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第2节 基因工程的基本操作程序
第2课时
能阐述基因表达载体的构建过程。
01
能阐述将目的基因导入受体细胞的方式及原理。
02
能阐明目的基因的检测与鉴定所涉及的技术原理
03
获取了足够量的Bt基因后，下一步就是要让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；同时，使Bt基因能够表达和发挥作用
这就是需要构建基因表达载体。这也是培育转基因抗虫棉的核心工作
那么基因表达载体是由哪些部分组成的呢？
第二步：基因表达载体的构建
不能。游离的DNA进入受体细胞，一般会直接被分解，即使可以转录翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。
获得了足量的Bt基因后，是否能直接将Bt基因导入棉花细胞呢？
思考：各个元件有什么作用？
因此，获取Bt基因后，还需要借助载体将其导入棉花细胞，才能使棉花植株获得抗虫特性。
（核心工作）
三、基因表达载体的构建
1.目的：
①让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代;
2.组成：
启动子：
基因的前端，RNA聚合酶识别和结合的部位；驱动基因转录出mRNA。
限制酶切割位点，
插入目的基因
终止子：基因的尾端，能终止mRNA的转录
标记基因：作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。
②使目的基因能够表达和发挥作用
——基因工程的核心
基因表达载体=启动子+目的基因+终止子+标记基因+复制原点
（若需要能完成自主复制，还应有复制原点）
思考1：目的基因该插入什么位置？
目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入 ，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。
启动子和终止子之间的部位
思考2：启动子有哪些类型？
①组成型启动子：每种组织器官中均发挥作用。
②组织特异型启动子：特定组织器官中才能发挥作用。
③诱导型启动子：特定条件下刺激才能发挥作用。
诱导型启动子
诱导物
作用
激活或抑制
目的基因表达
诱导型启动子：
载体 ≠ 基因表达载体
二者都有：标记基因和复制原点两部分DNA片段。
基因表达载体：在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子。
思考3： “载体”＝“基因表达载体”？
原因：
①生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；
②通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；
③目的基因导入受体生物中需要有筛选标记；
④为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调无件，如增强子等；
⑤有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因或做成目的基因与标记基因的融合基因，如绿色荧光蛋白基因。
思考4: “启动子”＝“起始密码子”？
“终止子”＝“终止密码子”？
启动子（DNA分子中）≠ 起始密码子（mRNA分子中）
终止子（DNA分子中）≠ 终止密码子（mRNA分子中）
终止子
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
启动子
3.基因表达载体的构建过程：
载体
（质粒）
DNA分子
（含目的基因）
限制酶处理
带有黏性末端或平末端的切口
带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段
DNA连接酶
重组DNA分子
（重组质粒）
同一种
思考：该过程需要用到基因工程哪些工具酶？
重组DNA分子
目的基因
思考: 使用同一种DNA限制酶进行切割，会得到几种重组DNA？有何缺点？怎么改进？
载体
目的基因
自连
片段间的连接
目的基因自连
质粒自连
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
正向连接 反向连接
1
1’
2
2’
1
2
2’
1’
2
2’
1’
1
双酶切：选择2种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割，得到两种不同的末端，可减少自身环化及反向连接等问题出现。
思考：如何防止自身环化和反向连接的问题？
双酶切
-G
-CTTAA
-A
-TCTAG
双酶切：切出的黏性末端不能再碱基互补配对
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
微生物细胞
农杆菌转化法
花粉管通道法
——显微注射法
——Ca2+处理法
我国科学家独创
将目的基因导入受体细胞
（常用）
基因枪法
（单子叶植物常用）
第三步：
②在植物授粉后一定时间内，剪去 ，将DNA溶液滴在 ，使目的基因通过 进入 。
①用微量注射器将 溶液
直接注入 中；
花粉管通道法导入外源DNA
适用生物：开花植物
（1）花粉管通道法（我国独创）
1.目的基因导入植物细胞
含目的基因DNA
子房
柱头
花柱切面
花粉管通道
胚囊
实例：
我国“转基因抗虫棉”
优缺点：
简便经济（优点）
要求花朵较大（缺点）
四、将目的基因导入受体细胞
农杆菌是生活在土壤中的微生物，自然条件下可侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞、并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
（2）农杆菌转化法
①转化：指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。
此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。
（2）农杆菌转化法
②原理：
农杆菌能在自然条件下侵染 植物和 植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。
农杆菌细胞内含有 ，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的 转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的 上。
双子叶
裸子
Ti质粒
T-DNA
染色体DNA
可转移的DNA
目的基因
Ti质粒
表
达
载
体
农杆菌
植物细胞
植物细胞
染色体DNA
新性状植株
构建
转入
导入
插入
表达
③过程：
目的基因插入到农杆菌Ti质粒的T-DNA中
重组DNA转入农杆菌
农杆菌侵入植物将目的基因带入植物细胞
含外源目的基因的重组DNA整合到植物细胞的基因组中
目的基因遗传特性稳定维持和表达
1.农杆菌转化法中，目的基因是否就是T-DNA，如果不是，T-DNA与目的基因是什么关系？
T-DNA不是目的基因，但它将来会被整合到宿主细胞染色体的DNA上，只要将目的基因插入T-DNA中，目的基因就可以随T-DNA进入宿主细胞并整合到宿主细胞的染色体上。
2.农杆菌转化法中，目的基因只能进入植物的一个体细胞中，但基因工程最终要的是一个转基因植株，如何实现这一目标？
得到含有目的基因的植物细胞后进行植物组织培养
讨 论：
该过程经过____次拼接、____次导入
①第一次拼接：
_____________________________________
②第二次拼接： _____________________________________
③第一次导入：
_____________________________________
④第二次导入：
_____________________________________
将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上
农杆菌将插入目的基因的T-DNA拼接到受体 细胞染色体的DNA上（非人工操作）
两
两
将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌
农杆菌将含目的基因的T-DNA导入受体细胞（非人工操作）
拓展—拼接&导入
2.将目的基因导入动物细胞
（1）常用方法：
（2）受体细胞:
显微注射法
受精卵
①体积大，易操作。②易表现出全能性。
（3) 过程：
构建基因表达载体并提纯
利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中
早期胚胎培养
胚胎移植
获得具有新性状的动物
问题: 为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？
（1）常用方法：
Ca2+处理
原核细胞（常选择大肠杆菌）
（2）受体细胞：
Ca2+
感受态细胞
吸收
3.将目的基因导入微生物细胞
优点：
繁殖周期短 体积小易于培养操作
多为单细胞 遗传物质相对较少
使用Ca2+
处理：
增加细胞壁的通透性，可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态（感受态细胞）。
Ca2+处理细胞
感受态细胞
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA分子
【注意】原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。
（因为没有内质网、高尔基体对蛋白质进一步加工。）
小结：将目的基因导入受体细胞的方法
种类 项目 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用 方法
受体 细胞
转化 过程 目的基因插入Ti质粒的T DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA中→表达 目的基因表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→能吸收周围环境中DNA分子的生理状态细胞→重组的基因表达载体导入细胞中
农杆菌转化法
显微注射法
Ca2＋处理法
体细胞或受精卵
受精卵
原核细胞
将基因表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？
即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？
思 考：
检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。
类型 检测内容 方法
分子水平的检测
个体生物学水平的鉴定
DNA水平：受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因
RNA水平：目的基因是否转录出了mRNA
PCR或DNA分子杂交技术
蛋白质水平：目的基因是否翻译成蛋白质
抗原-抗体杂交技术
个体是否具有相应性状
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
PCR或分子杂交技术等
五、目的基因的检测与鉴定
1.检测目的：
2.检测内容及方法
2.检测内容及方法:
（1）分子水平的检测
检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因
①检测目的基因是否导入
——方法1：通过PCR等技术检测
提取棉花细胞DNA
用与Bt基因相关的
引物进行PCR扩增
对扩增产物进行检测
DNA半保留复制
基本思路：
制作基因探针，并用PCR扩增；
提取受体细胞全部DNA并用PCR扩增，与基因探针置于同一培养液；
高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA片段。
探针与受体中的DNA分子杂交
出现杂交带：
不出现杂交带：
已插入
未插入
提取棉花细胞DNA
用与Bt基因相关的
引物进行PCR扩增
对扩增产物进行检测
——方法2：DNA分子交杂技术
变性
提取目的基因的DNA片段用放射性同位素标记，作为基因探针；
使探针与转基因生物基因组杂交，若出现杂交带，则导入成功。
原理：碱基互补配对原则
①检测目的基因是否导入
检测Bt基因是否翻译出mRNA
提取棉花细胞mRNA
逆转录
产生DNA
对扩增产物进行检测
用与Bt基因相关的
引物进行PCR扩增
②检测目的基因是否转录
——方法1；通过PCR等技术检测
（1）分子水平的检测
如：检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白
②检测目的基因是否转录
——方法2：分子杂交技术
制作基因探针；
探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明转录出了mRNA。
变性
探针
15N
15N
转基因生物
的mRNA
杂交分子
（可检测）
原理：碱基互补配对原则
③检测目的基因是否翻译
——通过抗原-抗体杂交检测
从转基因生物提取出来的蛋白质和相应的抗体进行杂交，如果出现杂交带，说明目的基因已经翻译。
苏云金芽孢杆菌
提取
Bt毒蛋白
注射小鼠体内
抗体
标记抗体
提取蛋白
抗原
抗体
杂交
脱分化
从棉花中
提取蛋白质
用相应抗体进行
抗原-抗体杂交检测
2.个体水平的检测
检测内容：转基因生物是否具有相应性状
检测方法：
转Bt基因
非转基因
没有抗虫基因的棉植株
有抗虫基因的棉植株
接种
棉铃虫
虫没有死
虫被杀死
没有表达
目的基因表达
抗虫或抗病接种实验
基因工程产品与天然产品的功能进行活性比较
如：采摘抗虫棉的叶子饲喂棉铃虫，观察抗虫效果。
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐植物
抗除草剂植物
获取目的基因产物的转基因生物
饲喂害虫（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）接种实验
未染病
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
功能、活性正常
小结：个体水平的检测
1.下列有关基因表达载体的叙述，错误的是（ ）
A．具有复制原点，使目的基因能在受体细胞内扩增
B．具有启动子，作为翻译多肽链的起始信号
C．具有标记基因，有利于目的基因的检测和筛选
D．具有目的基因，以获得特定的基因表达产物
B
2.下列技术依据碱基互补配对原理的是（ ）。
①检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因
②检测目的基因是否转录出了mRNA
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
④通过观察害虫吃棉叶是否死亡判断棉花是否被赋予了抗虫特性
A．①②③④ B．①② C．①②④ D．①②③
B

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