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(共17张PPT)
情境命题最前沿15
基因编辑技术及其应用
基因编辑技术能对基
因进行定点编辑，其原理是由一条单链向
导引导内切核酸酶 到一
个特定的基因位点进行切割（如图）。
复合体中的 的主要功
能是与靶向基因（目的基因）上特定碱基序列互补，从而定向引导 蛋
白与靶向基因结合，并在特定位点切割 。
基因编辑技术培育转基因生物，与传统的基因工程相
比，其明显优点是可将目的基因定点插入所需位点，避免了因目的基因随
机插入宿主细胞引起的生物安全性问题。 基因编辑技
术在基因治疗、基因水平进行动植物的育种、研究基因的功能等方面有广
阔的应用前景。
1. 是大肠杆菌等细菌在长
期演化过程中形成的一种适应性免疫防
御系统，可用来对抗入侵的部分病毒
及外源 。其原理是由一条单
链向导引导内切核酸酶 到一个
特定的基因位点进行切割。 基因编辑技术是通过设计向导
中20个碱基的识别序列，可以对目标 上几乎任何一个位置进行删
除或添加特定的 片段，如下图所示。下列叙述错误的是( )
A.识别序列形成杂交区的过程与转录过程的碱基配对方式相同
B.在被切割后的目标中添加特定的片段需要 连接酶
C.大肠杆菌等细菌细胞内能合成与入侵病毒及外源互补的
序列
D.能专一性破坏双链分子中碱基之间的氢键来切割 分子
解析：选D。识别序列形成杂交区的过程与转录过程的碱基配对方式相同，
都是、、、，A正确；在被切割后的目标 中添
加特定的片段需要连接酶将 片段连接起来，B正确；大肠杆
菌等细菌细胞内能合成与入侵病毒及外源互补的 序列，C
正确；能特异性的切断目标 的磷酸二酯键，D错误。
√
2.猪瘟病毒能与猪细胞质膜上的
受体蛋白结合，进而侵入细胞
引起猪瘟。利用基因编辑技术改变
受体蛋白基因，使 受体
蛋白不能与猪瘟病毒正常结合，但不影响生理功能，从而培育出抗猪瘟病
毒猪。基因编辑原理是由一条人为设计的单链向导引导
蛋白到特定的 位点进行切割，从而完成对目的基因的编辑。基因编辑
过程如图所示。下列叙述错误的是 ( )
A.培育抗猪瘟病毒猪，一般选择受精卵作为基因编辑的受体细胞，这样获
得的个体的所有细胞都无法被猪瘟病毒感染
B.蛋白的功能是准确识别 特定序列并进行切割
C.改造后的受体细胞经培养发育到囊胚或桑葚胚时，可将其进行冷冻保存
或胚胎移植
D.通过基因编辑技术改造前后的两种 基因是等位基因
√
解析：选B。培育抗猪瘟病毒猪，一般选择受精卵作为基因编辑的受体细
胞，改造后的受精卵开始进行胚胎发育，这样获得的个体的所有细胞都无
法被猪瘟病毒感染，A正确；根据基因编辑的原理和题图所示过程，单链
向导是通过碱基互补配对原则准确地识别并结合到 的特定位点，
从而引导蛋白到达准确位置进行 的切割，B错误；改造后的受体
细胞经培养发育到囊胚或桑葚胚时，可将其进行胚胎移植或冷冻保存，C
正确；通过基因编辑技术改造后的 基因与改造前的基因位置相同，
控制的性状不同，二者是等位基因，D正确。
3.中国科学院遗传与发育生物学研究
所李传友团队提出了一种利用多重基
因编辑技术以红果番茄（双子叶植物）
为材料，快速定向创制七种不同果色
番茄材料的策略。该研究利用多重基
因编辑系统靶向敲除了红果番茄中控制三类色素合成或代谢的关键基因。
下图是科研人员用 基因编辑技术定点敲除目标基因的示意图，
请回答下列问题：
（1） 系统能精准识别相关基因，依据的原理是___________
________________________发生碱基互补配对；蛋白能使目标 中
的____________（填化学键名称）断裂，从而实现对__________
（填“单链”“双链”“单链”或“ 双链”）的剪切。若要插入
其他基因，可以利用__________酶将它们连接起来。
向导与目标（或识别序列）
磷酸二酯键
双链
连接
（2）研究人员将编辑好的基因导入番茄的体细胞，常用的方法是_______
_______。该方法的优点是可以使目的基因进入植物细胞，并___________
_________________________，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。
农杆菌转化法
将其插入植物细胞中的染色体的上
（3）含有编辑好的基因的番茄体细胞具有全能性，在一定的营养和激素
等条件下，可以经过________的过程形成愈伤组织。当培养基中的______
_____________________时，主要诱导根的形成。
脱分化
生长素含量高于细胞分裂素
（4）五彩缤纷的水果和蔬菜不仅给人以美的视觉享受，还能提高消费者
的购买欲。在培育彩色番茄的同时我们还需要考虑该策略对番茄的
______________________________________（答出2点即可）等性状的影响。
单果重、单株产量、维生素C含量
4.是一种高效的基因编辑技术， 基
因表达的 蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导
引导下，切割 双链以敲除目标基因或
插入新的基因。 基因编辑技术的工作原
理如图所示。
回答下列问题。
（1）过程①中，为构建重组质粒，需对含有特定 编
码序列的 进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，
插入时所需要的酶是____________。
连接酶
解析：基因工程所需的工具酶有限制酶和 连接酶，限制酶负责切割，
连接酶负责连接，因此插入时所需要的酶是 连接酶。
（2）过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是____________。
处理法
解析：大肠杆菌是原核生物，属于微生物，将目的基因导入微生物细胞之
前需要用处理细胞，细胞质膜对 的通透性会发生改变，细胞变得
容易接受外来的 。
（3）过程③~⑤中，与蛋白形成复合体,该复合体中的
可识别并与目标 序列特异性结合,二者结合所遵循的原则是__________
________。随后， 蛋白可切割______________________序列。
碱基互补配对原则
目标特定的核苷酸
解析：根据题图可知，在基因编辑技术中， 是根据靶
基因设计的向导，准确引导蛋白切割与配对的靶基因
序列。蛋白能借助分子与目标 进行特异性结合的原因在于
分子上的碱基序列与目标 分子上的碱基序列可以通过碱基互补
配对原则，实现与目标 特定序列的特定识别，进而定位；由此
可见，蛋白在功能上属于限制酶，可切割目标 特定的核苷酸序列。
（4）某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因
插入到 质粒中获得重组质粒，随后将其导入到大肠杆菌细
胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组 中，构建得到能大量
分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述 重组质粒在受体细胞内，
将该蛋白酶基因插入到基因组 的编辑过程：
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
_______________________________________________ 。
重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物
是，表达的产物是 蛋白，二者形成复合体，该复合体中的
可识别并与目标序列特异性结合，引导 蛋白切割目标
序列，从而将该蛋白酶基因插入到基因组 中
解析：根据图示可知， 重组质粒在受体细胞内进行转录和
表达，转录的产物是，表达的产物是 蛋白，二者形成复合体，
该复合体中的可识别并与目标序列特异性结合，引导 蛋
白切割目标序列，从而将该蛋白酶基因插入到基因组 中。(共20张PPT)
情境命题最前沿16 PCR的应用
1.实时荧光定量技术检测病毒核酸
病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光鉴定。实时荧光扩增目
的基因，需额外添加荧光标记探针（一小段单链，可与目的基因中部
序列特异性结合）。当探针完整时，不产生荧光。在过程中，与目的
基因结合的探针被耐高温的聚合酶水解，与分离后，发出的荧光
可被检测到（如图甲），通过实时荧光检测某冠状病毒感染时，检测
到的荧光强度变化如图乙，荧光到达预先设定阈值的循环数（值）越小，
说明病毒核酸浓度越高。
2.定点突变——重叠延伸技术
重叠延伸 技术的主要设计思路是用具有互补配对片段的引物（图中的
引物2和3，突起处代表与模板链不能互补的突变位点），分别进行 ，
获得有重叠链的两种 片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的
延伸获得想要的目的基因。如某科研团队运用重叠延伸 技术在水蛭素
基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺（密码子为
、）替换为赖氨酸（密码子为、 ），从而提高水蛭素的
抗凝血活性。原理如下图所示。
3.定点突变——大引物技术
大引物需要用到三条引物进行两轮 ，这三条引物分
别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。第一
轮 利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到
不完整的含有突变位点的片段；第二轮 利用第一
轮扩增产物中的一条 链作为下游大引物，它与常规上
游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的 片段。原
理如下图所示。
当 的某些序列已知，而需要扩增已知序列
两端的未知序列时，可采用反向 技术。原
理是用限制酶消化该，随后使用 连接
酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知
序列两侧携带有未知序列的环状 分子。以
该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性
引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增
出未知序列。原理如下图所示。
4.反向扩增已知序列两侧的未知序列
5.巢式
首先将目标的 模板与第一套引物（外引物）结合。第一套引物也可能
结合到其他具有相似结合位点的片段上并扩增多种产物。但只有一种产物
是目的片段（图中未显示可能的多种产物）。然后使用第二套引物（内引
物）对第一轮扩增的产物进行第二轮 扩增。由于第二套引物位于
第一轮 产物内部，而非目的片段包含两套引物结合位点的可能性极小，
因此第二套引物不可能扩增非目的片段。这种巢式扩增确保第二轮
产物几乎或者完全没有引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污
染。原理如下图所示。
1.荧光定量技术可定量检测样本中某种 的
含量，其原理是在 体系中每加入一对引物的
同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针，当
耐高温的 聚合酶催化子链延伸至探针处，会
水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即
每扩增一次，就有一个荧光分子生成。下列叙述错误的是( )
A.引物与探针均具有特异性，与模板结合时遵循碱基互补配对原则
B.反应最终的荧光强度与起始状态模板 含量呈负相关
C.耐高温的聚合酶催化合成的方向总是从子链的端到 端
D.若用上述技术检测某基因的转录水平，则需要用到逆转录酶
√
解析：选B。引物与探针均具有特异性，与模板结合时遵循碱基互补配对
原则，A正确；模板含量越高， 扩增过程中形成的荧光分子越多，
荧光强度越大，即反应最终的荧光强度与起始状态模板 含量呈正相关，
B错误；耐高温的聚合酶催化合成的方向总是从子链的端到
端，C正确；若要用荧光定量 技术检测某基因的转录水平，即检测细
胞中的含量，则先要将逆转录形成 再检测，故需要用到
逆转录酶，D正确。
2.大引物 定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的
功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮 即可获
得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作第二轮
扩增的大引物，右图表示利用大引物对基因 进
行定点诱变。下列说法错误的是( )
B
A.第一轮 中，至少需要2个循环才能获得相应的大引物
B.第二轮所用的引物是第一轮的产物 的两条链
C.扩增的定点诱变产物通常需具备启动子、终止子等结构才能进行转录和
翻译
D.为了使两轮 在同一支试管中进行，设计引物时应考虑不同的退火温度
解析：选B。第一轮 中，需要先合成一条链（即诱变引物延伸的子
链），再用这条链合成互补链，至少需要2个循环才能获得相应的大引物，
A正确；第一轮产物的一条链作第二轮 扩增的大引物，第二轮
仍需加入的另一种引物是侧翼引物，B错误；若要使目的基因可以表
达出蛋白质，则 扩增的定点诱变产物上需具备启动子和终止子等结构，
诱导基因转录和翻译，C正确；为了使两轮 反应在同一支试管中进行，
设计引物时应考虑不同的退火温度，第二轮 的退火温度应该比第一轮
高，D正确。
3.为减少引物与模板之间的非特异性配对，人们对普通
技术进行了改良，发明了巢式 技术，其原理是
利用两套引物进行两轮 扩增。首先利用第一对引物
（外引物）对目的基因所在的进行第一轮扩增（经过 次循
环），第二轮扩增以第一轮扩增产物为模板，利用第二对引物（内引物或
巢式引物）结合在第一轮扩增产物内部，经过 次循环，获得第二
轮扩增片段（即目的基因），最终第二轮扩增片段短于第一轮，基本过程
如下图所示。下列叙述错误的是 ( )
A.两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链 片段
B.使用外引物至少经过3次循环，才能得到图示的第一轮扩增产物
C.若第一轮扩增产生错误片段，则其进入第二轮扩增的概率极低
D.与巢式相比，普通 特异性更强，错误率更高
√
解析：选D。两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链 片段，以便
与模板互补配对，A正确；根据半保留复制的特点，可知 前2次循
环产生的四个分子的两条链均不等长，第3次循环产生的 分子存
在等长的两条核苷酸链，即仅含引物之间的序列，因此，至少经过3次循
环才能得到图示的第一轮扩增产物，B正确；由于内引物扩增模板是外引
物扩增后的产物，第二轮反应能否进行，也是对第一轮反应正确性的鉴定，
如果第一轮扩增产生了错误片段，那么第二轮能在错误片段上进行引物配
对并扩增的概率极低，C正确；巢式中加入的组分与常规 相同，
第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行
第二轮扩增，从而提高反应的特异性，获得的产物特异性更强，D错误。
4.在利用 技术扩增目的基因时，通常
在引物一端添加限制酶切割位点，以便
将目的基因连接到载体上。如图所示，
克隆法可以将 产物直接连接到具
有 突出末端的载体上，这是因为普
通 聚合酶具有末端连接酶的活
性，可在每个扩增产物的 端自动添加一个碱基，通常为A，这样扩
增产物就可以与有突出末端的载体连接。高保真 聚合酶可
切掉 扩增过程中产生的错配碱基，保证扩增的准确性。
（1） 依据的原理是________________，该技术通常需要2种引物，引
物的具体作用是________________________________________________。
半保留复制
使聚合酶能够从引物的端开始连接脱氧核苷酸
解析：依据的原理是半保留复制； 需要引物，引物的具体作
用是使聚合酶能够从引物的 端开始连接脱氧核苷酸。
（2）一般情况下，利用 扩增目的基因时，通常在引物的___端添加特
定限制酶识别序列。基因工程中使用的载体除质粒外，还有________、
__________________________等。题述构建重组质粒的方法________
（填“需要”或“不需要”）限制酶，______ （填“需要”或“不需要”）
连接酶，原因是__________________________________________________
__________________________________________。
噬菌体
动植物病毒（顺序可颠倒）
不需要
需要
扩增产物的端有一个碱基A，载体有突出末端，二者可以在连接酶的作用下直接连接
解析：扩增目的基因时在 端开始添加脱氧核苷酸，所以通常在引物
的 端添加特定限制酶识别序列。基因工程中使用的载体除质粒外，还有
噬菌体和动植物病毒等。依据题意，普通 聚合酶具有末端连接酶
的活性，可在每个扩增产物的 端自动添加一个碱基，通常为A，这
样扩增产物就可以与有突出末端的载体在 连接酶的作用下直接
连接，所以利用克隆法构建重组质粒不需要限制酶，需要 连接酶。
（3）高保真聚合酶不会使扩增产物产生A尾，高保真 扩
增后，如何加工才能进行 克隆 ___________________________________
______________________________________________。
先进行产物回收，将其作为模板，再加入、普通聚合酶等延伸一段时间
解析：高保真聚合酶不会使 产物产生A尾，可利用普通
聚合酶添加A尾，同时要添加 、缓冲液等，然后在适宜温
度下延伸一段时间。

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