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第1节 重组DNA技术的基本工具
基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
（1）原理：
（2）操作水平：
（3）操作环境：
（4）操作对象：
（5）结果：
基因重组
分子水平
生物体外
基因
赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。
什么是基因工程？
基因工程理论基础的分析
【问题探究1】为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？
（1）DNA的基本组成单位都是 。
（2）DNA分子都遵循 配对原则。
（3）双链DNA分子的空间结构都是 。
【问题探究2】为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？
（1） 是控制生物性状的独立遗传单位。
（2）遗传信息的传递和表达都遵循 。
（3）生物界共用一套 。
四种脱氧核苷酸
规则的双螺旋结构
基因
中心法则
遗传密码
碱基互补
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。
DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。
那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？
这些“分子工具”各具有什么特征呢？
到社会中去
那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？
这些“分子工具”各具有什么特征呢？
工具
分子手术刀
分子缝合针
分子运输车
限制性内切核酸酶：
DNA连接酶：
载体：
准确切割DNA分子
将DNA片段连接起来
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
阅读教材P71，回答下列问题：
1.限制酶的来源？
2.限制酶的特点？
3.限制酶的作用部位？
4.限制酶的识别序列长度？
5.限制酶的切割结果？
简称限制酶
限制酶是用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。限制酶的命名是根据细菌种类而定，
以EcoR I为例：
E：Escherichia （属名）
co：coli （种加词）
R：RY13 （品系）
I：分离出的第一种限制酶
资料卡 限制酶名字的由来
EcoRⅠ
属名Escherichia首字母
种名coli 前两个字母
R型菌株
从中分离的第一种限制酶
EcoRⅠ：大肠杆菌（Escherichia coli）R型菌株中分离出的第一种限制酶。
SmaⅠ：粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）中分离出的第一种限制酶。
流感嗜血杆菌的d菌株（Haemophilus influenzae d）中先后分离到3种限制酶，则分别命名为： 。
HindⅠ、HindⅡ、 HindⅢ
资料卡 限制酶名字的由来
【思考】你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？
原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全。
3. 特点：
4. 作用部位 :
能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
特定部位的磷酸二酯键
还记得磷酸二酯键在哪吗
1. 来源：
主要从原核生物中分离纯化出来的
2. 种类：
数千种
（限制酶不是一种酶，而是一类酶）
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
T
A
C
G
G
C
A
T
G
C
G
C
A
T
5
3
5
3
相邻两个核苷酸之间的键：磷酸二酯键
CH2
H
OH
H
H
H
H
碱基
磷酸
5’
4’
3’
2’
1’
脱氧核苷酸
5.识别序列长度？
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成；
EcoRⅠ
SmaⅠ
TaqⅠ
5’…T-C-G-A…3’
3’…A-G-C-T…5’
也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
特点1：都可以找到一条中心轴线；
特点2：中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列。
（1）实例1——EcoRⅠ限制酶切割
*EcoRⅠ识别序列为GAATTC
*EcoRⅠ切割部位为GA之间的磷酸二酯键
黏性末端
黏性末端
（2）实例2——SmaⅠ限制酶切割
*SmaⅠ识别序列为CCCGGG
*SmaⅠ切割部位为CG之间的磷酸二酯键
平末端
6.切割结果 :
【练习1】：写出下列限制酶切割形成的黏性末端
BamHⅠ________ EcoRⅠ________ HindⅢ________ BglⅡ________
GATC
AATT
AGCT
GATC
思考：同种限制酶切割的黏性末端一定相同吗？不同种限制酶切出的黏性末端一 定不同吗？
不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端
GCT TA AA AT TCGGC T T A AA AT TCG用DNA连接酶连接两个片段之间的磷酸二酯键将两个双链DNA片段“连接”起来的酶1.概念：二、DNA连接酶——“分子缝合针”2.作用：
3.种类：
（1）E.coli DNA连接酶：
来源于大肠杆菌，只连接黏性末端
A
G
T
C
A
T
T
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来。
将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的 。
磷酸二酯键
3.种类：
（2）T4 DNA连接酶
来源于T4噬菌体，既能连接黏性末端，又能连接平末端
（但连接平末端的效率相对较低）。
*基因工程中通常形成黏性末端
类型 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源
功能 只能将具有互补__________ 的DNA片段连接起来 “缝合”两种末端，但连接 _________的效率相对较低
结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的 。 大肠杆菌
T4 噬菌体
黏性末端
平末端
磷酸二酯键
注意：DNA连接酶没有识别序列的特异性、只与末端类型有关
【新旧衔接】DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
种类 DNA聚合酶 DNA连接酶
不同点 作用实质
作用结果
模板
相同点 催化单个核苷酸加到已有核苷酸片段的3’末端的羟基上，形成磷酸二酯键
催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
催化形成与模板链互补的DNA链，形成新的双链DNA分子
催化具有互补黏性末端或平末端的DNA片段连接起来，形成重组DNA分子
需要
不需要
①化学本质都是蛋白质②都是催化形成磷酸二酯键
与DNA相关的五种酶的比较
名称 作用部位 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 将DNA切成两个片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA(水解)酶 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之间的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
练习2：根据所学知识，完成以下填空：
①限制酶 ②解旋酶 ③DNA连接酶 ④DNA聚合酶 ⑤RNA聚合酶
b
a
A.切断a处的酶为_______
B.连接a处的酶为_______
C.切断b处的酶为_______
①
③④⑤
②
a：磷酸二酯键；b：氢键
怎样才能将外源基因送入细胞呢？通常是利用质粒作为载体，将基因送入细胞。
为什么不能直接将外源基因送入细胞呢？
游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录并翻译成蛋白质、游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。若将目的基因插入载体，由于载体可以在细胞内复制，随着细胞分裂，载体会带着目的基因存在于每个子代细胞中。这样，基因工程才有意义。
质粒:
将外源基因送入受体细胞, 在受体细胞内对目的基因进行大量复制。
1.作用：
动植物病毒:
噬菌体:
2.种类：
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞
将外源基因导入植物细胞
将外源基因导入动物细胞
动物病毒
噬菌体
三、基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车”
2.最常用的载体——质粒
终止子: 转录的终点，在转录过程中起调控作用。
启动子: RNA聚合酶识别、结合和开始转录的序列
复制原点: DNA复制的起始位点
标记基因: 便于重组DNA的筛选与鉴定
其基因属于细胞质基因
问题1：载体要与外源基因连接，需要具备什么条件？
问题2：要使携带的外源基因在受体细胞中稳定存在，载体需要具备什么条件？
问题3：我们用肉眼看不到载体是否进入受体细胞，为了便于筛选重组DNA分子，载体需要具备什么条件？
条件①：具有一个或多个限制酶切割位点；
条件②：能在受体细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制；
条件③：具有标记基因，便于重组DNA分子的筛选。
条件④：载体DNA必须是安全的，不会对受体细胞有害。
【探究】分析归纳载体需要具备的条件
抗虫棉
Bt抗虫蛋白
苏云金杆菌
取出
转移
通过本节的学习，现在你能描述如何使用这三种工具来获得抗虫棉吗？
1.实验原理
DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。
DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精
DNA能溶于物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液
在一定温度下（沸水浴），DNA被二苯胺试剂染成蓝色
初步分离DNA和蛋白质
溶解DNA
鉴定DNA
0
0.14
NaCI浓度（mol/L）
DNA溶解度
四、实验：DNA的粗提取与鉴定
DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。
（注意：不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。）
(1)选材：
(2)试剂：
①研磨液
②体积分数为95%的酒精
③2mol/L 的NaCl溶液
④二苯胺试剂
⑤蒸馏水
——溶解并提取DNA
——析出DNA
——溶解DNA
——鉴定DNA，要现配现用
2.材料用具
研磨液、二苯胺的配制方法
课本P117
取材、研磨
过滤
分离
鉴定
结果观察
称取30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL 研磨液，充分研磨。
SDS（十二烷基疏酸钠）
可使蛋白质变性与DNA分离
EDTA（乙二胺四乙酸）
DNA酶抑制剂，可防止细胞破碎后DNA降解DNA
Tris（三羟甲基氨基甲烷）
提供缓冲体系，使DNA在缓冲体系中呈稳定状态
研磨液
3.方法步骤
(1)研磨的目的
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中
(2)研磨时间不宜太长
防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量
(3)有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶
研磨效果好（有利于充分研磨）
(4)研磨不宜太用力
取材、研磨
过滤
分离
鉴定
结果观察
在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。也可直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。
取材、研磨
过滤
分离
鉴定
结果观察
(1)研磨的目的
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中
(2)研磨时间不宜太长
防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量
(3)有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶
研磨效果好（有利于充分研磨）
(4)研磨不宜太用力
①上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？
可能含有核蛋白、多糖等杂质
②低温放置几分钟的作用
可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；
抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；
低温有利于增加DNA的柔韧性，减少其断裂；
取材、研磨
过滤
分离
鉴定
结果观察
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。
(1)搅拌时应轻缓、并沿一个方向
减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子
(2)酒精预冷的作用:
同“低温放置的作用”
取材、研磨
过滤
分离
鉴定
结果观察
取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
加入2mol/L氯化钠溶液
不加入丝状物
加入4ml二苯胺试剂
实验组
对照组
水浴加热
加入2mol/L氯化钠溶液
不加入丝状物
加入4ml二苯胺试剂
现配现用
易被空气氧化，颜色改变
取材、研磨
过滤
分离
鉴定
结果观察
1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？
观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。
本实验粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？
4.结果分析与评价
限制酶
DNA连接酶
载体
①对受体细胞无害；
②有一个至多个限制酶切割位点；
③有特殊的标记基因；
④能自我复制或能整合到宿主DNA上。
质粒、 噬菌体、动植物病毒
基因工程的基本工具
作为载体的条件
种类:
磷酸二酯键
来源：
主要来源于原核生物
特点：
作用部位：
具有专一性
结果：
形成黏性末端或平末端
连接部位：磷酸二酯键
种类：E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶
作用：把两条双链DNA片段拼接起来

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