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(共34张PPT)
第2节 基因工程的基本操作程序
第1课时
能辨析启动子和起始密码子、终止子和终止密码子。
01
能概述目的基因的筛选与获取方法方法。
02
能阐明PCR技术的原理、过程。
03
苏云金杆菌
培育转基因抗虫棉需要哪几步？
Bt基因
表达
苏云金伴胞晶体蛋白
（Bt抗虫蛋白）
摄食
害虫死亡
苏云金杆菌
与载体拼接
普通棉花
（无抗虫特性）
棉花细胞
抗虫棉
提取
表达Bt基因
导入
Bt基因
重组DNA分子
培育转基因抗虫棉的简要过程
基因工程的基本操作程序
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。
载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。
才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。
前提
核心
关键
保证
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。
目的基因
“杀虫基因”:
Bt抗虫蛋白基因
根据不同的需要，目的基因是不同的，主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。
一、筛选合适的目的基因
1. 目的基因概念
注意：不是所有的基因都编码蛋白质或肽链。
编码区：
非编码区：
原核基因
真核基因
编码区
非编码区：
能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列
不编码蛋白质，含有能调控遗传信息表达的DNA序列
(如启动子、终止子等）
外显子：
内含子：
在细胞核转录出mRNA后，在翻译前被剪切掉
能转录相应的mRNA，进一步能编码出蛋白质的DNA序列
不编码蛋白质，含有能调控遗传信息表达的DNA序列
(如启动子、终止子等）
原核生物
真核生物
编码区（转录区）
非编码区
非编码区
启动子
启动子
终止子
终止子
外显子
内含子
2.基因的结构
不能编码蛋白质的序列
= 非编码区
原核生物的基因：
不能编码蛋白质的序列
真核生物的基因：
= 非编码区+内含子
原核细胞 真核细胞
不同点 编码区是 的 编码区是间隔的、 的
相同点 都由能够编码蛋白质的 和具有调控作用 的 区组成的 连续
不连续
编码区
非编码
【总结】原核细胞与真核细胞的基因结构比较
（2）实例：Bt 抗虫蛋白基因（Bt 基因）的筛选过程
用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害
对Bt基因的表达产物Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解
苏云金杆菌的杀虫作用与Bt 基因有关
掌握了Bt 基因的序列信息
Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因
（1）较为有效的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
功能清晰
已知结构
3. 筛选合适的目的基因
（3）认识基因结构和功能的技术方法
测序技术→序列数据库（如GenBank）→序列对比工具（如BLAST）
获取目的基因的常用方法有哪些
从基因文库中寻找
聚合酶链式反应（PCR）扩增
化学合成法
目的基因的核苷酸序列未知
目的基因的核苷酸序列已知
初始目的基因的来源
1.从生物中直接获取
2.人工合成
注意：要保持基因的完整性
二、获取目的基因的方法
DNA合成仪
1.人工合成目的基因
①前提：
②方法：
目的基因比较小、核苷酸全部序列已知
DNA合成仪→直接合成目的基因
Q3：化学合成法 （能/不能）合成自然界不存在的新基因，使生物产生新的性状以满足人类的要求。
不含；参与翻译的mRNA序列是由编码序列转录而来。
Q1：化学法合成的目的基因 （含/不含）内含子、启动子和终止子？
多种；遗传密码具有简并性或一种氨基酸可能由多个密码子决定。
Q2：若是控制同一种蛋白质合成的目的基因，利用化学合成法合成的基因可能有 （一种/多种），理由是？
能
（主要指cDNA文库）
基因文库
基因组文库
部分基因文库
2.从基因文库中获取目的基因
基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。
基因组文库：含有某种生物全部基因片段的重组DNA的克隆群体。
部分基因文库：含有某种生物部分基因片段的重组DNA的克隆群体，如cDNA文库。
提取某种生物的全部DNA
基因组所有基因
将每个基因与载体连接，导入不同受体菌中储存
用适当的限制酶切割
基因组文库
构建
基因组文库中的基因含启动子、终止子和内含子！
①基因组文库的构建
某种生物（某一发育时期）的（成熟的）单链mRNA
与mRNA互补的单链DNA
双链cDNA片段
导入不同受体菌中储存
与载体连接
cDNA文库
逆转录酶
DNA聚合酶
构建
②部分基因文库（如cNDA文库）的构建
注意：cDNA文库中的基因不含启动子、终止子和内含子。
PCR扩增仪
PCR技术由穆里斯等人于1985年发明，
于1993年获得诺贝尔化学奖。
3.利用PCR获取和扩增目的基因
（1）PCR：
是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
全称：聚合酶链式反应。
原理：DNA半保留复制。
操作环境：体外（PCR扩增仪/PCR仪）。
目的：对目的基因的核苷酸序列进行大量复制。
优点：可以在短时间内大量扩增目的基因。
PCR扩增仪
复习：
DNA在细胞内复制所需要的条件
条件 名称
模板
双链DNA分子
原料
4种脱氧核苷酸
能量
ATP
酶
DNA解旋酶
DNA聚合酶
PCR的原理——体外DNA复制
PCR所需要的条件
条件 名称
模板
双链DNA分子
原料
4种脱氧核苷酸
能量
加热
酶
DNA聚合酶
引物
2种

热稳定的
（2）PCR技术所需的基本条件
通过控制温度使DNA复制在体外反复进行
PCR扩增仪
参与的组分 在DNA复制中的作用
模板：2条DNA母链 提供DNA复制的模板
原料：dNTP(4种脱氧核苷酸) 合成DNA子链的原料
能量：dNTP 为合成DNA子链供能
解旋酶：体外用高温代替 打开DNA双链
DNA聚合酶：耐高温（Tap酶） 催化合成DNA子链
引物：2种小分子DNA片段 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始
连接脱氧核苷酸
一定的缓冲液（Mg2＋） Mg2＋激活真核细胞和细菌的
DNA聚合酶
dNTP的作用：
既可作为合成DNA子链的原料，
又可为DNA的合成提供能量。
4种脱氧核苷酸
(实质是4种脱氧核苷三磷酸dNTP)
①原料：
PCR的条件解读：
dATP
dGTP
dCTP
dTTP
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。
长度通常为20~30个核苷酸。若引物长度过短，则：引物与模板链
结合的特异性较差。
细胞中：一段单链RNA PCR中：一段人工合成的单链DNA
DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能，引物为DNA聚合酶提供了游离的3′端，
使DNA聚合酶从3′端延伸子链。
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
3’
5’
引物1
3’
5’
引物2
由于DNA两条链是反向平行的，序列不同，所以需要2种引物。
②引 物
（3）PCR过程：
第1步：变性
当温度>90℃时，双链DNA解旋为单链。断氢键
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
1)变性
2)复性
3)延伸
冷却
加热
预变性 90 ℃以上 增加大分子模板DNA彻底变性的概率
PCR扩增目的基因的过程：
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
5’
3’
3’
5’
第2步：复性
5’
3’
3’
5’
1)变性
2)复性
3)延伸
冷却
加热
PCR扩增目的基因的过程：
PCR扩增目的基因的过程：
当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则，加到引物的3’端，合成新的DNA链。DNA新链延伸的方向： 5’端 → 3’端
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
3’
5’
5’
3’
第3步：延伸
1)变性
2)复性
3)延伸
冷却
加热
（4）结果：
指数形式扩增加的原因：一个循环得到的产物可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。
（5）PCR扩增产物的鉴定：
琼脂糖凝胶电泳
以指数方式扩增，产生2n个DNA片段
100bp
200bp
300bp
400bp
500bp
600bp
700bp
800bp
1,200bp
1,000bp
900bp
标准
样品1
样品2
样品3
较小的DNA片段在凝胶中移动相对容易，较大的DNA片段移动难。当电泳结束时，比较DNA样品所在的位置和一系列已知大小的DNA片段的位置（标准），这些已知大小的片段称为DNA分子量标准样。
5’
3’
5’
5’
第一次循环
第二次循环
3’
5’
第三次循环
3’
3’
目的基因
目的基因
Q：利用PCR技术扩增目的基因，在第几次循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段（即出现完整的目的基因）？
第一轮循环
第二轮循环
第三轮循环
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
非目的基因序列
目的基因序列
引物
第一轮循环
基因数=
2=21
引物数=
2=22-2
基因数=
4=22
引物数=
6=23-2
第二轮循环
第三轮循环
基因数=
8=23
引物数=
14=24-2
n次循环后，目的基因数为2n，需要引物数为2n+1-2。
4.PCR相关计算
第一轮 第二轮 第三轮 第N轮
DNA分子数
含引物A或引物B的DNA分子数
同时含引物A和引物B的DNA分子数
共消耗引物数
2n－1
7
1
3
0
2
6
2n－2
2
6
14
2n+1－2
21
22
23
2n
第一轮 第二轮 第三轮 第N轮
长链－中链组合的DNA分子数
中链－短链组合的DNA分子数
短链－短链组合的DNA分子数
2
0
0
2
2
2
0
2
4
2
2n-2
2n-2n
长链条数：始终是最初DNA分子的两条链。
中链条数：始终是最初DNA分子的两条长链为模板形成的，并且每复制一次，新形成的中链增加两条。
短链条数：所有的DNA分子中，除长链和中链外，余下的即为短链。
PCR技术与细胞内DNA复制的比较
比较项目 细胞内DNA复制 PCR技术
区别 解旋方式 解旋酶催化 DNA在高温下变性解旋
场所 主要在细胞核内 细胞外(主要在PCR扩增仪内)
酶 解旋酶、DNA聚合酶等 热稳定的DNA聚合酶（Taq 酶）
温度 细胞内温和条件 控制温度，需在不同温度下进行
结果 合成整个DNA分子 扩增特定的DNA片段或基因
联系 ①模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板 ②原料:均为四种脱氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP） ③酶:均需DNA聚合酶 ④引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成 1.在基因工程技术中,下列方法与目的基因获得无关的是(　　)
A.辐射诱变法　　　 B.利用PCR扩增　　
C.通过基因文库获取　　　 D.人工合成法
2.下列有关PCR技术的叙述,错误的是( 　　)
A.PCR技术的原理是DNA半保留复制　　　
B.变性过程中破坏的是磷酸二酯键
C.复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成的
D.延伸过程中需要耐高温的DNA聚合酶、四种脱氧核苷酸等,无需添加ATP
A
B
3.比较PCR技术与细胞内DNA的复制过程,叙述正确的是( 　 　)
A.都需要用解旋酶将亲代DNA双链解开　　　　
B.都是通过ATP提供能量
C.都具有边解旋边复制和半保留复制的特点　　　
D.都遵循碱基互补配对原则
D

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