表达，可采用的方法有______(填序号)。
①DNA测序　②染色体倍性分析　③体细胞结构分析　④抗原—抗体杂交
5．(每空1分，共9分)(2020·山东，25)水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因(Wx基因)启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。
(1)将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需的酶是________________________________________________________________________
____________，重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为________。
(2)根据启动子的作用推测，Wx基因启动子序列的改变影响了__________________________，从而改变了 Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列__________(填“发生”或“不发生”)改变，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)为检测启动子变化对Wx基因表达的影响，科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA (Wx mRNA)的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经____________过程获得总cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出 Wx基因的cDNA，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)各品系Wx mRNA量的检测结果如图所示，据图推测糯性最强的品系为________，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
1．(10分)(2024·汕头高三二模)转基因技术的研发是加快农业现代化的重要途径，但转基因食品的安全性备受关注。研究者将水稻抗虫基因(crylC)和双T－DNA载体连接(图示为连接后双T－DNA部分结构)，利用其中的“Cre/LoxP”系统培育了安全可食用的转基因水稻。在“Cre/LoxP”系统中，Cre基因编码的Cre酶可特异性识别同一DNA两个同向的LoxP序列并将两个LoxP间的序列删除。
注：P－启动子：P1为胚乳特异性表达启动子；P2为绿色组织特异性表达启动子。
回答下列问题：
(1)(1分)Cre酶与基因工程中的________________(工具酶)作用类似。
(2)(2分)载体中T－DNA的作用是转移外源基因到被侵染的细胞后__________________，hpt基因(潮霉素抗性基因)和gus基因(表达产物使无色底物显蓝色)有助于双T－DNA共转化植株的筛选，起到基因表达载体中____________(填结构)的作用。
(3)(4分)筛选得到双T－DNA共转化成功的植株T0中，hpt基因对植物和环境具有潜在的危害，需设法将其删除。先从T0植株中筛选T－DNA1和T－DNA2都是单拷贝(单个)插入的植株GH－1、GH－2和GH－3，自交后得到T1代植株进行潮霉素抗性检测，选择抗性检测为阴性植株的叶片的gus基因进行PCR检测，产物的电泳结果如图a(不考虑减数分裂时发生互换)。
①T0代中______(填编号)是T－DNA1和T－DNA2以连锁形式在单一位点插入植株。
②在图b中画出植株GH－2的T－DNA1和T－DNA2在染色体上的位置(注：用“·”表示T－DNA1和T－DNA2在染色体上的位置)。
③GH－1的T0代自交的后代T1植株中，具有抗虫特性但不含hpt基因的植株的比例为__________。这些植株自交后筛选即可获得稳定遗传的种子Tx。
(4)(3分)水稻种子主要包括胚和胚乳，其中胚乳被加工成精米食用。该“Cre/LoxP”系统，实现了____________________，培育了安全可食用的转基因水稻。Tx种子播种后获得的叶片__________(填“具有”或“不具有”)抗虫的性状。
2．(12分)(2024·安徽高三三模)“脑彩虹”是一项最新的大脑成像技术，通过荧光蛋白“点亮”大脑内的神经元，帮助科学家了解大脑。Cre－LoxP系统能够实现特定基因的敲除，其技术过程如图1所示。
(1)(2分)当两个LoxP序列位于同一个DNA分子上且方向相同时，Cre重组酶能将两个切割位点之间的核苷酸序列切除并形成环状而失活，剩余序列会连接起来。在特定基因的敲除过程中，若两个LoxP序列方向相反时，Cre重组酶使两个LoxP间的序列颠倒，由此产生的变异本质上属于____________________。
(2)(2分)图1中LoxP序列的方向取决于序号________对应的区域。一个LoxP序列的内部被Cre酶切割后，将在DNA序列的________(填“5′”或“3′”)端形成游离的磷酸基团。
(3)(2分)科学家以小鼠为材料，将三种荧光蛋白基因、两种LoxP序列与脑组织特异表达启动子M相连接，构建图2所示的基因表达载体，再用________法将该基因表达载体导入小鼠的受精卵中，进而得到仅含一个图2所示片段的转基因小鼠，再经过进一步操作，获得纯合的转基因小鼠a(不含Cre酶)。
(4)(6分)图2所示序列的两个LoxP1之间或两个LoxP2之间的基因，只会被Cre酶识别并切割一次。为使脑组织细胞中Cre酶的表达受调控，研究者将Cre酶基因与启动子N(由信号分子X开启)连接，经一系列操作，获得纯合转基因小鼠b，将纯合小鼠a和b杂交，得到F1。
a．若无X作用时，该小鼠脑组织的色彩为________色，其他组织细胞颜色为______色。
b．若有X作用时，该小鼠脑组织会出现“脑彩虹”，请阐述机理：____________________
________________________________________________________________________。
3．(10分)CRISPR/Cas9基因编辑技术可以按照人们的意愿精准剪切、改变任意靶基因的遗传信息，从而达到基因定点敲除、插入、突变的目的。在该基因编辑技术中，SgRNA是根据靶基因设计的引导RNA，准确引导Cas9切割与SgRNA配对的靶基因DNA序列。请回答下列问题：
(1)(2分)Cas9准确切割与SgRNA配对的靶基因DNA序列的过程体现了酶具有__________性；该过程依赖于SgRNA与靶基因DNA序列之间的__________。
(2)(3分)SgRNA是人工合成的一段能与靶基因互补配对的特殊序列，由23个连续的碱基组成。研究发现，SgRNA有时会出现脱靶问题，试分析其原因可能是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________；
解决措施是____________________________________________________。
(3)(2分)为了实现某基因的特异性敲除，如图1所示，科研人员将含有3个不同的但靶向相同基因的SgRNA编码基因的重组质粒组装到具有特殊元件的载体上，形成新的重组质粒。
理论上，一个SgRNA便能实现靶基因的敲除，请分析构建图1所示重组质粒的优势：________________________________________________________________________
__________________________________________________________(答出2点)。
(4)(3分)为筛选特定D基因“敲除”的果蝇，在D基因的DNA断裂位点插入绿色荧光蛋白基因(EGFP)需构建携带绿色荧光蛋白基因的供体质粒。把EGFP基因和His标签基因(His标签由6个组氨酸组成)连接起来构建融合基因并构建重组质粒，图2为载体、EGFP基因的结构、不同限制酶的识别序列及切割位点，欲将标签基因连接在绿色荧光蛋白基因(EGFP)编码区的首端，已知组氨酸的密码子为CAU，起始密码子为AUG。
①写出His基因模板链的碱基序列：5′－_______________________________________
________________________________________________________________________－3′。
②为构建融合基因并将其插入载体，科研人员设计了一对与EGFP基因编码区两端序列互补配对的引物，设计时需在引物______(填“A”或“B”)的5′端增加相应的限制酶识别序列和His基因的编码序列，请写出该引物开头的12个碱基序列：5′－_______________－3′。
答案精析
真题演练
1．(1)磷酸二酯键　使M1与M2之间有启动子、N基因、终止子，确保N基因能够顺利表达　(2)C－G、A－T、U－A　(3)菌株B2基因组DNA
2．(1)DNA连接酶　(2)碱基互补配对　目标(目的)DNA(基因)　(3)DNA分子杂交技术　经编辑过的DNA片段(从受体细胞中提取的基因组DNA)与标记的目标(对应)基因(探针)杂交，若无杂交带，则敲除成功
(4)CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，表达产物Cas9蛋白和转录产物SgRNA，两者形成复合体；SgRNA识别并结合目标DNA序列，引导Cas9蛋白进行切割；从而将目的基因插入基因组DNA中
解析　(1)基因工程所需的工具酶有限制酶和DNA连接酶，限制酶负责切割，DNA连接酶负责连接，因此为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定SgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是DNA连接酶。(2)根据题图可知：在CRISPR/Cas9基因编辑技术中，SgRNA是根据靶基因设计的引导RNA，准确引导Cas9切割与SgRNA配对的靶基因DNA序列。Cas9能借助SgRNA分子与目标DNA进行特异性结合的原因在于SgRNA分子上的碱基序列与目标DNA分子上的碱基序列可以通过碱基互补配对原则实现SgRNA与目标DNA特定序列的特定识别，进而定位；由此可见，Cas9在功能上属于限制酶，可切割目标DNA特定的核苷酸序列。
3．(1)翻译的过程中提前出现终止密码子　GCC　密码子具有简并性　(2)促进DML2基因的转录过程　延迟表达　延迟
解析　(1)由图Ⅰ可知：基因h是由基因H编码区第146位碱基后插入一个C后突变产生，插入一个C后导致基因h后的碱基排列顺序发生改变，即终止密码子的位置提前，导致翻译过程提前终止，所以致使h蛋白比H蛋白少93个氨基酸；密码子是由位于mRNA上的3个相邻的碱基决定的，基因h是由基因H编码区第146位碱基后插入一个C后突变产生，插入一个C后就变成了147位的碱基，所以基因h转录形成的mRNA上第49个密码子为GCC；由于密码子具有简并性，当基因H发生另一突变后，其转录形成的mRNA上有一密码子发生改变，但翻译的多肽链氨基酸序列和数量可能不变。
4．(1)分割　2　(2)①④
解析　(1)若要获得更多基因编辑猪，可采用胚胎分割技术对移植前的胚胎进行分割。子代猪的性别取决于核供体亲本，即2号猪。(2)为了判断目的基因是否被导入受体，可采用DNA分子杂交、DNA测序等技术进行检测；判断目的基因导入受体细胞后是否成功表达出相应的蛋白质，通常采用抗原—抗体杂交法从分子水平进行检测。
5．(1)限制性内切核酸酶和DNA连接酶　转化　(2)RNA聚合酶与启动子的识别和结合　不发生　编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子　(3)逆转录　引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)　(4)品系3　品系3的Wx mRNA量最少，控制合成的直链淀粉合成酶的量最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强
解析　(1)构建基因表达载体需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶，可以对目的基因和载体进行切割和连接，重组载体进入受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。(2)RNA聚合酶与启动子识别和结合后启动转录，启动子的序列改变会影响与RNA聚合酶的识别和结合，从而改变基因的转录，3个突变品系中改变的是启动子的序列，影响mRNA的转录，而编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含有启动子的序列，所以编码合成的直链淀粉酶的氨基酸序列不发生改变。(3)通过mRNA获得cDNA是逆转录过程。PCR过程中需要模板、原料、酶、引物等，其中引物是根据已知基因上的一段序列合成的，这样要从总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA，关键是要根据Wx基因的一段已知序列合成出相应的引物。(4)据题中信息可知，水稻胚乳中直链淀粉所占比例越小，糯性越强，题图中品系3中的Wx mRNA量最少，这样合成的直链淀粉合成酶的量最少，则合成的直链淀粉所占比例最小，糯性最强。
模拟预测
1．(1)限制性内切核酸酶(或限制酶)　(2)整合到染色体DNA上　标记基因　(3)①GH－3　②③3/16　(4)在胚乳中特异性删除抗虫基因(或外源基因或两个LoxP间的序列)　具有
解析　(3)①如果T－DNA1和T－DNA2以连锁形式在单一位点插入植株，则对叶片的gus基因进行PCR检测时，电泳结果不会出现相应的条带，符合GH－3植株的电泳结果。②由题信息可知，先从T0植株中筛选T－DNA1和T－DNA2都是单拷贝(单个)插入的植株，再结合植株GH－2的T1代叶片gus基因电泳结果可知，抗性检测为阴性，但植株的叶片中都含有gus基因，说明T－DNA1和T－DNA2插入了一对同源染色体的不同位点(位置图见答案)；如果插入了两对同源染色体的不同位置，符合自由组合定律，经过自交后会出现有的叶片含有gus基因、有的叶片不含gus基因，符合GH－1的电泳结果。③根据GH－1的T0代自交的后代T1植株的gus基因电泳结果可知，T－DNA1和T－DNA2插入了两对同源染色体的不同位置，符合自由组合定律，亲本为杂合子，所以在T1植株中具有抗虫特性但不含hpt基因的植株的比例为3/4×1/4＝3/16。(4)在“Cre/LoxP”系统中，Cre基因编码的Cre酶可特异性识别同一DNA两个同向的LoxP序列并将两个LoxP间的序列删除，实现了在胚乳中特异性删除抗虫基因(或外源基因或两个LoxP间的序列)，培育了安全可食用的转基因水稻。GH－1的T0代自交的后代T1植株中，具有抗虫特性但不含hpt基因的植株自交后筛选即可获得稳定遗传的种子Tx，所以Tx种子播种后获得的叶片具有抗虫的性状。
2．(1)染色体结构变异　(2)②　5′　(3)显微注射
(4)a.黄　无　b．F1为杂合子，有编码黄色、红色、蓝色荧光蛋白的基因、LoxP1、LoxP2及Cre酶基因；有信号分子X时，启动Cre酶表达，不同脑细胞中Cre酶表达情况不同，Cre酶识别的LoxP不同，因而不同细胞会差异表达黄色、红色或蓝色荧光蛋白基因
解析　(2)根据图示可知，LoxP序列①和③是反向重复序列，因此图1中LoxP序列的方向取决于序号②对应的区域。一个LoxP序列内部经过切割后会增加两个游离的磷酸基团，位于DNA序列的5′端。(4)F1为杂合子，脑组织细胞中有编码黄色、红色、蓝色荧光蛋白的基因、LoxP1、LoxP2及Cre酶基因。无信号分子X时，Cre酶不表达，仅表达与启动子相邻的荧光蛋白的基因即黄色荧光蛋白基因，使脑组织细胞呈黄色。
3．(1)专一　碱基互补配对　(2)SgRNA序列过短，易与靶基因以外的DNA序列互补配对而脱靶　适当增加SgRNA的长度，提高其与靶基因识别的特异性　(3)只构建一个表达载体即可，能准确插入目标生物基因组中，能通过绿色荧光进行筛选
(4)ATGATGATGATGATGATGCAT　A
CAATTGATGCAT
解析　(3)由图1可知，EGFP是增强型绿色荧光蛋白基因；I－SecⅠ是归位内切酶，可将质粒随机插入目标生物的基因组中，理论上，一个SgRNA便能实现靶基因的敲除，构建图1所示重组质粒的优势有：只构建一个表达载体即可，能准确插入目标生物基因组中，能通过绿色荧光进行筛选等。(4)①已知His标签由6个组氨酸组成，组氨酸的密码子为CAU，起始密码子为AUG，所以His基因模板链的碱基序列为5′－ATGATGATGATGATGATGCAT－3′。②设计与EGFP基因编码区两端序列互补配对的引物时，要保证限制酶切割位点不能破坏EGFP基因且标签基因连接在绿色荧光蛋白基因(EGFP)编码区的首端，故需在引物A的5′端增加相应的限制酶识别序列和His基因的编码序列，由图2分析可知，选择MunⅠ限制酶，结合组氨酸的密码子为CAU，起始密码子为AUG，引物序列为5′－CAATTGATGCAT－3′。(共38张PPT)
专题八　
第7练
基因编辑原理、过程及应用
1.(2024·新课标，35节选)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5′→3′方向。回答下列问题：
真题演练
PART ONE
(1)限制酶切割的化学键是____________。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是
_____________________________________________________________。
(2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G－C和_________
______________。
(3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是__________________。
磷酸二酯键
使M1与M2之间有启动子、N基因、终止子，确保N基因能够顺利表达
C－G、
A－T、U－A
菌株B2基因组DNA
2.(2021·海南，25节选)CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA(SgRNA)引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。回答下列问题：
(1)过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，
需对含有特定SgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是____________。
DNA连接酶
基因工程所需的工具酶有限制酶和DNA连接酶，限制酶负责切割，DNA连接酶负责连接，因此为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定SgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是DNA连接酶。
(2)过程③～⑤中，SgRNA与Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是_____________。随后，Cas9蛋白可切割_____________________序列。
碱基互补配对
目标(目的)DNA(基因)
根据题图可知：在CRISPR/Cas9基因编辑技术中，SgRNA是根据靶基因设计的引导RNA，准确引导Cas9切割与SgRNA配对的靶基因DNA序列。Cas9能借助SgRNA分子与目标DNA进行特异性结合的原因在于SgRNA分子上的碱基序列与目标DNA分子上的碱基序列可以通过碱基互补配对原则实现SgRNA与目
标DNA特定序列的特定识别，进而定位；由此可见，Cas9在功能上属于限制酶，可切割目标DNA特定的核苷酸序列。
(3)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1 200 bp的基因，在DNA水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是__________________，基因敲除成功的判断依据是_________________
__________________________________________________________________________________________。
DNA分子杂交技术
经编辑过的DNA片段(从受体细胞中提取的基因组DNA)与标记的目标(对应)基因(探针)杂交，若无杂交带，则敲除成功
(4)某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒，随后将其导入到大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入到基因组DNA的编辑过程：__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，表达产物Cas9蛋白和转录产物SgRNA，两者形成复合体；SgRNA识别并结合目标DNA序列，引导Cas9蛋白进行切割；从而将目的基因插入基因组DNA中
3.(2022·重庆，24节选)科学家用基因编辑技术由野生型番茄(HH)获得突变体番茄(hh)，发现突变体中DML2基因的表达发生改变，进而影响乙烯合成相关基因ACS2等的表达及果实中乙烯含量(如图Ⅰ、Ⅱ)，导致番茄果实成熟期改变。请回答以下问题：
(1)图Ⅰ中，基因h是由基因H编码区第146位碱基后插入一个C(虚线框所示)后突变产生，致使h蛋白比H蛋白少93个氨基酸，其原因是________________________________。基因h
转录形成的mRNA上第49个密码子为_______。另有研究发现，基因H发生另一突变后，其转录形成的mRNA上有一密码子发生改变，但翻译的多肽链氨基酸序列和数量不变，原因是__________________。
翻译的过程中提前出现终止密码子
GCC
密码子具有简并性
由图Ⅰ可知：基因h是由基因H编码区第146位碱基后插入一个C后突变产生，插入一个C后导致基因h后的碱基排列顺序发生改变，即终止密码子的位置提前，导致翻译过程提前
终止，所以致使h蛋白比H蛋白少93个氨基酸；密码子是由位于mRNA上的3个相邻的碱基决定的，基因h是由基因H编码区第146位碱基后插入一个C后突变产生，插入一个C后就变成了147位的碱基，所以基因h转录形成的mRNA上第49个密码子为GCC；由于密码子具有简并性，当基因H发生另一突变后，其转录形成的mRNA上有一密码子发生改变，但翻译的多肽链氨基酸序列和数量可能不变。
(2)图Ⅱ中，t1～t2时段，突变体番茄中DML2基因转录的mRNA相对量低于野生型，推测在该时间段，H蛋白对DML2基因的作用是________________________。突变体番茄果实成熟期改变的可能机制为：H突变为h后，由于DML2基因的作用，果实中ACS2基因_________，导致果实成熟期______(填“提前”或“延迟”)。
促进DML2基因的转录过程
延迟表达
延迟
4.(2019·江苏，29节选)利用基因编辑技术将病毒外壳蛋白基因导入猪细胞中，然后通过核移植技术培育基因编辑猪，可用于生产基因工程疫苗。如图为基因编辑猪培育流程，请回答下列问题：
(1)为获得更多基因编辑猪，可在胚胎移植前
对胚胎进行______。产出的基因编辑猪的性染色体来自___号猪。
分割
2
若要获得更多基因编辑猪，可采用胚胎分割技术对移植前的胚胎进行分割。子代猪的性别取决于核供体亲本，即2号猪。
2)为检测病毒外壳蛋白基因是否被导入4号猪并正常表达，可采用的方法有______(填序号)。
①DNA测序　②染色体倍性分析　③体细胞结构分析　④抗原—抗体杂交
①④
为了判断目的基因是否被导入受体，可采用DNA分子杂交、DNA测序等技术进行检测；判断目的基因导入受体细胞后是否成功表达出相应的蛋白质，通常采用抗原—抗体杂交法从分子水平进行检测。
5.(2020·山东，25)水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因(Wx基因)启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。
(1)将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需的酶是_______________________________，重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为______。
限制性内切核酸酶和DNA连接酶
转化
构建基因表达载体需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶，可以对目的基因和载体进行切割和连接，重组载体进入受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。
(2)根据启动子的作用推测，Wx基因启动子序列的改变影响了__________
________________________，从而改变了Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列________(填“发生”或“不发生”)改变，原因是_______________
______________________________。
RNA聚合
酶与启动子的识别和结合
不发生
编码直链淀粉
合成酶的碱基序列中不含启动子
RNA聚合酶与启动子识别和结合后启动转录，启动子的序列改变会影响与RNA聚合酶的识别和结合，从而改变基因的转录，3个突变品系中改变的是启动子的序列，影响mRNA的转录，而编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含有启动子的序列，所以编码合成的直链淀粉酶的氨基酸序列不发生改变。
(3)为检测启动子变化对Wx基因表达的影响，科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA (Wx mRNA)的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经_________过程获得总cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出 Wx基因的cDNA，原因是____________________________
___________________________________________________。
逆转录
引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)
通过mRNA获得cDNA是逆转录过程。PCR过程中需要模板、原料、酶、引物等，其中引物是根据已知基因上的一段序列合成的，这样要从总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA，关键是要根据Wx基因的一段已知序列合成出相应的引物。
(4)各品系Wx mRNA量的检测结果如图所示，据图推测糯性最强的品系为_______，原因是_________________________________________________________________________________________。
品系3
品系3的Wx mRNA量最少，控制合成的直链淀粉合成酶的量最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强
据题中信息可知，水稻胚乳中直链淀粉所占比例越小，糯性越强，题图中品系3中的Wx mRNA量最少，这样合成的直链淀粉合成酶的量最少，则合成的直链淀粉所占比例最小，糯性最强。
1.(2024·汕头高三二模)转基因技术的研发是加快农业现代化的重要途径，但转基因食品的安全性备受关注。研究者将水稻抗虫基因(crylC)和双T－DNA载体连接(图示为连接后双T－DNA部分结构)，利用其中的“Cre/LoxP”系统培育了安全可食用的转基因水稻。在“Cre/LoxP”系统中，Cre基因编码的Cre酶可特异性识别同一DNA两个同向的LoxP序列并将两个LoxP间的序列删除。
注：P－启动子：P1为胚乳特异性表达启动子；P2为绿色组织特异性表达启动子。
回答下列问题：
模拟预测
PART TWO
(1)Cre酶与基因工程中的___________________________(工具酶)作用类似。
(2)载体中T－DNA的作用是转移外源基因到被侵染的细胞后____________
___________，hpt基因(潮霉素抗性基因)和gus基因(表达产物使无色底物显蓝色)有助于双T－DNA共转化植株的筛选，起到基因表达载体中_________ (填结构)的作用。
限制性内切核酸酶(或限制酶)
整合到染色
体DNA上
标记基因
(3)筛选得到双T－DNA共转化成功的植株T0中，hpt基因对植物和环境具有潜在的危害，需设法将其删除。先从T0植株中筛选T－DNA1和T－DNA2都是单拷贝(单个)插入的植株GH－1、GH－2和GH－3，自交后得到T1代植株进行潮霉素抗性检测，选择抗性检测为阴性植株的叶片的gus基因进行PCR检测，产物的电泳结果如图a(不考虑减数分裂时发生互换)。
①T0代中________(填编号)是T－DNA1和T－DNA2以连锁形式在单一位点插入植株。
GH－3
如果T－DNA1和T－DNA2以连锁形式在单一位点插入植株，则对叶片的gus基因进行PCR检测时，电泳结果不会出现相应的条带，符合GH－3植株的电泳结果。
②在图b中画出植株GH－2的T－DNA1和T－DNA2在染色体上的位置(注：用“·”表示T－DNA1和T－DNA2在染色体上的位置)。
答案　
由题信息可知，先从T0植株中筛选T－DNA1和T－DNA2都是单拷贝(单个)插入的植株，再结合植株GH－2的T1代叶片gus基因电泳结果可知，抗性检测为阴性，但植株的叶片中都含有gus基因，说明T－DNA1和T－DNA2插入了一对同源染色体的不同位点(位置图见答案)；如果插入了两对同源染色体的不同位置，符合自由组合定律，经过自交后会出现有的叶片含有gus基因、有的叶片不含gus基因，符合GH－1的电泳结果。
(4)水稻种子主要包括胚和胚乳，其中胚乳被加工成精米食用。该“Cre/LoxP”系统，实现了___________________________________________________
________，培育了安全可食用的转基因水稻。Tx种子播种后获得的叶片______(填“具有”或“不具有”)抗虫的性状。
在胚乳中特异性删除抗虫基因(或外源基因或两个LoxP间的序列)
在“Cre/LoxP”系统中，Cre基因编码的Cre酶可特异性识别同一DNA两个同向的LoxP序列并将两个LoxP间的序列删除，实现了在胚乳中特异性删除抗虫基因(或外源基因或两个LoxP间的序列)，培育了安全可食用的转基因水稻。GH－1的T0代自交的后代T1植株中，具有抗虫特性但不含hpt基因的植株自交后筛选即可获得稳定遗传的种子Tx，所以Tx种子播种后获得的叶片具有抗虫的性状。
具有
2.(2024·安徽高三三模)“脑彩虹”是一项最新的大脑成像技术，通过荧光蛋白“点亮”大脑内的神经元，帮助科学家了解大脑。Cre－LoxP系统能够实现特
定基因的敲除，其技术过程如图1所示。
(1)当两个LoxP序列位于同一个DNA分子上且方向相同时，Cre重组酶能将两个切割位点之间的核苷酸序列切除并形成环状而失活，剩余序列会连接起来。在特定基因的敲除过程中，若两个LoxP序列方向相反时，Cre重组酶使两个LoxP间的序列颠倒，由此产生的变异本质上属于________
__________。
染色体
结构变异
(2)图1中LoxP序列的方向取决于序号_____对应的区域。一个LoxP序列的内部被Cre酶切割后，将在DNA序列的_____(填“5′”或“3′”)端形成游离的磷酸基团。
②
5′
根据图示可知，LoxP序列①和③是反向重复序列，因此图1中LoxP序列的方向取决于序号②对应的区域。一个LoxP序列内部经过切割后会增加两个游离的磷酸基团，位于DNA序列的5′端。
(3)科学家以小鼠为材料，将三种荧光蛋白基因、两种LoxP序列与脑组织特异表达启动子M相连接，构建图2所示的基因表达载体，再用_________法将该基因表达载体导入小鼠的受精卵中，进而得到仅含一个图2所示片段的转基因小鼠，再经过进一步操作，获得纯合的转基因小鼠a(不含Cre酶)。
显微注射
(4)图2所示序列的两个LoxP1之间或两个LoxP2之间的基因，只会被Cre酶识别并切割一次。为使脑组织细胞中Cre酶的表达受调控，研究者将Cre酶基因与启
动子N(由信号分子X开启)连接，经一系列操作，获得纯合转基因小鼠b，将纯合小鼠a和b杂交，得到F1。
a.若无X作用时，该小鼠脑组织的色彩为____色，其他组织细胞颜色为____色。
b.若有X作用时，该小鼠脑组织会出现“脑彩虹”，请阐述机理：___________
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
黄
无
F1为杂合子，有编码黄色、红色、蓝色荧光蛋白的基因、LoxP1、LoxP2及Cre酶基因；有信号分子X时，启动Cre酶表达，不同脑细胞中Cre酶表达情况不同，Cre酶识别的LoxP不同，因而不同细胞会差异表达黄色、红色或蓝色荧光蛋白基因
F1为杂合子，脑组织细胞中有编码黄色、红色、蓝色荧光蛋白的基因、LoxP1、LoxP2及Cre酶基因。无信号分子X时，Cre酶不表达，仅表达与启动子相邻的荧光蛋白的基因即黄色荧光蛋白基因，使脑组织细胞呈黄色。
3.CRISPR/Cas9基因编辑技术可以按照人们的意愿精准剪切、改变任意靶基因的遗传信息，从而达到基因定点敲除、插入、突变的目的。在该基因编辑技术中，SgRNA是根据靶基因设计的引导RNA，准确引导Cas9切割与SgRNA配对的靶基因DNA序列。请回答下列问题：
(1)Cas9准确切割与SgRNA配对的靶基因DNA序列的过程体现了酶具有_____性；该过程依赖于SgRNA与靶基因DNA序列之间的____________。
(2)SgRNA是人工合成的一段能与靶基因互补配对的特殊序列，由23个连续的碱基组成。研究发现，SgRNA有时会出现脱靶问题，试分析其原因可能是________________________________________________________；
解决措施是__________________________________________________。
专一
碱基互补配对
SgRNA序列过短，易与靶基因以外的DNA序列互补配对而脱靶
适当增加SgRNA的长度，提高其与靶基因识别的特异性
(3)为了实现某基因的特异性敲除，如图1所示，科研人员将含有3个不同的但靶向相同基因的SgRNA编码基因的重组质粒组装到具有特殊元件的载体上，形成新的重组质粒。
理论上，一个SgRNA便能实现靶基因的敲除，请分析构建图1所示重组质粒的优势：___________________________________________________
_______________________ (答出2点)。
只构建一个表达载体即可，能准确插入目标生物基因组中，能通过绿色荧光进行筛选
能实现靶基因的敲除，构建图1所示重组质粒的优势有：只构建一个表达载体即可，能准确插入目标生物基因组中，能通过绿色荧光进行筛选等。
由图1可知，EGFP是增强型绿色荧光蛋白基因；I－SecⅠ是归位内切酶，可将质粒随机插入目标生物的基因组中，理论上，一个SgRNA便
(4)为筛选特定D基因“敲除”的果蝇，在D基因的DNA断裂位点插入绿色荧光蛋白基因(EGFP)需构建携带绿色荧光蛋白基因的供体质粒。把EGFP基因和His标签基因(His标签由6个组氨酸组成)连接起来构建融合基因并构建重组质粒，图2为载体、EGFP基因的结构、不同限制酶的
识别序列及切割位点，欲将标签基因连接在绿色荧光蛋白基因(EGFP)编码区的首端，已知组氨酸的密码子为CAU，起始密码子为AUG。
①写出His基因模板链的碱基序列：5′－_____________________________－3′。
ATGATGATGATGATGATGCAT
已知His标签由6个组氨酸组成，组氨酸的密码子为CAU，起始密码子为AUG，所以His基因模板链的碱基序列为5′－ATGATGATGATGATGATGCAT－3′。
②为构建融合基因并将其插入载体，科研人员设计了一对与EGFP基因编码区两端序列互补配对的引物，设计时需在引物____(填“A”或“B”)的5′端增加相应的限制酶识别序列和His基因的编码序列，请写出该引物开头的12个碱基序列：5′－_________________－3′。
A
CAATTGATGCAT
结合组氨酸的密码子为CAU，起始密码子为AUG，引物序列为5′－CAATTGATGCAT－3′。
设计与EGFP基因编码区两端序列互补配对的引物时，要保证限制酶切割位点不能破坏EGFP基因且标签基因连接在绿色荧光蛋白基因(EGFP)编码区的首端，故需在引物A的5′端增加相应的限制酶识别序列和His基因的编码序列，由图2分析可知，选择MunⅠ限制酶，

展开更多......

收起↑