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(共35张PPT)
第2节 基因工程的
基本操作程序
第1课时
能说出基因工程的基本操作程序。
能说出目的基因筛选与获取的常用方法。
能阐明PCR技术的原理、条件、过程。
普通棉花
转基因抗虫棉
将苏云金杆菌中的Bt抗虫蛋白基因转入普通棉花
如何能培育出自身就能抵抗虫害的棉花新品种呢？
资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt 抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。
科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt 抗虫蛋白抵抗虫害。
目的基因
从社会中来
培育转基因抗虫棉的简要过程
苏云金杆菌
普通棉花
（无抗虫特性）
棉花细胞
抗虫棉
提取
表达 Bt基因
导入
与载体拼接
重组DNA分子
1.目的基因的筛选与获取（前提）
2.基因表达载体的构建
（核心）
3.将目的基因导入受体细胞（关键）
4.目的基因的检测与鉴定（保证）
Bt基因
从社会中来
一、目的基因的筛选与获取
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。根据需求的不同，目的基因也不同，主要指编码蛋白质的基因，如遇生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。
抗逆性、毒物降解等
生产药物、工业用酶
重组人胰岛素注射液
转基因番木瓜
它可以抵御番木瓜环斑病毒
转基因抗虫棉
1.目的基因
苏云金杆菌
制成
杀虫剂
掌握目的基因的功能
掌握目的基因的结构
防治棉花害虫
发现杀虫作用与Bt基因有关
掌握Bt基因的序列
深入了解Bt基因的表达产物(Bt抗虫蛋白)
Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因
2.
获取目的基因常用的方法
①从生物组织中直接获取
②从基因文库中获取
③人工合成
④利用PCR获取和扩增目的基因
基因比较小、核苷酸序列已知
通过DNA合成仪用化学方法直接合成
基因组文库（某生物全部基因）
部分基因文库（主要是cDNA文库）
前提：
方法：
基因文库的类型
基因组文库
部分基因文库（主要是cDNA文库）
基因组文库的构建
提取某生物
全部DNA
用适当
限制酶切割
许 多
DNA片段
该生物
基因组文库
每个受体菌含有一段不同的DNA片段
与载体连接
导入受体菌群
含有某种生物全部基因片段的重组DNA的克隆群体
②从基因文库中获取
含有某种生物部分基因片段的重组DNA的克隆群体。
cDNA文库的构建——mRNA逆转录形成
mRNA
杂交双链
单链DNA
双链cDNA
(cDNA)
该生物
cDNA文库
基因组文库中的基因含有启动子、终止子、内含子，
cDNA文库中的基因不含以上结构。
与载体连接
导入受体菌群
逆转录酶
核酸酶H
DNA聚合酶
某一发育时期
质粒
质粒
cDNA片段
逆转录酶
导入细菌中
逆转录
cDNA
mRNA
cDNA文库
细胞
基因组DNA
质粒
质粒
DNA片段
导入细菌中
基因组文库
文库类型 cDNA文库 基因组文库
文库大小
基因中启动子
基因中内含子
基因多少
物种间基因交流
小
大
无
有
无
有
某种生物的部分基因
某种生物的全部基因
可以
部分基因可以
④利用PCR获取和扩增目的基因
PCR扩增仪
苏云金杆菌
Bt基因
？
快速获得大量Bt基因
提取
1.说出PCR的概念、原理、目的、优点。
2.结合体内DNA复制过程，思考PCR的进行需要哪些条件？所需设备是什么？
3.构建出PCR的大致过程；PCR扩增为什么需要引物？
4.如何对产物进行鉴定？PCR技术与DNA复制过程有哪些异同？
请同学们自主阅读教材P77-79，小组合作思考讨论完成问题。
二、PCR
PCR扩增
（聚合酶链式反应）
根据DNA半保留复制的原理，在体外（PCR扩增仪）提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
原理
操作环境
缓冲溶液、DNA模板、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、与两条模板链结合的2种引物。
目的及优点：可在短时间内大量扩增目的基因
1.概念
DNA复制的条件:
原则:
③能量：
亲代DNA的两条链
4种游离的脱氧核苷酸
解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等
由细胞代谢提供的ATP
①模板：
②原料：
④酶：
碱基互补配对原则
从子链的5' 端向 3' 端延伸
方向:
特点:
边解旋边复制、半保留复制 、多起点双向复制
体外复制怎么改进
体外用高温代替
体外需用耐高温的DNA聚合酶
子链合成需要引物
引物为DNA聚合酶提供了游离的3 ′端，使DNA聚合酶从3 ′端延伸子链。(DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能)
温故而知新
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物通常为20~30个核苷酸。在细胞中为一段单链RNA，在PCR中为一段人工合成的单链DNA。
什么是引物
子链延伸
子链延伸
引物是决定PCR特异性的关键
-5 ′
3′-
引物
5′-
-3′
5′-
-3′
引物
3′-
-5′
微量离心管
缓冲液
PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行。真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg 2+ 激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg 2+ 。
DNA模板
四种脱氧核苷酸(dNTP)
引物
分别与两条模板链结合的2种引物
耐高温的DNA聚合酶
（Taq酶）
2.所需原料
3.过程
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）
4种脱氧核苷酸（dNTP）
引物
待扩增的DNA片段（模板）
5’
5’
变性
复性
延伸
温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。
长度相同但C-G含量高的引物需要设定的复性温度较高
DNA解链为单链
高温(95℃)变性
低温(50℃)复性
中温(72℃)延伸
引物结合到互补DNA链
Taq酶从引物起始进行子链的合成
PCR过程可以在PCR扩增仪(PCR仪)中自动完成。
第一轮循环的产物作为第二轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环产物。
5′-
-3′
3′-
5’
3′-
-5′
5′-
-3′
5′-
-3′
3′-
-5′
5′-
-3′
3′-
-5′
5′-
-3′
3′-
-5′
5′-
-3′
3′-
-5′
5′-
-3′
3′-
-5′
5′-
-3′
3′-
-5′
5′-
-3′
3′-
-5′
5′-
-3′
3′-
-5′
5′-
-3′
3′-
-5′
5′-
-3′
3′-
-5′
第二轮循环的产物作为第三轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮循环产物。
每一次循环后目的基因的量可以增加_____，即呈_____形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。
一倍
指数
4.PCR相关计算
长链-中长链DNA____个
含有引物A的DNA____个
含有引物B的DNA____个
2
1
1
引物A
引物B
扩增一次
中长链-短链DNA____个
2
长链-中长链DNA____个
含有引物A的DNA____个
含有引物B的DNA____个
2
3
3
扩增两次
中长链-短链DNA____个
4
长链-中长链DNA____个
含有引物A的DNA____个
含有引物B的DNA____个
2
7
7
短链-短链DNA______个
2
出现完整的目的基因
扩增三次
中长链-短链DNA____个
长链-中长链DNA____个
含有引物A的DNA____个
含有引物B的DNA____个
短链-短链DNA______个
扩增四次
2
8
15
15
6
扩增次数 1次 2次 3次 4次 n次
DNA总数 21 22 23 24 2n
长链-中长链DNA
中长链-短链DNA
短链-短链 DNA
含引物A(或B) 的DNA
2
0
0
2
2
2
4
0
2
2
6
8
2
2(n-1)
2n-2n
1
3
7
15
2n-1
4.PCR相关计算
一个DNA，一对引物（A与B），通过PCR扩增n次：
①子代DNA分子数为：___个
②子代DNA分子中含模板链DNA分子数为：__个
③子代含有的目的基因数目：_____个
④子代DNA分子中含引物A（或B）的DNA分子数为：______个
⑤复制过程中共需引物_______个
⑥第n次复制需要引物___个
2n
2
2n-1
2n＋1 - 2
2n
2n-2n
1.复性过程一定是引物与DNA模板链结合吗？
复性时引物与DNA模板的结合是随机的，也存在解开的两条DNA单链的结合，但两条模板链重新结合的概率较低。
原因是
①模板链一般比较长，比引物复杂得多，重新结合的概率较低。
②加入引物的量足够多，而模板链数量少，引物与模板之间的碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。
【拓展延伸1】
2.延伸时需要加入两种引物，原因是什么？
DNA是反向平行的双链，DNA聚合酶只能从引物3′端延伸DNA链，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增。
3.两种引物的要求：
①引物自身及引物之间不应存在互补序列；
②引物5'端可以修饰，3'端不可修饰；
③引物长度不宜过短，防止引物随机结合。
【拓展延伸1】
PCR引物的设计
设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增高效性。
1.引物设计需考虑的两个因素
扩增
特异性
扩增
高效性
引物
特异性：只扩增出目标DNA的特性
高效性：单位时间内扩增产物的量
特异性太强，扩增效率就会下降，
提高扩增效率，扩增特异性就会下降
【拓展延伸2】
2.引物设计的原则
（1）引物长度
一般在20-30碱基之间。过长会导致其延伸温度大于74℃，
不适于Taq 酶进行反应。过短特异性差。
（2）引物G-C含量
一般在40%~60%之间，G-C含量过高或过低都不利于引发反应。
（4）复性温度
复性温度高，扩增特异性强，复性温度低，扩增效率高。
如果引物碱基数较少，可以适当提高复性温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当降低复性温度，使DNA双链结合。一对引物的复性温度相差4℃～6℃不会影响PCR的产率，但是理想情况下一对引物的复性温度是一样的。
（3）引物自身及引物之间不应存在互补序列
碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。否则引物自身会折叠成发夹结构或引物之间配对结合，从而影响引物与模板的复性结合。
2.引物设计的原则（小结）
①引物长度要适宜
②引物G-C含量要适宜
③引物自身及引物之间不应存在互补序列
④引物5'端可以修饰，3'端不可修饰
⑤复性温度要适宜
设计的目的是在两个目标间取得平衡: 扩增特异性和高效性。
5.产物鉴定
PCR过程可以在 中自动完成，完成以后，
常采用 来鉴定PCR的产物
琼脂糖凝胶电泳
PCR扩增仪

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